专利名称：FAT10基因siRNA重组模拟病毒及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种模拟病毒，特别涉及FATlO基因siRNA重组模拟病毒，还涉及该模 拟病毒的制备方法和应用。
背景技术：
肝癌是常见的恶性肿瘤，位居恶性肿瘤发病率的第5位，其确切发病机制尚未完 全明了。如何阻断慢性肝脏疾病向肝癌的恶性转化，或在肝癌早期加以干预，成为进一步提 高肝癌治疗效果的关键。FATlO又被称为双泛素(diubiquitin)，属于泛素蛋白家族中的泛素样修饰蛋白 (UBLs)，是一个分子量为ISkDa的包含165个氨基酸残基的蛋白质，由两个泛素样结构域融 合而成。FATlO在细胞周期的调控中起到十分重要的作用，已被证明能与人纺锤体聚集检测 点蛋白(mitotic arrest deficiency 2,MAD2)非共价结合。MAD2负责在有丝分裂时保持 纺锤体的完整性，其功能受到抑制将导致染色体不分离或染色体不稳定，这是许多肿瘤发 生的重要特征。已有研究发现，FATlO在肝癌、宫颈癌、卵巢癌、直肠癌、胰腺癌及小肠腺癌 等恶性肿瘤中表达均明显上调，表明FATlO在恶性肿瘤的发生中起到一定作用。因此，抑制 FATlO的过度表达，可能是调控肝癌基因表达的新途径。RNA干扰(RNA interference, RNAi)是指内源性或外源性双链 RNA(doublestranded RNA, dsRNA)引发生物体内同源mRNA降解从而表现出的基因转录后 沉默现象，现已成为分子生物学家分析基因组功能和基因治疗的一个有力工具。小干扰 RNA(small interference RNA, siRNA)是RNAi的效应分子，是一类长21 23个核苷酸 的双链RNA，在体内可特异性降解与其序列互补的mRNA而引发基因沉默。文献(刘天德 等.siRNA对肝癌细胞异常表达FATlO基因的抑制效应研究.新医学，2009，40 (6) 358)报 道了 FATlO基因siRNA可以抑制人肝癌细胞株H印3B中FATlO基因的表达，并抑制Hep3B 细胞的生长。但该文献使用的是体外合成的siRNA，而siRNA在体内易被核酸酶降解，稳定 性较差，产生的RNAi干扰效应时间短，不适用于长期基因沉默。最好是借助表达质粒或病 毒载体等在细胞内持续产生siRNA，例如将编码短发卡RNA(short hairpin RNA, shRNA)的 模板DNA序列插入载体启动子后构建重组表达载体，所得重组表达载体导入体内后持续转 录出shRNA，shRNA再被体内RNaseIII家族的内切核酸酶Dicer剪切成siRNA，从而达到长 期抑制靶基因表达的目的。虽然病毒载体介导的RNAi近年来受到人们重点关注，利用病毒 载体可以解决质粒转染效率低、效果不稳定且某些类型细胞不能转染等问题，但其也存在 诸如免疫原性和病毒性重组等安全性问题，以及制备过程复杂、容量有限、制得的病毒滴度 较低等缺陷。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种FATlO基因siRNA重组模拟病毒，可 以靶向肝癌细胞并使FATlO基因siRNA局限在肝癌细胞中表达，特异性导致肝癌细胞中的
3FATlO基因表达沉默，避免损伤无关细胞。为达到上述目的，本发明的FATlO基因SiRNA重组模拟病毒为融合多肽与FATlO 基因siRNA重组表达载体的复合物；所述融合多肽由RGD肽与穿膜肽HIV-Tat49-57连接而 成；所述FATlO基因siRNA重组表达载体通过甲胎蛋白(AFP)启动子控制FATlO基因siRNA 的表达。进一步，所述融合多肽的氨基酸序列如SEQ ID No. 7所示；进一步，所述FATlO基因siRNA的核苷酸序列为正义链如SEQ ID No. 1所示，反 义链如SEQ ID No. 2所示；进一步，所述FATlO基因siRNA重组表达载体是将核苷酸序列分别如SEQID No. 3 和SEQ ID No. 4所示的2条模板DNA单链经退火处理后插入pSilencerl. 0-U6载体的启动 子之后而得到；所述pSilencer 1. 0-U6载体中的U6启动子被AFP启动子所替换。RGD肽是一类含有Arg-Gly-Asp (RGD)序列的小肽，广泛存在于多种生物体内及同 一种生物体的各种组织中。