专利名称：一种高效表达重组蜱抗凝肽的生产方法
技术领域：
本发明涉及用基因工程的手段表达重组蜱抗凝肽(rTAP)的方法，更具体地，涉及在酵母表达系统中高效表达重组蜱抗凝肽的方法。特别地，本发明还涉及用于重组蜱抗凝肽高效表达的引物。
背景技术：
随着人们生活水平的提高，心血管疾病成为发病率和死亡率都很高的一种疾病，是目前危害人类生命和健康的主要疾病之一。据世界卫生组织(WHO)统计，全世界每年大约有1200万人死于心脑血管病。我国60岁以上人口已超过一亿，这个年龄层次发病率在20％以上，即有2000万以上需用药防治和治疗。
血栓的形成很容易导致心血管疾病的发生，而血液凝集是导致血栓形成的直接原因。血液凝集的过程是一个由许多具有不同功能的蛋白所共同参与的复杂的生化反应。人血清中的X因子在血液凝集中起着重要的作用，它是一个双链的糖蛋白(含15％的糖)，SDS-PAGE电泳表明它的分子量是6700(Di Scipio et al.，“A comparison of humanprothrombin，Factor IX(Christmas factor)，Facior X(Stuart factor)and protein S”，Biochemistry，vol.16，pp.698-706)，每升血清浓缩可以得到7-10mg的蛋白。X因子重链的分子量是42000，与凝血酶原2有高度的同源性，也包括丝氨酸的活性位点。轻链的分子量是17000，通过二硫键与重链共价结合，轻链与凝集素的片段1有明显的同源性，X因子可以被IXa因子和VIIIa因子的复合物，或者被组织因子/VIIa因子通过剪切掉至少一段肽链而被激活。作用的机理是水解重链的Arg-Ile释放一段有活性的小肽，这种方式激活的称为α-Xa因子，进一步的修饰是在Arg-Gly位点进行剪切，这种激活方式产生称为β-Xa因子。不管是α-Xa因子还是β-Xa因子都具用相同的导致血液凝集的功能。
目前临床上主要应用的抗凝血药为三类肝素(heparins)，低分子量肝素(low-molecular heparins)和香豆素(coumarins)类如华法令(warfarin)。最近FDA批准凝血酶抑制剂重组水蛭素(hirudin)应用于临床。但这些抗凝剂都存在一种或几种缺点(1)、较低的口服生物利用度；(2)、很高的出血并发症；(3)、对凝血酶与其它丝氨酸选择性较低，有时可导致致命的血压过低或呼吸抑制；(4)、肝毒性作用；(5)、治疗费用较高。因此世界上药学家们正在努力寻找新作用靶点的抗凝血药，他们的努力已经取得了一定的进展，找到了一些作用机制独特的天然的或合成的的抗凝血物质，这些凝血物质很有可能成为上述药物的替代物。其中较为代表的新抗凝物就是Xa因子的抑制剂。
蜱抗凝肽(TAP)是Xa因子的特异性抑制因子中的一种，TAP是从非洲钝缘蜱(Ornithordors mobata)中分离出一种强效Xa因子抑制剂，为单链酸性多肽，含有60个氨基酸残基，推测其属于Kunitz家族类丝氨酸蛋白酶抑制剂，与其它同类抑制剂相比，TAP是一种新型的、结合紧密的、具有高度选择性的Xa因子抑制剂，对其它丝氨酸蛋白酶(包括胰蛋白酶)无抑制作用。其抗人Xa因子的拮抗系数(Ki)为0.59nM(Waxman et al.，1990)。由于Xa是凝血酶原激活物，具备凝血酶原抑制剂的全部作用。TAP氨基末端4个氨基酸是TAP与Xa因子形成高亲合复合物的识别位点。另外TAP40-54区域可能是与Xa因子结合的第二区域，这一序列与Xa因子催化凝血酶原的位点-氨基末端氨基酸序列非常相似(Dunwiddie et al，1993)。
