专利名称：产生生淀粉酶的青霉菌及其制备的生淀粉酶制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种产生生淀粉酶的青霉菌及其制备的生淀粉酶制剂，具体涉及一株 产生生淀粉酶的青霉菌、用该菌株制备的液态生淀粉酶制剂以及该制剂在生木薯淀粉同步 糖化发酵生产酒精中的应用。
背景技术：
淀粉是地球上植物存储最丰富的多糖物质。在食品工业中，它是一种经济的原 料，可用来生产葡萄糖、麦芽糖、果葡糖浆等甜味剂，也用来生产抗生素、氨基酸、酒精和有 机食用酸等。酒精脱水后变成无水酒精，无水酒精经变性处理变成燃料酒精，燃料酒精已 在世界多个国家使用，对缓减世界能源危机、改善环境、促进农业可持续发展等具有重要意 SL (Sanchez 0J,Cardona CA. Trends in biotechnologicalproduction of fuel ethanol from different feedstocks. Bioresource Technology2008，99 :5270_5295)。以淀粉为原料的传统酒精生产工艺中，原料必须先经过约90-110°C的高温蒸煮， 加入耐高温α -淀粉酶将糊化原料中的长链淀粉切断成短链糊精，使得醪液粘度降低，这 是淀粉的糊化和液化过程；短链糊精还不能为酵母菌所利用，需要将液化后的原料降温至 60°C左右，加入糖化酶将短链糊精降解成葡萄糖，这是糖化过程；最后葡萄糖经酵母发酵 产生酒精。或者是将原料进行糊化和液化后，降至30°C左右，同时加入糖化酶和酵母菌， 同步糖化发酵产生酒精(梁于朝，李开绵，木薯酒精发酵研究进展，广西轻工业，2007,98 16-18)。目前以木薯淀粉和玉米淀粉为原料生产燃料酒精时是用上述酒精生产工艺。由于 原材料价格高和传统酒精生产工艺中的高温蒸煮(糊化和液化)是一个十分耗能的过程， 大概需要消耗整个酒精生产过程所需能源的35% (王晨霞，杜风光，里根德，淀粉原料生料 发酵法生产酒精概述，粮食与油脂，2008，6 :11-13)。燃料酒精生产成本高，无市场竞争力， 生产企业还需政府补贴才能生存，因此，降低燃料酒精的生产成本非常必要。生淀粉酶指的是一种复合酶，能直接有效作用于未经蒸煮或处理的原始状态的生 料淀粉颗粒，一般包括 α -淀粉酶(α -1,4-D-Glucanohydrolase ；EC 3. 2. 1. 1)，β -淀粉 酶(β -amylase ；EC 3. 2. 1. 2)和葡萄糖淀粉酶(Glucoamylase ；EC 3. 2. 1. 3)等。α -淀粉 酶随机切割淀粉分子内部的α-1，4糖苷键，生成短链糊精；β-淀粉酶从淀粉分子的非还 原性末端水解淀粉分子相间隔的α-1，4糖苷键，产物是麦芽糖，不能水解α_1，6糖苷键， 作用于支链淀粉时产物还有极限糊精。葡萄糖淀粉酶俗称糖化酶，不仅能水解α-1，4糖苷 键，还能微弱水解α-1，6糖苷键，从淀粉分子的非还原性末端逐个切下葡萄糖，最终产物 为葡萄糖(王镜岩，朱胜庚，徐长法，生物化学上高等教育出版社，北京，2002 :43)。生淀粉酶用于生料淀粉的同步糖化发酵产酒精，可在低温下(30-40°C )直接将生 料淀粉转变为可发酵性糖，同时存在的酵母菌将水解产生的可发酵性糖发酵产生酒精，这 样糖化和发酵在同一反应器中进行，可极大简化传统酒精生产工艺，减少设备方面的成本， 提高设备利用率。更重要的是，能节省高温蒸煮过程所消耗的大量能量，极大降低能耗。因此，生淀粉酶应用在燃料酒精生产方面有着诱人的发展前景，研发生淀粉酶对降低燃料酒 精的生产成本具有重要意义(Li S-Z, Chan-Halbrendt C. Ethanol production in China Potential and technologies. Applied Energy 2009,86:162-169)。能产生生淀粉酶的微生物有很多，已报道的能够产生生淀粉酶的微生物主要是真 菌，比如Aspergillus sp. , Rhizopus sp.，也有报道说来源于细菌的淀粉酶也能作用生淀 粉(Sun H,Ge X,ffang L,et al. Microbial production of raw starchdigesting enzymes. African Journal of Biotechnology 2009,8 1734-1739)
