专利名称：番茄slmbp21基因及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，具体地说，涉及一种番茄离区发育相关基因及其在器官脱落过程中的应用。
背景技术：
器官脱落是植物发育过程中的重要过程，叶片的脱落，花和果实的脱落以及果荚的开裂等都属于器官脱落的范畴。同时器官脱落也是一个重要的农艺性状，影响着许多农作物的产量和品质，比如我们所熟知的果树的落花落果，棉花的落蕾落铃等。器官脱落发生的部位称为离区或离层，离区是分布在叶柄，花柄或果柄基部的几层较小的细胞。在器官临近脱落前，这几层细胞的细胞壁和胞间层会被果胶酶和纤维素酶所分解，使细胞间发生分离，当受到外力时，器官就会发生脱落，因而离区发育是研究器官脱落的一个重要的方面。番茄离区是位于番茄花柄或果柄中部的一个显著的解剖学结构，是研究离区发育的良好模式。同时番茄也是一种重要的经济作物，是全世界栽培最广的果菜之一。番茄营养丰富，含有丰富的胡萝卜素，维生素C，B族维生素和番茄红素，可以生食，煮食，也可以加工成番茄酱，番茄汁等产品。在番茄产品的加工过程中，番茄果柄的去除是一项繁琐的工作， 但是“无节”番茄的出现却可以解决这个问题，在采摘“无节”番茄的过程中，果实会从果柄的基部脱落，因而省却了后续去除果柄的麻烦。关于这种“无节”番茄的产生机理，即番茄离区发育的研究有较长的历史，最早可以追溯到上世纪30年代。但直到2000年才定位和克隆到第一个番茄离区发育相关基因——J0INTLESS，与该基因相对应的突变体是3023 (Mao et al.，2000)。此外，J0INTLESS2 和Alq这两个突变体都是无节的，并且在Alq中，J0INTLESS表达下调(Budiman et al., 2004, Pineda et al.，2010)。但是这两个突变体中的相关基因还没有分离出来。目前，番茄离区发育的机理仍然未知，J0INTLESS是目前唯一报道的与番茄离区发育有关的基因。J0INTLESS属于MADS_box基因家族，对拟南芥等模式生物的研究表明，MADS-box 基因是一类在植物发育过程中起重要作用的基因。该家族基因根据序列和功能特点又可以分为许多个亚家族，其中SEP亚家族在该类基因行使功能的过程中起重要作用。在拟南芥中，由该亚家族基因所编码的蛋白能与许多其它MADS-box基因所编码的蛋白形成复合体， 共同作用于下游目标基因，调节植株的生长发育，因而该亚家族基因的功能很广泛，但至今还没有其参与离区细胞发育的报道。在拟南芥中，该亚家族基因功能冗余，但在番茄中已经报道的三个SEP类基因却功能各异，说明番茄中该亚家族基因在功能的行使上同拟南芥中的情况可能有很大的不同，目前番茄中另外两个SEP类基因，LeMADSl和SLMBP21的功能还未知。
发明内容
本发明的目的在于提供一种番茄SLMBP21蛋白。本发明的另一目的在于提供编码所述蛋白的番茄SLMBP21基因。
本发明的目的还在于提供含有所述基因或其片段的载体及其宿主细胞。为了实现上述目的，本发明提供一种番茄SLMBP21蛋白，其为1)由SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列组成的蛋白；或2)SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白。本发明还提供编码上述蛋白的番茄SLMBP21基因，该基因是从番茄中疏四号(以下简称M4)中克隆得到的、属于MADS-box基因家族的番茄离区发育基因，具有如SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列。序列分析结果显示，番茄SLMBP21基因属于MADS-box基因家族，由该基因所编码的蛋白同其它许多植物中的MADS-box蛋白一样也具有保守的MADS区。系统进化分析显示， 番茄SLMBP21基因属于SEP亚家族，由该基因所编码的蛋白同拟南芥中SEP4的相似性最高，为69%;在番茄中，同LeMADSl的相似性最高，为84%。番茄SLMBP21基因在根、叶等营养器官中表达微弱，在花器官中表达较强；对该基因在花器官中的表达做精细分析后发现， 该基因在花柄离区中的表达最强。应当理解，本领域技术人员可根据本发明公开的氨基酸序列，在不影响其活性的前提下，取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸，得到所述蛋白的突变序列。例如在非活性区段，将第(175)位的(A)替换为(V)，或是将第(227)位的(A)缺失，或是在(87位后面) 增加(一个L)。