TAP属于Kunitz家族类丝氨酸蛋白酶抑制剂，通过对TAP-Xa因子的晶形结构研究发现TAP N-末端Tyr1T残基与Xa因子底物样的S1特异沟结合(Wei et al.，1998)。这种结合方式保证了TAP与Xa因子结合高度特异性，这种结合导致了TAP对Xa因子活性的特异性抑制作用，而对其它丝氨酸蛋白酶如胰蛋白酶、凝血酶以及血液中其它蛋白酶无抑制作用。TAP的α-螺结构参与Xa因子钠离子结合位点附近第二结合位点结合(Zhang & Tulinsky，1997)，支持了TAP与Xa因子两步结合的机制。
点突变实验表明(Mao et al.，1995)，当TAP的1位Tyr被Trp取代(Y1W)和10位Asp被Arg取代(D10R)后，抑制人Xa因子的活性可分别提高2.5倍和4倍。而双突变型TAP抑制人Xa因子的活性可分别提高37倍。当TAP的1位Tyr被Glu取代后，对Xa因子只起轻微抑制作用(Ki＝2nM)，并且与Xa因子结合非常缓慢；而当TAP的1位Tyr被pHe取代后，则对Xa因子无抑制作用；另外当TAP的2位Asn和4位Leu被其它氨基酸取代后可降低抑制人Xa因子的活性的3-4倍。这些结果表明TAP的疏水氨基N-末端决定着其抑制活性的强度。
突变实验和重组蜱抗凝肽和Xa因子复合物的构象研究表明(Wei etal.1998)，N-末端的Tyr-1、Asn-2、Arg-3在复合物形成中起关键作用，其中Tyr-1的侧链与Xa的S1沟结合，Arg-3与Xa的Glu97形成盐桥，自解环参与形成与Xa因子复合物的二级结合位点。C端螺旋与Xa因子相互作用形成二级结合的主体部分，所以二者的结合符合二级动力学机制。
发明内容
本发明提供了可以用作特异性引物，扩增重组蜱抗凝肽基因序列的寡核苷酸序列。
本发明还提供了一种重组蜱抗凝肽的高效表达生产方法。
本发明人通过对野生型TAP的基因进行突变，可以得到TAP的突变体，进而通过包括原核和真核在内的各种表达系统对其进行高效表达。
利用生物合成的方法来表达蛋白，最主要的是如何获取该蛋白的基因，因此引物的设计在生物工程中具有很重要的作用，它直接影响的蛋白表达的成功与否，本发明所涉及的引物对rTAP的表达以及对rTAP的高表达量具有非常明显的作用。对于TAP而言，有1号位氨基酸的单突变，有10号位的单突变，还有1号位和10号位氨基酸同时进行的双突变，这几种突变都能明显的改变TAP抑制Xa因子的活性。发明中提到的引物包括针对1号位氨基酸进行突变，或针对10号位氨基酸突变，以及同时针对1号位和10号位氨基酸进行双突变而设计的引物。另外还包括针对除含有双突变位点还新增加其他位点突变而设计的引物，因为在双突变外增加新的突变位点(比如三突变体，含有1号位和10号位氨基酸的突变，同时增加其他位点的突变)得到的rTAP对Xa因子的抑制活性及从与Xa因子形成的复合物解离的速度与双突变TAP相比没有太大的变化。
本发明提到的引物还包括含有针对1号位氨基酸进行突变，或针对10号位氨基酸突变，或者同时针对1号位和10号位氨基酸进行双突变而设计的融合蛋白的引物，还包括针对含有双突变位点但新增加其他位点突变而设计的融合蛋白的引物，因为这样设计的融合蛋白的引物最后可以经过表达得到含TAP活性的双功能(或多功能)蛋白。
因此，本发明涉及一段选自下列物质组之一、或者由于密码子的简并性能够与下列物质组之一编码相同氨基酸的寡核苷酸序列，其可用作引物扩增出重组蜱抗凝肽的基因序列①P1TCTCGAGAAAAGATGGAATAGGCTGTGTATTAAGCCTAGAAGATGGATTGATGAGT；②P2TGGAATAGGCTGTGTATTAAGCCTAGAAGATGGATTGATGAGTGTGATAGTAATGA；③P3CACAACCACCTTTACCGTTACGAAAATAGGCTCTTTCACCCCCTTCATTACTATCACACTC；④P4TAAAGGTGGTTGTGATTCCTTTTGGATCTGTCCGGAAGACCATACCGGTGCTGACTAT；⑤P5GATGCAAGCGTTGAAGCAGTCACGGTAGGAGGAGTAATAGTCAGCACCGGT。