发明内容
本发明的目的是提供一种产生生淀粉酶的青霉菌及其制备的生淀粉酶制剂。
本发明提供的青霉菌(Peniciilium sp.)，名称为GXU20，属于青霉属 (Penicillium sp.)，分离自广西十万大山的森林土壤，已于2010年03月25日保藏于中国 微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号)，保藏号为 CGMCC No. 3690。青霉(Penicillium sp.)GXU20 CGMCC No. 3690, 简称青霉GXU20。青霉GXU20作用生木薯粉后释放的产物为葡萄糖，能够有效地提高生淀粉 质原料的利用率。本发明还提供了用于培养青霉GXU20的培养基，是将麦麸、豆饼粉、ΚΗ2Ρ04、 MgSO4 · 7H20、FeSO4 · 7H20、CaCl2和水混合得到的；每升所述培养基中含有麦麸30g，豆饼粉 25g，KH2PO4 3g，MgSO4 · 7H20 0. 2g，FeSO4 · 7H20 0. 025g，CaCl2 0. 13g。该培养基原料廉价， 生产成本低，易于制备。本发明还提供了一种生产生淀粉酶制剂的方法，是发酵青霉GXU20，得到生淀粉酶 制剂。所述发酵的条件可为PH4. 0-6. 0、26-34°C，优选为pH5. 0、28°C。所述发酵可包括如下步骤将青霉GXU20的孢子液接种至所述培养基中， pH5. 0-6. 0、26-32°C、180rpm(离心半径为 4. 5-5. 5cm)培养 10-14 天；所述发酵具体包括如下步骤(1)将青霉GXU20活化5-7天；(2)将活化的菌种的孢子与水混合，得孢子浓度为IXlOici个/mL的孢子液；(3)将孢子液接入权利要求2所述培养基中，pH 5. 0,280CUSOrpm(离心半径为 4. 5-5. 5cm)摇床培养11天。以上任一所述方法制备得到的生淀粉酶制剂也属于本发明的保护范围。本发明提供的生淀粉酶制剂在pH3. 5-6. 5均有最高酶活力的60%以上活性， 优选pH4. 0-6. 0，最适pH值为4. 5 ；在35-60 °C均有最高酶活力的60 %以上活性，优选 40-60°C，最适温度为50°C ；最适作用条件接近耐高温酵母菌的发酵条件(pH 4. 0,40°C), 在pH4. 0、40°C下生淀粉酶活力高达216U/mL。青霉GXU20和/或所述生淀粉酶制剂可用于生产酒精。可以避免原料的高温蒸 煮，节省大量能量，减少α-淀粉酶的添加，糖化和发酵同时在一个容器中进行，减少设备 成本。应用所述生淀粉酶制剂生产酒精时，pH值可为3. 5-6. 5，温度可为35-60°C ；应用 所述生淀粉酶制剂时，PH值优选为4. 5，温度优选为50°C。
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本发明还保护一种生产酒精的方法，包括如下步骤以生木薯粉为底物，加入所述 生淀粉酶制剂和安琪酿酒酵母，pH4. 0、40°C、150rpm(离心半径为4. 5-5. 5cm)发酵，得到酒 Ib ο本发明提供的青霉GXU20及其生淀粉酶制剂，主要用于生淀粉同步糖化发酵生产 酒精工艺，可以避免原料的高温蒸煮，节省大量能量；不用添加α “淀粉酶，节约成本；糖化 和发酵在一个容器中同时进行，减少设备成本。本发明有望解决因高温蒸煮淀粉所带来的 酒精生产高成本的问题。