因此，本发明的番茄SLMBP21蛋白还包括SEQ IDNo. 2所示氨基酸序列经取代、替换和/或增加一个或几个氨基酸，具有番茄SLMBP21蛋白同等活性的由番茄SLMBP21 蛋白衍生得到的蛋白质。本发明基因包括编码所述蛋白的核酸序列。此外，应理解，考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。本发明还提供含有上述番茄SLMBP21基因或其片段的载体，以及含有该载体的宿主细胞；所述载体为所述番茄SLMBP21基因或其片段的克隆载体或各类表达载体；所述片段是指番茄SLMBP21基因cDNA的一段3’端序列，其核苷酸序列如SEQ ID No. 9所示。具体地说，本发明将番茄SLMBP21基因cDNA的一段3，端序列(5%bp，其核苷酸序列如SEQ ID No. 9所示)反向构建到双元载体PBI121中，并在大肠杆菌DH5a中扩繁。本发明还通过农杆菌介导转化方法，将pBI121携带的SLMBP21基因cDNA的3’端序列转入番茄，获得番茄转化植株。本发明的番茄SLMBP21基因在调节番茄离区的发育中的应用。所述应用是指通过抑制番茄SLMBP21基因的表达，产生没有离区或离区发育不完全的转基因植株，从而解决各种作物、蔬菜、水果、花卉的落花落果问题。本发明的优点在于，本发明的番茄SLMBP21基因，其属于MADS-box基因家族的番茄离区发育基因，在番茄中抑制SLMBP21基因的表达能够明显影响到番茄离区的发育，产生没有离区或离区发育不完全的转基因植株；可用于解决各种作物、蔬菜、水果、花卉的落花落果问题以及番茄的工业化采摘问题；而且，同J0INTLESS无节突变体中花序发育受到影响的情况不同，在SLMBP21转基因植株中，花序发育不受影响，说明SLMBP21具有更好的应用价值。
图1是本发明的番茄SLMBP21编码蛋白的结构分析；图2是本发明实施例4的植物表达载体pBI121 ；图3是本发明实施例1的克隆中间载体pEASY-TlSimple ；图4是本发明实施例5的番茄SLMBP21基因影响番茄离区发育图；图5是本发明实施例5的番茄SLMBP21基因影响番茄离区发育图；图6是本发明实施例5的番茄SLMBP21基因影响番茄离区发育图；图7是本发明实施例6的番茄SLMBP21基因的表达谱；其中，SD，幼苗；R，根；L，叶； IF，花序；Se，萼片；Pe，花瓣；St，雄蕊；Ca，心皮；PP，花柄近轴端；PA，花柄离区；PF，花柄远轴端。图8是本发明实施例7的番茄SLMBP21基因与J0INTLESS基因在植物细胞体内互作图；图9是本发明实施例8的番茄SLMBP21基因和LeMADSl基因在转基因植株中的表达水平；其中，1，2，6，7，12，14代表不同的转基因株系。
具体实施例方式以下结合附图和实施例，进一步详细说明本发明。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例1番茄SLMBP21基因全长的克隆1)利用核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID No. 4 所示的反向引物，从番茄中蔬四号的花柄cDNA中克隆SLMBP21基因的编码区序列；PCR 程序94°C，5 分钟；94°C，30 秒；55°C，30 秒；72°C，45 秒；重复；35 次；72°C，10 分钟。PCR 体系 JXfesyiTaq PCR SuperMix (全式金公司) 25 μ 1 ；正向引物(10μ Μ)2μ 1 ；反向引物(10μ Μ)2μ 1 ；DNA 模板5 μ 1 ；双蒸水补足50 μ 1。将上述PCR产物直接按照TA克隆方法克隆连接到pEASY-TlSimple上(如图3所示)；连接产物转化大肠杆菌DH5 α，并在其中扩繁，阳性克隆经过测序筛选获得该序列；2)然后利用核苷酸序列如SEQ ID No. 5所示的正向5’RACE引物和核苷酸序列如 SEQ ID No. 6所示的基因特异反向引物，利用 5，RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends) 方法克隆SLMBP21基因的5’非编码区序列；5，RACE的步骤按照RACE试剂盒(Invitrogen)的说明操作。PCR 程序94°C，5 分钟；94°C，30 秒；55°C，30 秒；72°C，30 秒；重复；35 次；72°C，10分钟。PCR 体系 JXfesyiTaq PCR SuperMix (全式金公司) 25 μ 1 ；正向引物(10μ Μ)2μ 1 ；反向引物(10μ Μ)2μ 1 ；