作为一种重要的细胞识别位点与信号启动分子，RGD肽在许多 生命活动中发挥着重要的调节作用。目前研究较多的是关于RGD肽通过其所含的RGD序列 竞争结合到细胞表面的整合素受体上从而产生抗血小板凝聚、抗肿瘤迁移以及抗肿瘤血管 生成作用等方面。研究证实整合素家族中α β 3与细胞粘附和新生血管形成的关系最为 密切，其配体R⑶肽对肿瘤新生血管内皮细胞的粘附和迁移有明显抑制作用，且可诱导肿 瘤细胞中caspase-3和caspase-7表达增高，从而促进肿瘤细胞的凋亡。本发明将RGD肽 与阳离子穿膜肽HIV-Tat49-57连接构成富含正电荷的融合多肽，利用正负电荷吸引原理， 该富含正电荷的融合多肽可以包装富含负电荷的FATlO基因siRNA重组表达载体，形成小 而均勻的颗粒性肽-DNA复合物。这种颗粒模拟了天然病毒的结构，故称其为模拟病毒。本 发明的融合多肽具有穿膜肽HIV-Tat49-57的穿膜活性，易于被抗原递呈细胞摄取，体内转 染效率高；同时，通过RGD肽与肝癌细胞及新生血管内皮细胞表面整合素受体的特异性结 合，可以引导模拟病毒靶向定位到肝癌细胞，达到杀伤肝癌细胞而不损害正常细胞的治疗 目的，大大提高肝癌基因治疗的安全性和有效性，此外RGD肽本身也具有抗肿瘤迁移和抗 肿瘤血管生成的作用，并能诱导肿瘤细胞的凋亡。以本发明的融合多肽为核酸载体，还具有 无蓄积危害性和传染性，核酸容量无限制，制备方法简便等优点。本发明的RGD肽序列优选 为RGDRGDRGD，即将三个RGD序列串联，其能够有效提高RGD肽的靶向能力。 目的基因的靶向性表达对肝癌的治疗极其重要。AFP是一种大分子糖蛋白，主要由 胎儿肝细胞和卵黄囊产生。当胎儿出生后，AFP的合成逐渐停止，但当肝细胞发生癌变时， 这种胚胎抗原的基因被激活，可重新产生大量的AFP。研究发现，约60% 70%的肝癌患者 血清AFP水平升高。因此，AFP启动子具有肝癌细胞特异性，可启动外源基因在肝癌细胞中 的特异性表达。在本发明中，以AFP启动子调控FATlO基因siRNA的表达，可使FATlO基因 siRNA局限在肝癌细胞中表达，特异性导致肝癌细胞中的FATlO基因表达沉默，从而实现了 基因治疗的靶向性，避免了对其它器官的不良反应。本发明的目的之二在于提供所述FATlO基因siRNA重组模拟病毒的制备方法，操 作简便，耗时少。为达到此目的，本发明所述FATlO基因siRNA重组模拟病毒的制备方法，包括以下 步骤
a、采用化学合成法合成氨基酸序列如SEQ ID No. 7所示的融合多肽；b、构建FATlO基因siRNA重组表达载体以人肝癌细胞株H印G2的基因组DNA为 模板，采用核苷酸序列分别如SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 6所示的上、下游引物通过PCR扩 增获得AFP启动子片段，经限制性内切酶KpnI和ApaI双酶切后，与同样经KpnI和ApaI双 酶切去除U6启动子的pSilencer 1. 0-U6载体连接，获得重组载体PSiAFP ；将核苷酸序列 分别如SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示的2条模板DNA单链进行退火处理，获得双链DNA 插入片段，经限制性内切酶ApaI和EcoRI双酶切后，与同样经ApaI和EcoRI双酶切的重组 载体pSiAFP连接，获得FATlO基因siRNA重组表达载体pSiAFP/FATIO ；c、制备FATlO基因siRNA重组模拟病毒于室温、涡旋条件下，向含有氯化钠和步 骤b所得FATlO基因siRNA重组表达载体pSiAFP/FATIO的溶液中，缓慢滴加步骤a所得融 合多肽溶液，滴加完毕后，室温继续涡旋25 35分钟，再静置25 35分钟，即得FATlO基 因siRNA重组模拟病毒。本发明的目的之三在于提供所述FATlO基因siRNA重组模拟病毒的应用。为达到此目的，本发明提供了所述FATlO基因siRNA重组模拟病毒在制备抗肝癌 药物中的应用。体外实验结果证实，本发明的FATlO基因siRNA重组模拟病毒可以有效降低肝癌 细胞H印G2中FATlOmRNA和FATlO蛋白的表达水平，能够引起H印G2细胞G1/S期阻滞，能 够诱导肝癌细胞IfepG2的凋亡而对正常细胞C0S-7无影响。