专利名称：一种评价益生菌粘附作用的方法
技术领域：
本发明涉及一种评价粘附作用的方法，特别是一种评价益生菌粘附作用的方法。
背景技术：
近年来，微生态制剂作为一种新兴的保健品或者药品，在维持肠道的微生态平衡、 增强机体的免疫功能、预防和治疗腹泻、抑制肿瘤发生、调节血压和降胆固醇等益生方面发挥着非常重要的作用。为了发挥益生作用，益生菌必须首先要粘附于肠道上皮细胞，定植形成稳定的菌群。益生菌的粘附能力可为其提供竞争优势，是其在消化道中长期定植并发挥益生作用的必要条件。而众多的候选菌株在被确定允许作为益生菌并用于大规模生产之前，都要经过严格的筛选，并要求符合一定的标准。由于益生菌株必须对肠道上皮细胞组织具有粘附性才能长期在肠道中存活并发挥其益生作用。因此，益生菌粘附和定植于宿主肠道的能力是其重要标准之一。目前评价益生菌粘附作用的方法包括体外模型用到的革兰氏染色、同位素标记、 酶联免疫标记方法和体内模型用到的免疫组化、原位标记方法等。这些方法只是从表观上来评价益生菌在肠道内的粘附作用，并且容易存在较大的人为误差。此外，无论是体外模型还是体内模型都没有从分子水平对益生菌的粘附作用进行研究。作为益生菌筛选的重要指标之一的粘附作用的研究，目前还没有一套全面的、整体的、有效的评价体系，因此进一步探索和建立一种全面的、整体的、有效的方法来评价益生菌的粘附作用势在必行。
发明内容
本发明提供一种评价益生菌粘附作用的方法。评价益生菌粘附作用的方法是一、将待评价的益生菌培养到对数生长期，离心后弃去上清，用磷酸盐缓冲液洗3次，然后用DMEM细胞培养液重悬菌体，得菌浓度为 3X 107CfU/ml的菌悬液；二、将培养到极化状态的鼠肠道上皮细胞用磷酸盐缓冲液洗2次， 然后加入Iml的菌悬液作为实验组，加入Iml的DMEM细胞培养液作为空白对照组，在37°C、 5% CO2的培养箱里共同孵育4h ；三、采用Trizol法抽提实验组和空白对照组中鼠肠道上皮细胞的总RNA ；四、利用RealTime RT-PCR法对下表中粘附分子的表达情况在总RNA水平进行检测，检测结果通过与对照组相比，即可评价该益生菌的粘附作用。
权利要求
1.一种评价益生菌粘附作用的方法，其特征在于评价益生菌粘附作用的方法按以下步骤实现一、将待评价的益生菌培养到对数生长期，离心后弃去上清，用磷酸盐缓冲液洗3次，然后用DMEM细胞培养液重悬菌体，得菌浓度为3X 107CfU/ml的菌悬液；二、将培养到极化状态的鼠肠道上皮细胞用磷酸盐缓冲液洗2次，然后加入Iml的菌悬液作为实验组，加入Iml的DMEM细胞培养液作为空白对照组，在37°C、5% CO2的培养箱里共同孵育 4h ；三、采用Trizol法抽提实验组和空白对照组中鼠肠道上皮细胞的总RNA ；四、利用Real TimeRT-PCR法对下表中粘附分子的表达情况在总RNA水平进行检测，检测结果通过与对照组相比，即可评价该益生菌的粘附作用。
2.根据权利要求1所述的一种评价益生菌粘附作用的方法，其特征在于步骤一中离心是以4000r/min的转速离心lOmin。
3.根据权利要求1所述的一种评价益生菌粘附作用的方法，其特征在于步骤二中极化状态的鼠肠道上皮细胞培养过程a、将健康的小鼠在无菌条件下颈椎断裂法处死后，迅速取其肠组织放入含有葡萄糖的DMEM培养液中；b、然后肠组织用IOml相同的培养液冲洗6 次，剪下2-3mm的片段，用DMEM培养液收集；C、肠组织在20ml含有胶原蛋白酶和中性蛋白酶的DMEM培养液中，25°C消化，150rpm搅动45min，大片断通过重力作用在瓶底除去；d、上清液移到离心管中，300rpm离心!Bmin ；e、沉淀物用DMEM培养液洗2次，最后在DMEM培养液中悬浮；f、将鼠肠道上皮细胞转移到6孔细胞培养板中培养至极化状态；其中DMEM细胞培养液由90ml的DMEM细胞培养液、IOml的胎牛血清、Ig的青霉素钠和Ig的链霉素组成。
4.根据权利要求1所述的一种评价益生菌粘附作用的方法，其特征在于步骤二中菌悬液与极化状态的鼠肠道上皮细胞的共孵育时间是4h。
5.根据权利要求1所述的一种评价益生菌粘附作用的方法，其特征在于步骤三中采用 Trizol法抽提实验组和空白对照组孵育后的鼠肠道上皮细胞总RNA的过程1、肠上皮细胞加Trizol后，室温放置5min ；2、以12000r/min离心5min,弃沉淀；3、按200ul氯仿/ml Trizol加入氯仿，振荡混勻后室温放置IOmin ；4、4°C、12000r/min离心15min ；5、吸取上层水相，至另一离心管中；6、按0. 5ml异丙醇/ml Trizol加入异丙醇混勻，室温放置IOmin ；·7、4°C、12000r/min 离心 IOmin ；8、按 Iml 75% 乙醇 /ml Trizol 加入 75% 乙醇，振荡离心管，悬浮沉淀；9、4°C、9000r/min离心lOmin，弃上清；10、真空干燥lOmin，即完成。
全文摘要
一种评价益生菌粘附作用的方法，涉及一种评价粘附作用的方法。方法一、将待评价的益生菌培养到对数生长期，制得菌悬液；二、将极化状态的鼠肠道上皮细胞与菌悬液共同孵育；三、采用Trizol法抽提共孵育后的鼠肠道上皮细胞的总RNA；四、利用Real Time RT-PCR法对粘附分子的表达情况在总RNA水平进行检测和比较。本发明通过对粘附分子在分子水平的检测，可以更加全面、客观的评价益生菌的粘附作用。
文档编号C12Q1/68GK102453754SQ20101052088
公开日2012年5月16日 申请日期2010年10月27日 优先权日2010年10月27日
发明者张文龙 申请人:张文龙