DNA 模板5 μ 1 ；双蒸水补足50 μ 1。将上述PCR产物直接按照TA克隆方法克隆连接到pEASY-TlSimple上(如图3所示)；连接产物转化大肠杆菌DH5 α，并在其中扩繁，阳性克隆经过测序筛选获得该序列；3)利用核苷酸序列如SEQ ID No. 7所示的正向基因特异引物和核苷酸序列如SEQ ID No. 8所示的反向引物，从番茄中蔬四号的花柄cDNA中克隆SLMBP21基因的3’非编码区序列；PCR 程序94°C，5 分钟；94°C，30 秒；55°C，30 秒；72°C，30 秒；重复；35 次；72°C，10分钟。PCR 体系 JXfesyiTaq PCR SuperMix (全式金公司) 25 μ 1 ；正向引物(10μ Μ)2μ 1 ；反向引物(10μ Μ)2μ 1 ；DNA 模板5 μ 1 ；双蒸水补足50 μ 1。将上述PCR产物直接按照TA克隆方法克隆连接到pEASY-TlSimple上(如图3所示)；连接产物转化大肠杆菌DH5 α，并在其中扩繁，阳性克隆经过测序筛选获得该序列；4)将以上三段序列拼接，获得番茄SLMBP21基因的全长cDNA序列，其核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示，由其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。实施例2番茄SLMBP21蛋白的序列结构分析番茄SLMBP21具有MADS_box家族蛋白的特征序列区MADS区(约前60个氨基酸)，同拟南芥中SEP4蛋白序列的相似性为69%，同番茄中LeMADSl蛋白序列的相似性为 84%。结果如图1所示。实施例3 番茄SLMBP21蛋白的序列结构分析系统进化分析结果显示，SLMBP21属于SEP亚家族，同拟南芥中的SEP1/2/3/4， 矮牵牛中的Wi FBP2/4/5/9/23同处于进化树中的一个分支。番茄中属于该亚家族的还有 TM5、TM29、RIN 禾口 LeMADSl0实施例4番茄SLMBP21基因表达载体及转基因植株番茄离区发育相关基因SLMBP21的一段3’端序列(595bp，其核苷酸序列如SEQ ID No. 9所示)，反向构建在图2所示的植物表达载体PBI121中，用于利用RNA干扰的原理在番茄中抑制SLMBP21的表达水平，进而研究其功能。通过农杆菌介导转化方法，将pBI121携带的SLMBP21基因cDNA的3’端序列转入番茄，以番茄种子无菌播种后的子叶为受体，获得番茄转化植株，植物中的筛选标记为卡那霉素。农杆菌介导转化方法和步骤如下农杆菌转化番茄的方法和步骤如下1.种子准备将1. 5g番茄种子依次经95%乙醇洗和20%次氯酸钠消毒和无菌水清洗后，将种子均勻放置于1/2MS0培养基表面，在培养间光照(1 光照，8h黑暗)培养6天。2.外植体准备当子叶从种皮中长出后，用锋利的解剖刀将子叶切成25mm2大小，并将子叶近轴面向上放置在盛有滤纸的Dl培养基的表面(注意无菌操作)；于培养间长光照(1 光照，8h黑暗)培养2天。3.农杆菌准备固体培养基上活化_70°C存放的农杆菌(Agrobacterium tumefaciens，C58C1)，挑单克隆至相应抗性的液体培养基中培养至0D_处于0. 6 0. 7之间，收集菌体，MSO清洗悬浮并加入乙酰丁香酮(AQ制备成侵染液。4.共培养用上一步制成的侵染液侵染子叶，侵染完成后将子叶远轴端朝上培养于新的盛有滤纸(Whatman Filter Paper)和Dl培养基的新培养皿中，在培养间放置2天(16h光照，8h黑暗)。5.选择转化愈伤将子叶转移至2Z培养基上(没有滤纸)，约10天更换一次培养基，直至有芽出现后转移至IZ选择性培养基上继续培养，约两周更换一次培养基。6.生根当再生苗至少有2cm长并包含至少一个生长点的时候，可从外植体上切下再生苗 (不包括愈伤组织)，将再生苗放入MMSV培养基中进行生根培养。生根后的植株生长到足够大时，就可转移至装有跖石和营养土的培养钵中，于一般生长箱中生长。这些植株即为TO代植株。其中，使用到的培养基配方为Dl 培养基MS0. 44%蔗糖3%琼脂0.8%pH5. 8120°C高压灭菌20分钟后加入以下成分，反式玉米素核苷1. Omg/L2Z 培养基MS0. 44%蔗糖3%琼脂0.8%pH5. 8120°C高压灭菌20分钟后加入以下成分，反式玉米素核苷 1. 5mg/L特美汀200mg/L卡那霉素50mg/LIZ 培养基MS 0. 44%蔗糖3%琼脂0.8%pH5. 8120°C高压灭菌20分钟后加入以下成分，反式玉米素核苷 1. Omg/L