图1为青霉GXU20在分离平板上的菌落形态。图2为青霉GXU20在分离平板上的淀粉降解圈。图3为青霉GXU20在PDA平板上的菌落形态。图4为青霉GXU20的显微镜照片。图5为pH对青霉GXU20产生生淀粉酶的影响。图6为温度对青霉GXU20产生生淀粉酶的影响。图7为不同碳源、氮源对青霉GXU20产生生淀粉酶的影响；A 不同碳源对青霉 GXU20产生生淀粉酶的影响；B 不同氮源对青霉GXU20产生生淀粉酶的影响。图8为最适青霉GXU20产生生淀粉酶的麦麸、豆饼粉浓度；A 最适合青霉GXU20产 生生淀粉酶的麦麸浓度；B 最适青霉GXU20产生生淀粉酶的豆饼粉浓度。图9为培养基优化前后青霉GXU20产生生淀粉酶能力的比较。图10为青霉GXU20液态生淀粉酶制剂水解生木薯粉的产物鉴定；A 糖标准品，Gl 为葡萄糖，G2为麦芽糖，G3为麦芽三糖；B 水解5min ；C 水解IOmin ；D 水解30min ；E 水 解4h。图11为青霉GXU20液态生淀粉酶制剂最适作用pH曲线。图12为青霉GXU20液态生淀粉酶制剂最适作用温度曲线。图13为青霉GXU20液态生淀粉酶制剂对不同浓度生木薯粉的水解作用。图14为青霉GXU20液态生淀粉酶制剂处理后的木薯粉颗粒电镜照片。图15为青霉GXU20液态生淀粉酶制剂在生木薯粉同步糖化发酵产酒精中的测定 结果。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。以 下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。以下实施例中的转速，均为 在半径为4. 5-5. 5cm的离心半径下的转速。基本发酵培养基生木薯粉10g、(NH4)2S04 2. 5g、胰蛋白胨2g、K2HPO4 3g， MgSO4 · 7H20 0. 2g、FeSO4 · 7H20 0. 0255g、CaCl2 0. 13g，用蒸馏水定容至 IL ；pH 值用 2M HCl 水溶液或2M NaOH水溶液调节；121°C湿热灭菌20min。
pH4. 0的磷酸氢二钠_柠檬酸缓冲液将7. 71毫升0. 2mol/L Na2HPO4水溶液和 12. 29毫升0. lmol/L柠檬酸水溶液混合。实施例1、实施例2、实施例3中，生淀粉酶活力测定采用3，5- 二硝基水杨酸(3， 5-dinitrosalicylate,DNS)法(Miller GL. Use of dinitrosalicyclic acidreagent for determination of reducing sugar. Analytical Chemistryl959, 31 426-428), Mi^iPW 如下1、将葡萄糖溶于无菌蒸馏水中，制成不同浓度的葡萄糖标准液；在500 μ L葡萄糖 标准液中加入ImL DNS,沸水浴5min显色，冷却至室温，540nm处测定光吸收值；得到光吸 收值和葡萄糖浓度的标准曲线，标准曲线的函数式为y = 2. 7489X-0. 0168 (R2 = 0. 9994) (y 为光吸收值，χ为葡萄糖浓度)。2、将2g生木薯粉悬于IOOmL pH4. 0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中，得到生木 薯粉悬液；在2mL EP管中加入450 μ L生木薯粉悬液，然后加入50 μ L液态生淀粉酶制剂， 40°C下反应30min，期间不断振荡，使酶与底物充分接触，反应结束后加入ImL DNS，沸水浴 5min显色，冷却至室温，1，OOOrpm离心lmin，540nm处测定光吸收值，根据标准曲线和光吸 收值计算酶活力。酶活力定义PH4. 0，40°C条件下水解生木薯粉，Ih释放出Img还原糖(相 当于等量的葡萄糖)所需的酶量为一个酶活力单位(IU)。