体内实验结果证实，本发明的 FATlO基因siRNA重组模拟病毒能够有效抑制肿瘤的生长，能够延长荷瘤裸鼠的平均生存 期并提高平均生存率。因此，本发明的FATlO基因siRNA重组模拟病毒可以用于制备抗肝 癌药物。本发明的有益效果在于本发明的FATlO基因siRNA重组模拟病毒可以靶向肝癌 细胞并使FATlO基因siRNA局限在肝癌细胞中表达，特异性导致肝癌细胞中的FATlO基因 表达沉默，避免损伤无关细胞，同时，还具有转染效率高、制备方法简单省时等优点，可用于 制备抗肝癌药物，在肝癌基因治疗领域有着良好的开发应用前景。
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进 一步的详细描述，其中图1为琼脂糖凝胶电泳鉴定AFP启动子片段的PCR扩增产物；图2为透射电镜分析FATlO基因siRNA重组模拟病毒；图3为实时定量RT-PCR法检测FATlOmRNA表达水平；图4为Western blot法检测FATlO蛋白表达水平；图5为MTT法检测细胞存活率；图6为细胞凋亡率的检测；图7为细胞周期的检测；图8为两组小鼠的肿瘤生长曲线；图9为两组小鼠的生存率比较。
具体实施例方式
以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明 具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克 等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。一、FATlO基因SiRNA重组模拟病毒的制备与鉴定1、FATlO基因siRNA重组表达载体的构建(1) shRNA转录模板DNA的合成根据文献(刘天德等.siRNA对肝癌细胞异常表达FATlO基因的抑制效应研究.新 医学，2009，40 (6) 358)报道的 FATlO 基因 siRNA 序列正义链5' -gcuc-aguggcacaagug aatt-3' (SEQ ID No. 1)；反义链5' -uucacuugugccacugagctg-3' (SEQ IDNo. 2)；设计 shRNA DNA HI 2 条1:5' —cgctcagtggcacaagtgaattc—aagagattcacttgtg ccactgagcttttttg-3' (SEQ ID No. 3) ；lit2 5' —aattcaaaaaagctcagtggc—acaagtgaatc tcttgaattcacttgtgccactgagcgggcc-3' (SEQ ID No. 4)；委托上海吉凯公司合成。(2) AFP启动子片段的PCR扩增利用Primer5在线软件设计AFP启动子片段的PCR扩增引物，其中上游引物序列 为5 ‘ -gcggtaccattctgtagtttgaggag-3 ‘ (SEQ ID No. 5)，下划线部分为 KpnI 酶切位 点；下游引物序列为5' -atgggcccattggcagtggt ggaa-3' (SEQ ID No. 6)，下划线部分 为ApaI酶切位点；预期扩增片段大小为292bp。以!fepG2细胞的基因组DNA为模板，建立 50 μ 1标准PCR反应体系，PCR反应参数为94°C预变性5分钟，然后94°C变性1分钟、60°C 退火1分钟、72 °C延伸1分钟，共35个循环，最后72°C延伸5分钟。PCR产物经质量分数为 1.5%的琼脂糖凝胶电泳鉴定(图1)、凝胶回收试剂盒切胶回收纯化后，与PMD18-T载体连 接，连接产物转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，用含有氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆， 次日挑取阳性克隆，小量扩增后提取质粒，送上海博亚生物技术有限公司测序验证，将阳性 克隆质粒命名为PMD18-T/AFP。(3) FAT10基因siRNA重组表达载体的构建用限制性内切酶KpnI和ApaI自质粒pMD18_T/AFP中双酶切出AFP启动子片段， 再与同样经KpnI和ApaI双酶切去除U6启动子的pSilencer 1. 