特美汀200mg/L卡那霉素50mg/LMMSV 培养基MS0. 44%蔗糖3%琼脂0.8%pH6.0120°C高压灭菌20分钟后加入以下成分，特美汀200mg/L卡那霉素50mg/L叶酸0. 5mg/L实施例5番茄SLMBP21基因对离区发育的影响将实施例4获得的共22株番茄转化植株与其野生型对照as4)植株在培养间中同时一起培育(16小时光照、22°C /8小时黑暗、20°C的光周期)，直至完成整个生命周期。 22株番茄转化植株共表现出如图4 6所示的3种表型，其中7株如图4所示，即在番茄中抑制SLMBP21基因的表达，导致离区消失，花器官和果实不能正常脱落(左侧两图为野生型对照(ZS4)，右侧两图为实施例4获得的转基因植株)；9株如图5所示，即在番茄中抑制SLMBP21基因的表达，导致离区部分消失，果实不能正常脱落(左侧两图为野生型对照 (ZS4)，右侧两图为实施例4获得的转基因植株)；6株如图6所示，即在番茄中抑制SLMBP21 基因的表达，导致离区沿花柄方向向近轴方向转移(左图为野生型对照，右图为转基因植株)。上述结果说明番茄SLMBP21参与离区发育，控制离区的形成。由于不同转基因植株中SLMBP21被抑制的程度不同，所以转基因植株的表型会有程度上的差异，这可能与外源基因在番茄基因组上的插入位点有关系，运用农杆菌转化的方法来转化植物，外源基因的插入位点是随机的。同时这种转基因植株的表型方式是应用 RNA干扰的方法来沉默基因的一种普遍的表型表现方式，更说明了 SLMBP21参与离区的发育。实施例6通过实时定量荧光PCR(quantitative real time RT-PCR)测定番茄 SLMBP21 基因在各器官中的表达谱。结果如图7所示。结果表明番茄SLMBP21基因主要在花器官中表达，在花柄离区高水平表达。实施例7将J0INTLESS基因同YFP的融合基因及SLMBP21基因同CFP的融合基因，通过原生质体瞬时转化法共转化拟南芥原生质体。转化细胞中GFP荧光信号表示J0INTLESS基因和SLMBP21基因能在植物细胞的细胞核中互作。结果如图8所示。实施例8利用RT-PCR测定SLMBP21反义转基因株系中SLMBP21和LeMADSl的表达量，结果如图9所示。番茄中LeMADSl基因与SLMBP21基因的序列相似性最高，但在SLMBP21反义转基因植株中SLMBP21表达量下降，但LeMADSl表达量基本不受影响，说明基因表达抑制作用的特异性。
8
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方式
，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
权利要求
1.番茄SLMBP21蛋白，其为1)由SEQID No. 2所示的氨基酸序列组成的蛋白；或2)SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白。
2.编码权利要求1所述蛋白的番茄SLMBP21基因。
3.如权利要求2所述的基因，其核苷酸序列如SEQID No. 1所示。
4.含有权利要求2或3所述基因或其片段的载体。
5.如权利要求4所述的载体，其特征在于，所述片段为番茄SLMBP21基因cDNA的一段 3’端序列，其核苷酸序列如SEQ ID No. 9所示。
6.含有权利要求4或5所述载体的宿主细胞。
7.权利要求2所述基因或其片段在调节番茄离区的发育中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述应用是通过抑制番茄SLMBP21基因的表达，产生没有离区或离区发育不完全的转基因植株。
全文摘要
本发明提供一种番茄SLMBP21蛋白，以及编码该蛋白的番茄SLMBP21基因，该基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明的优点在于，本发明的番茄SLMBP21基因，其属于MADS-box基因家族的番茄离区发育基因，在番茄中抑制SLMBP21基因的表达能够明显影响到番茄离区的发育，产生没有离区或离区发育不完全的转基因植株；可用于解决各种作物、蔬菜、水果、花卉的落花落果问题以及番茄的工业化采摘问题；而且，同JOINTLESS无节突变体中花序发育受到影响的情况不同，在SLMBP21转基因植株中，花序发育不受影响，说明SLMBP21具有更好的应用价值。
文档编号C12N1/19GK102399272SQ201010287618
公开日2012年4月4日 申请日期2010年9月19日 优先权日2010年9月19日
发明者刘旦梅, 李爱丽, 毛龙 申请人:中国农业科学院作物科学研究所