实施例1、青霉GXU20的获得一、菌株的获得1、土壤样品的采集采集中国广西防城港市十万大山森林约8-20cm浅土层的土壤。2、菌株的分离筛选(1)用蒸馏水配制分离培养基；每升分离培养基中含有生木薯粉10g，NaNO3 3g， KH2PO4 lg，FeSO4 · 7H20 0. OOlg, MgSO4 · 7H20 0. 5g，琼脂 15g ；pH5. 5 ；将除木薯粉以外的其 它组分混合后在121°C湿热灭菌20min，生木薯粉经CcT辐照灭菌，灭菌后的木薯粉在灭菌 后的其它组分冷却至45°C时无菌加入，混勻，倒平板。(2)取Ig 土样放入150mL锥形瓶，加入19mL无菌水，于磁力搅拌器上搅拌30min， 取悬浊液梯度稀释(10_2、10_3、10_4和10_5)，各取50yL涂布在分离培养基平板上，28°C培养。(3)3-5天后，观察菌落生长情况，选择菌落数适量的梯度大量涂布在8块分离平 板上，28 °C培养。(4)5天后，用I2/KI染色，菌落周围出现透明水解圈则说明该菌株分泌生淀粉酶， 挑取水解圈明显的真菌，转接至新的分离平板，纯化为单菌落。(5)配制ρΗ 5. 5的基本发酵培养基。(6)将步骤(4)得到的目的菌株接种至基本发酵培养基(液体)中，28°C、180rpm 培养5-7天，取上清液进行生淀粉酶活力测定，从中筛选出酶活力最高的菌株GXU20。菌株GXU20在分离培养基上的形态见图1，菌株GXU20在分离培养基上的生淀粉降 解圈见图2。二、菌株的鉴定菌株在PDA平板上的菌落形态见图3，该菌株在PDA培养基上生长较快，菌落直径7天可达4-5cm，菌落生长初期菌丝为白色，分化出分生孢子后菌落颜色为青绿色，培养基 背面无色素。菌株的显微镜照片见图4，光学显微镜下观察可见孢子较多，分生孢子为椭圆形或 者圆形，分生孢子小梗为二轮生，分生孢子梗呈扫帚形状，菌丝有横隔。根据该菌株的形态特征，参照《真菌鉴定手册》，将菌株GXU20鉴定为青霉属 (Penicillium)。将青霉GXU20保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保 藏号为 CGMCC No. 3690。实施例2、青霉GXU20生产生淀粉酶的培养条件的优化一、孢子液的制备1、将 PDA 培养基 121°C 灭菌 20min。2、把PDA平板上传代活化5-7天的青霉GXU20的孢子用无菌水洗后制成孢子悬 液，孢子浓度为IX IOltl个/mL。二、pH值的优化1、配制不同pH值(4. 0、4. 5、5. 0、5. 5或6. 0)的基本发酵培养基。2、将青霉GXU20的孢子液按1 %的接种量(体积百分含量)接种至步骤1的培养 基中，28 °C、180rpm培养5天。3、收集粗酶液作为待测溶液，进行生淀粉酶活力测定。结果见图5，青霉GXU20产生生淀粉酶的最适培养pH值为5. 0。三、温度的优化1、配制pH5. 0的基本发酵培养基。2、将青霉GXU20的孢子液按的接种量(体积百分含量)接种至步骤1的培养 基中，分别置于不同温度(26°C、28°C、30°C、32°C或34°C )的摇床180rpm培养5天。3、收集粗酶液作为待测溶液，进行生淀粉酶活力测定。结果见图6，青霉GXU20产生生淀粉酶的最适培养温度为28°C。四、培养基最适碳源和氮源的确定1、配制各种培养基含各种碳源的培养基(pH5.0)用等质量的其它碳源(马铃薯粉、红薯粉、玉米 粉、大米粉、荞麦粉、可溶性淀粉、糯米粉或麦麸)替换基本发酵培养基中的生木薯粉，得到 含各种碳源的培养基。含各种氮源的培养基(pH5. 0)生木薯粉10g、氮源(尿素、硝酸钠、硫酸铵、氯化 铵、胰蛋白胨、酵母膏、牛肉膏或豆饼粉)10g、K2HPO4 3g，MgSO4 · 7H20 0. 2g、FeSO4 · 7H20 0. 0255g、CaCl2 0. 13g，用蒸馏水定容至IL ；pH值用2M HCl水溶液或2M NaOH水溶液调节； 121 °C湿热灭菌20min。2、将青霉GXU20的孢子液按1 %的接种量(体积百分含量)分别接种至步骤1的 各种培养基中，280C、180rpm培养7天。3、收集粗酶液作为待测溶液，进行生淀粉酶活力测定。结果见图7。青霉GXU20产生生淀粉酶的最适碳源是麦麸，最适氮源是豆饼粉。五、麦麸和豆饼粉最适浓度的确定1、麦麸最适浓度的确定