0-U6载体连接，连接产物 转化大肠杆菌DH5ci感受态细胞，用含有氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆，次日挑取阳 性克隆，小量扩增后提取质粒，送上海博亚生物技术有限公司测序验证后，将阳性克隆质粒 命名为pSiAFP。将2条shRNA转录模板DNA单链进行退火处理，得到双链DNA插入片段，经限制性 内切酶ApaI和EcoRI双酶切后，再与同样经ApaI和EcoRI双酶切的质粒pSiAFP连接，连 接产物转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，用含有氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆，次日 挑取阳性克隆，小量扩增后提取质粒，送上海博亚生物技术有限公司测序验证后，将阳性克 隆质粒命名为pSiAFP/FATIO，即获得FAT10基因siRNA重组表达载体。2、融合多肽的合成设计融合多肽的氨基酸序列为:RGDRGDRGDRKKRRQRRR(SEQ ID No. 7)，其中N端下 划线部分为R⑶肽，C端斜体部分为穿膜肽HIV-Tat49-57。委托上海生工生物工程技术服 务公司采用固相合成法进行合成融合多肽，合成方案采用标准Fmoc方案，即由去保护和激活交联两个反应反复循环直至合成目的多肽，获得的目的多肽粗品用高效液相色谱法进行 纯化，纯化后的目的多肽经反相高效液相色谱法鉴定纯度为98. 5%，经质谱法鉴定分子量 与理论值一致，最后冷冻干燥，温度_70°C保存备用。3、FATlO基因siRNA重组模拟病毒的制备及鉴定于室温、涡旋条件下，向100 μ 1含有浓度为lmg/ml的NaCl和浓度为500 μ g/ml 的质粒pSiAFP/FATIO的溶液中，以5 μ 1/min的速度滴加100 μ 1浓度为1000 μ g/ml的融 合多肽溶液，滴加完毕后，室温下继续涡旋30分钟，再静置30分钟，即得FATlO基因siRNA 重组模拟病毒悬液。将新鲜制备的FATlO基因siRNA重组模拟病毒悬液滴于200目铜网上，吸附3分 钟，用吸水纸吸干表面液体，晾干30秒，再用质量体积分数为1 %的醋酸铀溶液负染30秒， 用吸水纸吸干表面液体，晾干30秒，置SOkV透射电镜下观察形态。结果如图2所示，FATlO 基因siRNA重组模拟病毒呈大小均一的近圆形颗粒，绝大多数颗粒长径小于20nm。二、FATlO基因siRNA重组模拟病毒的效应检测1、实时定量RT-PCR法检测FATlOmRNA表达水平将H印G2细胞接种于96孔板，培养24小时后，加入FATlO基因siRNA重组 模拟病毒悬液100μ 1感染细胞，同时设置对照组(加入PBS ΙΟΟμΙ)，感染2天后， 收集细胞，采用Trizol法抽提细胞总RNA。取细胞总RNA 1 μ g反转录制备cDNA， 再分别以如下 2 对特异性引物FAT10-F 5 ‘ -caatgcttcctgcctctgtg-3 ‘ (SEQ ID No.8), FAT10-R 5 ‘ -tgcctctttgcctcatcacc-3 ‘ (SEQ ID No. 9)； GAPDH-F 5 ‘ -tcccatcaccatcttc-cag-3 ‘ (SEQ ID No. 10), GAPDH-R 下游为 5' -aggagtgggtgtcgctg-3 ‘ (SEQ ID No. 11)，在 Bio-Rad iCycler 仪上进行实时定量 PCR, PCR反应条件为95 °C预变性1分钟，然后95 °C变性45秒、57 °C退火45秒、72 °C延伸45 秒，共进行30个循环。以GAPDHmRNA的表达为内参照，计算FATlOmRNA的相对表达量。实 验重复三次，每次做三个复孔。结果如图3所示，本发明构建的FAT10基因siRNA重组模拟 病毒能够有效降低ifepG2细胞的FATlOmRNA表达水平，而对照组无此作用。2、Western blot法检测FAT10蛋白表达水平将H印G2细胞接种于96孔板，培养24小时后，加入FAT10基因siRNA重组模拟病 毒悬液100 μ 1感染细胞，同时设置对照组(加入PBS 100 μ 1)，感染2天后，收集细胞，用 PBS洗涤并重悬，超声裂解细胞，离心取上清液，采用质量分数为5 %的浓缩胶、质量分数为 12. 