上述寡核苷酸序列可以作为扩增引物，通过与目的基因的同源互补，在合适的反应条件下，渐次扩增出重组蜱抗凝肽的基因全序列。
本发明还涉及一种在酵母中表达重组蜱抗凝肽的生产方法，包括①设计引物合成重组蜱抗凝肽的编码基因；②融合于酵母表达调控元件，构建甲醇酵母高表达工程菌；③运用甘油培养和诱导表达二步生长法，在酵母中高密度发酵表达重组蜱抗凝肽；④采用超滤、离子交换、分子筛柱层析等纯化技术的顺序组合，大量纯化回收重组蜱抗凝肽。
本发明生产方法中采用的引物是选自下列物质组之一的寡核苷酸序列①P1TCTCGAGAAAAGATGGAATAGGCTGTGTATTAAGCCTAGAAGATGGATTGATGAGT；②P2TGGAATAGGCTGTGTATTAAGCCTAGAAGATGGATTGATGAGTGTGATAGTAATGA；③P3CACAACCACCTTTACCGTTACGAAAATAGGCTCTTTCACCCCCTTCATTACTATCACACTC；④P4TAAAGGTGGTTGTGATTCCTTTTGGATCTGTCCGGAAGACCATACCGGTGCTGACTAT；
⑤P5GATGCAAGCGTTGAAGCAGTCACGGTAGGAGGAGTAATAGTCAGCACCGGT。
1.根据权利要求7所述的生产方法，其中所述酵母表达调控元件包括AOX1启动子。AOX1启动子为甲醇诱导型启动子，能被甘油、葡萄糖等优先利用的碳源所抑制。
优选的，本发明方法中使用的酵母是甲醇酵母P1-10。本发明所使用的工程菌能够利用甲醇作为唯一碳源。
本发明生产方法中的二步生长法包括在甘油培养阶段，将工程菌接种于以甘油或葡萄糖为碳源的半合成培养基上，在温度26-32℃，pH值3-6条件下培养16-28小时，至甘油或葡萄糖耗尽，菌密度达到大于OD600＝160；在诱导表达阶段，控制溶氧浓度为15％-45％(与搅拌速度和罐压以及补料相关)，以0.01-10％甲醇作为诱导剂。
优选的，上述方法的甘油培养阶段，在温度30℃，pH值为5的条件下进行培养；在诱导表达阶段，溶氧浓度为30％，以浓度为0.5-5％的甲醇进行诱导。
更优选的，在甘油培养阶段，控制空气流量为30L/min，在培养末期调节pH值为4。
发酵结束后除去菌体，收集发酵上清。除菌可采用离心、压滤、超滤等方法。上清经超滤脱盐、浓缩后即可进入后续纯化工作。
本发明设计了离子交换、分子筛柱层析纯化技术的顺序组合。离子交换柱填料为SP、SP-STREAMLINE、CM、CM-STREAMLINE、SOURCE S、Q、Q-STREAMLINE、DEAE、DEAE-STREAMLINE、SOURCE Q等离子交换介质；离子交换层析平衡液为10-50mM TrisHCl或PB或NaAC-HAC缓冲液，pH为3.5-9.0，洗脱液为平衡液加0.01-2M NaCl。将浓缩后的上清液调节pH值为3.5-8.0后直接上样并以上述相应平衡液加0.01-2M NaCl梯度或分段洗脱。收集目标峰经离子交换纯化，目标峰中重组蜱抗凝肽纯度已大于95％。分子筛柱填料为SepHacryl或Superdex系列介质。分子筛柱层析平衡液为5-100mM PB缓冲液，pH值为6.0-8.0。将离子交换纯化后收集的目标峰直接上样于以5-100mM PB，pH值为6.0-8.0的缓冲液平衡的SepHacryl或Superdex系列介质的分子筛柱脱盐精制。