(1)配制各种培养基含各种浓度麦麸的培养基(pH5.0)麦麸(58、1(^、158、2(^、258、3(^、358或408)、 硫酸铵 2. 5g、胰蛋白胨 2g，K2HPO4 3g,MgSO4 ·7Η20 0. 2g、FeS04 ·7Η20 0. 0255g,CaCl2 0. 13g, 用蒸馏水定容至1L;PH值用2M HCl水溶液或2M NaOH水溶液调节；121°C湿热灭菌20min。(2)将青霉GXU20的孢子液按1 %的接种量(体积百分含量)分别接种至步骤(1) 的各种培养基中，280C、180rpm培养7天。(3)收集粗酶液作为待测溶液，进行生淀粉酶活力测定。结果见图8A。青霉GXU20产生生淀粉酶的最适的麦麸浓度为3% (g/100mL)。2、豆饼粉最适浓度的确定(1)配制各种培养基含各种浓度豆饼粉的培养基(ρΗ5. 0)生木薯粉10g、豆饼粉(10g、15g、20g、25g、 30g 或 35g)、K2HPO4 3g，MgSO4 · 7H20 0. 2g、FeSO4 · 7H20 0. 0255g、CaCl2 0. 13g，用蒸馏水定 容至IL ；pH值用2M HCl水溶液或2M NaOH水溶液调节；121°C湿热灭菌20min。(2)将青霉GXU20的孢子液按1 %的接种量(体积百分含量)分别接种至步骤⑴ 的各种培养基中，280C、180rpm培养7天。(3)收集粗酶液作为待测溶液，进行生淀粉酶活力测定。结果见图8B。青霉GXU20产生生淀粉酶的最适的豆饼粉浓度为2. 5% (g/100mL)。六、青霉GXU20在基本发酵培养基和优化的发酵培养基中产酶情况的比较1、配制各种培养基(1)配制ρΗ5· 0的基本发酵培养基。(2)配制ρΗ5· 0的优化发酵培养基麦麸30g，豆饼粉25g，KH2PO4 3g， MgSO4 · 7Η200· 2g，FeSO4 · 7H20 0. 025g, CaCl2 0. 13g 用蒸馏水定容至 IL ；pH 值用 2M HCl 水 溶液或2M NaOH水溶液调节；121°C湿热灭菌20min。2、将青霉GXU20的孢子液按1 %的接种量(体积百分含量)分别接种至步骤1的 各种培养基中，28 0C、180rpm培养。3、培养过程中，每天定时取粗酶液作为待测溶液，进行生淀粉酶活力测定。结果见图9。基本发酵培养基中青霉GXU20产生生淀粉酶的最高峰在第5天，但是 从第6天开始产酶活力就开始下降，而优化发酵培养基的产酶最高峰在第11天，且第11-16 天产酶活力保持稳定。结果表明优化发酵培养基较基本发酵培养基实用，首先其原料麦麸 和豆饼粉较胰蛋白胨和硫酸铵廉价，其次产酶达到高峰后酶活保持稳定不丧失，易于制备 酶制剂。采用优化发酵培养基后，青霉GXU20发酵液的生淀粉酶活力提高到原来的6倍左 右ο优化发酵培养基的配方如下麦麸30g，豆饼粉25g，KH2PO4 3g，MgSO4 · 7H20 0. 2g， FeSO4 ·7Η20 0. 025g, CaCl2 0. 13g 用蒸馏水定容至 IL ；pH 值用 2M HCl 水溶液或 2M NaOH 水 溶液调节；121°C湿热灭菌20min。实施例3、液态生淀粉酶制剂的制备1、配制优化发酵培养基配制pH5. 0的优化发酵培养基。2、孢子液的制备