5%的分离胶进行SDS-PAGE电泳，电泳完毕后电转印PVDF膜，用脱脂奶封闭1小时后， 加入兔抗人FAT10多克隆抗体，37°C孵育1小时，PBST洗膜后，再加入羊抗兔IgG，37°C孵育 1小时，PBST洗膜后，再加入发光底物，37°C孵育1分钟，暗室中用X光片曝光，显影，定影， 观察FAT10蛋白表达水平。结果如图4所示，本发明构建的FAT10基因siRNA重组模拟病 毒能够有效降低ifepG2细胞的FAT10蛋白表达水平，而对照组无此作用。3、MTT法检测细胞存活率分别将H印G2细胞和美洲绿猴肾细胞C0S-7接种于96孔板，培养24小时后， 加入FAT10基因siRNA重组模拟病毒悬液100 μ 1感染细胞，同时设置对照组(加入PBS 100 μ 1)，感染2天后，每孔加入浓度为50mg/ml的MTT (用PBS配制)20 μ 1，37 °C培养4 小时，弃去含MTT的培养液，加入酸化异丙醇100 μ 1，待充分溶解后，在酶标仪上测定波长595nm处的吸光度A值，按下述公式计算细胞存活率细胞存活率=A#s/A· X100%。结 果如图5所示，经本发明的FATlO基因siRNA重组模拟病毒处理的肿瘤细胞IfepG2的存活 率明显下降，平均存活率为28% ；而经该模拟病毒处理的正常细胞C0S-7的存活率未见明 显变化，平均存活率为86%。4、细胞凋亡率的检测分别将H印G2细胞和C0S-7细胞接种于96孔板，培养24小时后，加入FATlO基因 siRNA重组模拟病毒悬液100 μ 1感染细胞，同时设置对照组(加入PBS100 μ 1)，感染2天 后，用PBS洗涤并重悬，再加入浓度为250 μ g/ml的FITC标记Armexin V 5μ1和浓度为 250 μ g/ml的PI 5μ 1，冰浴避光孵育10分钟，PBS洗涤后，用FACS Calibur流式细胞仪检 测细胞凋亡情况。结果如图6所示，经本发明的FATlO基因siRNA重组模拟病毒处理的肿瘤 细胞H印G2的凋亡率明显增加，平均凋亡率为28%;而经该模拟病毒处理的正常细胞C0S-7 的凋亡率未见明显变化，平均凋亡率为6%。5、细胞周期的检测分别将H印G2细胞和C0S-7细胞接种于96孔板，培养24小时后，加入FATlO基因 siRNA重组模拟病毒悬液100 μ 1感染细胞，同时设置对照组(加入PBS 100 μ 1)，感染2天 后，用PBS洗涤，加入70%乙醇于4°C固定3小时，PBS洗涤2次，再加入终浓度为50mg/l的 RNaSe，37°C消化30分钟，再加入终浓度为50mg/L的PI，4°C避光染色30分钟，用流式细胞 仪检测，细胞周期分析采用美国Becton Diekinson公司的CellQuit Plot分析软件。结果 如图7所示，HepG2细胞在转染本发明构建的FATlO基因siRNA重组模拟病毒后，G0/G1期 细胞比例(68. 3% )明显高于对照组(42. 02% ), S期细胞比例(19. 45% )明显低于对照 组(25. 19% ), G0/G1期比例增加，S期和G2M期比例下降，并有凋亡现象产生，说明本发明 的FATlO基因siRNA重组模拟病毒能引起H印G2细胞G1/S期阻滞，而经该模拟病毒处理的 正常细胞C0S-7未出现明显的细胞周期阻滞现象。6、体内抗肿瘤作用将1 X IO5个HepG2细胞接种于裸鼠皮下建立荷瘤裸鼠，将荷瘤裸鼠随机分为对照 组和实验组，对照组尾静脉注射PBS，实验组尾静脉注射本发明的FATlO基因siRNA重组模 拟病毒，观察60天内两组小鼠的生存率和肿瘤体积，绘制肿瘤生长曲线。两组小鼠的肿瘤 生长曲线如图8所示，可见第30天时，对照组小鼠肿瘤体积达到5000mm3，而实验组小鼠肿 瘤生长缓慢，肿瘤体积仅为2000mm3。两组小鼠的生存率比较如图9所示，对照组小鼠于30 天内全部死亡，而实验组小鼠60天的生存率为50%，说明本发明的FATlO基因siRNA重组 模拟病毒能够有效抑制肿瘤的生长，能够延长荷瘤裸鼠的平均生存期并提高平均生存率。当然，本发明中的FAT10基因s iRNA除了上述实施例中所用s iRNA之外，还可以是 其它FATlO基因siRNA，例如文献(刘天德等.siRNA对肝癌细胞异常表达FATlO基因的抑 制效应研究.新医学，2009，40 (6) 358)中报道的其它3个siRNA序列，都可以实现本发明 目的。最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参 照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可 以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明 的精神和范围。