(1)将 PDA 培养基 121°C 灭菌 20min。(2)把PDA平板上传代活化5-7天的青霉GXU20的孢子用无菌水洗后制成孢子悬 液，孢子浓度为IX IOltl个/mL。3、液态生淀粉酶制剂的制备(1)将50mL优化发酵培养基置于250mL摇瓶中。(2)将青霉GXU20的孢子液按的接种量(体积百分含量)接种至优化发酵培 养基中，28°C、180rpm培养11天。(3) 13，OOOrpm离心培养物，去除菌体，收集上清液作为待测溶液，进行生淀粉酶 活力测定。待测溶液的生淀粉酶活力为216U/mL。该待测溶液即为液态生淀粉酶制剂，进行实施例4、实施例5和实施例6的实验。实施例4、液态生淀粉酶制剂的酶学特性一、液态生淀粉酶制剂水解生木薯粉产物分析1、制备生木薯粉悬液将2g生木薯粉悬于IOOmL pH4. 0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中，得到生木薯粉悬液。2、产物分析在指形瓶中加入6mL生木薯粉悬液，然后加入2mL液态生淀粉酶制剂，放置40°C 下，150rpm摇床反应。分别于5min、10min、30min和4h时取500 μ L样品，沸水煮5min灭活 生淀粉酶，冷却；12，OOOrpm离心5min，取上清液，HPLC检测上清液中的糖(标样为葡萄糖、
麦芽糖、麦芽三糖)。结果见图10。结果表明液态生淀粉酶制剂作用生木薯粉，即使是在很短的反应 时间(5min内)，释放出的产物也只有葡萄糖，且葡萄糖随时间的延长有增多的趋势。由此 推断青霉GXU20液态生淀粉酶制剂里主要是生淀粉糖化酶在起水解作用。二、液态生淀粉酶制剂的最适作用PH值和最适作用温度1、最适作用pH值检测不同pH条件下液态生淀粉酶制剂酶活力的差异分别用不同PH的磷酸氢二 钠 _ 柠檬酸缓冲液(pH 3. 0,3. 5,4. 0,4. 5,5. 0,5. 5,6. 0,6. 5 或 7. 0)代替 pH4. 0 的磷酸氢 二钠_柠檬酸缓冲液，其它同实施例3的生淀粉酶活力测定方法；酶活力定义40°C条件下 水解生木薯粉，Ih释放出Img还原糖(相当于等量的葡萄糖)所需的酶量为一个酶活力单 位(IU)。生淀粉酶活力测定结果如下85.04U/mL(pH 3. 0) ,164. 30U/mL(pH3. 5) ,216. OOU/ mL(pH4. 0) ,271. 78U/mL(pH4. 5) ,256. 44U/mL(pH5. 0) ,231. 66U/mL(pH5. 5) ,210. 86U/ mL (pH6. 0) ,159. 83U/mL (pH6. 5) ,127. 07U/mL (pH 7. 0)。以最高酶活力为 100%，其它 pH 值 的酶活力与最高酶活力的比值为相对酶活力，以PH值为横坐标，相对酶活力为纵坐标作 图，见图11。结果表明，青霉GXU20液态生淀粉酶制剂在40°C时的最适作用pH约为4. 5， PH4.0时相对酶活力为79%。2、最适作用温度检测不同温度条件下液态生淀粉酶制剂酶活力的差异分别采用不同的温度(20°C、25°C、30°C、35°C、40°C、45°C、50°C、55°C或 60°C )，其它同实施例 3 的生淀粉酶活力 测定方法；酶活力定义PH4. 0条件下水解生木薯粉，Ih释放出Img还原糖(相当于等量的 葡萄糖)所需的酶量为一个酶活力单位(IU)。生淀粉酶活力测定结果如下:71.64U/mL(20°C)、81. 43U/mL(25 °C )、126. 03U/ mL(30 °C )、168. 87U/mL(35 °C )、216. OOU/mL (40 °C )、235. 27U/mL (45 °C)、248. 70U/ mL(50°C ) >232. 69U/mL(55°C ) >212. 07U/mL(60°C ) 以最高酶活力作为 100%，其它温度的 酶活力与最高酶活力的比值为相对酶活力，以温度为横坐标，相对酶活力为纵坐标作图，见 图12。结果表明，青霉GXU20液态生淀粉酶制剂的在pH4.0时的最适作用温度约为50°C， 在40°C相对酶活力为87%。三、液态生淀粉酶制剂的底物特异性检测不同底物条件下液态生淀粉酶制剂酶活力的差异分别用相同质量的不同底 物(生木薯粉、生玉米粉、生马铃薯粉、生红薯粉、生糯米粉、生大米粉、生荞麦粉或可溶性 淀粉)代替生木薯粉，其它同实施例3的生淀粉酶活力测定方法；酶活力定义pH4. 0,40°C 条件下水解底物，Ih释放出Img还原糖(相当于等量的葡萄糖)所需的酶量为一个酶活力 单位(IU)。使用Micro BCA蛋白分析试剂(Pierce，Rockford, IL)检测液态生淀粉酶制剂的 蛋白浓度。不同底物条件下液态生淀粉酶制剂的生淀粉酶活力测定结果见表1。表1青霉GXU20液态生淀粉酶制剂的底物特异性
权利要求
青霉(Penicillium sp.)GXU20，其保藏编号为CGMCC No.3690。
2.用于培养青霉(Penicilliumsp.)GXU20 CGMCC No. 3690的培养基，是将麦麸30g， 豆饼粉 25g, KH2PO4 3g, MgSO4 · 7H20 0. 2g, FeSO4 · 7H20 0. 025g 和 CaCl2 0. 13g 与水混合至 总体积为IL得到的。
3.—种生产生淀粉酶制剂的方法，是发酵青霉(Penicillium sp.)GXU20 CGMCCNo. 3690，得到生淀粉酶制剂。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述发酵的条件为pH4.0-6. 0、26-34°C，优 选为 pH5. 0、28°C。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述发酵包括如下步骤将青霉 (Penicillium sp.)GXU20 CGMCC No. 3690的孢子液接种至权利要求2所述培养基中， ρΗ5· 0-6. 0、26-32°C、180rpm 培养 10-14 天。
6.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述发酵包括如下步骤(1)将青霉(Penicilliumsp.)GXU20 CGMCC No. 3690 活化 5-7 天；(2)将活化的菌种的孢子与水混合，得孢子浓度为1X IO10个/mL的孢子液；(3)将孢子液接入权利要求2所述培养基中，pH5.0、28°C、180rpm摇床培养11天。
7.权利要求3至6中任一所述方法制备得到的生淀粉酶制剂。
8.青霉(Penicilliumsp.)GXU20 CGMCC No. 3690和/或权利要求7所述生淀粉酶制 剂在生产酒精中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于应用所述生淀粉酶制剂时，pH值为 3. 5-6. 5，温度为35-60°C ；应用所述生淀粉酶制剂时，pH值优选为4. 5，温度优选为50°C。
10.一种生产酒精的方法，包括如下步骤以生木薯粉为底物，加入权利要求6所述生 淀粉酶制剂和安琪酿酒酵母，PH4. 0,40°CU50rpm发酵，得到酒精。
全文摘要
本发明公开了一种产生生淀粉酶的青霉菌及其制备的生淀粉酶制剂。本发明提供了青霉(Penicillium sp.)GXU20 CGMCC No.3690。本发明还提供了发酵青霉GXU20得到的生淀粉酶制剂。青霉GXU20和生淀粉酶制剂均可用于生产酒精中，可以避免原料的高温蒸煮，节省大量能量；不用添加α-淀粉酶，节约成本；糖化和发酵在一个容器中同时进行，减少设备成本。本发明有望解决因高温蒸煮淀粉所带来的酒精生产高成本的问题。
文档编号C12N9/24GK101955887SQ20101027206
公开日2011年1月26日 申请日期2010年9月2日 优先权日2010年9月2日
发明者冯家勋, 冼亮, 刘君梁, 唐纪良, 张秋江, 林海娟, 段承杰, 罗雪梅 申请人:广西大学