权利要求
FAT10基因siRNA重组模拟病毒，其特征在于该模拟病毒为融合多肽与FAT10基因siRNA重组表达载体的复合物；所述融合多肽由RGD肽与穿膜肽HIV Tat49 57连接而成；所述FAT10基因siRNA重组表达载体通过甲胎蛋白启动子控制FAT10基因siRNA的表达。
2.根据权利要求1所述的FATlO基因siRNA重组模拟病毒，其特征在于所述融合多 肽的氨基酸序列如SEQ ID No. 7所示。
3.根据权利要求1或2所述的FATlO基因siRNA重组模拟病毒，其特征在于所述 FATlO基因siRNA的核苷酸序列为正义链如SEQ ID No. 1所示，反义链如SEQ ID No. 2所不。
4.根据权利要求3所述的FATlO基因siRNA重组模拟病毒，其特征在于所述FATlO基 因siRNA重组表达载体是将核苷酸序列分别如SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示的2条模板 DNA单链经退火处理后插入pSiIencer 1. 0-U6载体的启动子之后而得到；所述pSiIencer 1. 0-U6载体中的U6启动子被甲胎蛋白启动子所替换。
5.权利要求1所述的FATlO基因siRNA重组模拟病毒的制备方法，其特征在于a、采用化学合成法合成氨基酸序列如SEQID No. 7所示的融合多肽；b、构建FATlO基因siRNA重组表达载体以人肝癌细胞株H印G2的基因组DNA为模板， 采用核苷酸序列分别如SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 6所示的上、下游引物通过PCR扩增获 得甲胎蛋白启动子片段，经限制性内切酶KpnI和ApaI双酶切后，与同样经KpnI和ApaI双 酶切去除U6启动子的pSilencer 1. 0-U6载体连接，获得重组载体PSiAFP ；将核苷酸序列 分别如SEQ ID No. 3和SEQ IDNo. 4所示的2条模板DNA单链进行退火处理，获得双链DNA 插入片段，经限制性内切酶ApaI和EcoRI双酶切后，与同样经ApaI和EcoRI双酶切的重组 载体pSiAFP连接，获得FATlO基因siRNA重组表达载体pSiAFP/FATIO ；C、制备FATlO基因siRNA重组模拟病毒于室温、涡旋条件下，向含有氯化钠和步骤b 所得FATlO基因siRNA重组表达载体pSiAFP/FATIO的溶液中缓慢滴加步骤a所得融合多 肽溶液，滴加完毕后，室温继续涡旋25 35分钟，再静置25 35分钟，即得FATlO基因 siRNA重组模拟病毒。
6.权利要求1所述的FATlO基因siRNA重组模拟病毒在制备抗肝癌药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种模拟病毒，特别涉及FAT10基因siRNA重组模拟病毒及其制备方法和应用，该模拟病毒为融合多肽与FAT10基因siRNA重组表达载体的复合物，其中融合多肽由RGD肽与穿膜肽HIV-Tat49-57连接而成，FAT10基因siRNA重组表达载体通过甲胎蛋白启动子控制FAT10基因siRNA的表达；该模拟病毒可以靶向肝癌细胞并使FAT10基因siRNA局限在肝癌细胞中表达，特异性导致肝癌细胞中的FAT10基因表达沉默，避免损伤无关细胞，同时还具有转染效率高、制备方法简单省时等优点，可用于制备抗肝癌药物，在肝癌基因治疗领域有着良好的开发应用前景。
文档编号C12N15/63GK101948544SQ20101027216
公开日2011年1月19日 申请日期2010年9月3日 优先权日2010年9月3日
发明者吴玉章, 杨曌 申请人:中国人民解放军第三军医大学