本发明提供了一种极具商业价值，大规模生产制备蜱抗凝肽的方法，其突出优点在于①建了甲醇酵母高表达蜱抗凝肽生产工程菌，再结合优化的发酵工艺，可使表达量高达4-8g/L。②后续纯化工艺简单，易放大，总收率可大于55％，精制蜱抗凝肽的RP-HPLC纯度大于97％。③本发明的TAP的双突变体具有高度稳定性，得到的rTAP对Xa因子有很强的特异性抑制作用。
附图的简要说明
图1显示了rTAP基因工程菌的发酵生长曲线。
图2显示了用CM阳离子交换柱纯化目的蛋白的洗脱图谱。
图3显示了纯化rTAP的SDS-PAGE电泳图谱。
图4用DEAE阳离子交换柱纯化目的蛋白的洗脱图谱。
图5显示了rTAP的比活测定标准曲线。
实施例实施例1、重组蜱抗凝肽(rTAP)引物设计和序列合成本发明人根据酿酒酵母的偏嗜密码子，合成以下引物P15′-TCTCGAGAAAAGATGGAATAGGCTGTGTATTAAGCCTAGAAGATGGATTGATGAGT-3′P25′-TGGAATAGGCTGTGTATTAAGCCTAGAAGATGGATTGATGAGTGTGATAGTAATGA-3′
P35′-TCACAACCACCTTTACCGTTACGAAAATAGGCTCTTTCACCCCCTTCATTACTATCACACTC-3′P45′-TAAAGGTGGTTGTGATTCCTTTTGGATCTGTCCGGAAGACCATACCGGTGCTGACTAT-3′P55′-GATGCAAGCGTTGAAGCAGTCACGGTAGGAGGAGTAATAGTCAGCACCGGT-3′以上引物各取20pmol，加4μl 2.5mM dNTPs，10×PCR缓冲液5μl，2U Taq酶，蒸馏水加至50μl，用PCR仪进行如下循环94℃ 30秒，50℃ 30秒，72℃ 30秒，共5个循环。电泳回收200bp左右产物，克隆到pMD18T载体(Takara公司)，测序。
实施例2、重组蜱抗凝肽(rTAP)载体构建同时用EcoR和XbaI双酶切拼接产物克隆载体pMD18T-rTAPmut和酵母分泌表达载体pYE3，琼脂糖凝胶电泳分离片段，回收180bp的rTAPmut基因片段；乙醇沉淀纯化回收5kb的载体DNA片段。然后在T4DNA连接酶的作用下，将基因片段与载体相连接。连接产物转化感受态大肠杆菌宿主细胞TOP10F’。经Zeocin/G418抗性平板筛选，对阳性转化子进行菌落PCR鉴定，筛选可扩增出180bp DNA片段的阳性克隆。任选其中两株，小量提取质粒，进行酶切鉴定。
构建成功的表达载体是大肠杆菌-酵母穿梭载体，其中包含了大肠杆菌的复制信号，AMP/NEO抗性基因，T3/T7启动子，pHO1/AOX1启动子，alpHa因子信号肽序列，增强子序列，AOX1/pHO1基因的5’以及3’非翻译序列等。
实施例3、重组蜱抗凝肽(rTAP)载体转化酵母宿主细胞采用毕赤酵母的GS115菌株，以电转化把线性化的基因序列转到酵母细胞中，再用G418平板筛选出阳性克隆，进一步用高浓度抗性平板筛选出多拷贝整合菌株。
A)质粒的大量提取从固体培养基上挑取单个菌落接种于3-5ml含相应抗生素的LB培养基中，37℃振摇过夜培养活化菌种；再按0.2-0.5％同前接种、培养100mL菌体；6000g 4℃ 15分钟离心收集菌体(约湿重0.3克)，沉淀重悬于10mL P1溶液中，混悬后加入10mL P2，冰浴5min，再加入10mL P3，冰浴20min，20,000rpm 4℃ 10min，离心2次；同时用10mL QBT预平衡质粒纯化柱，将离心后的上清加到平衡好的纯化柱上，让质粒与纯化柱上的树脂结合；待上清流出纯化柱后，用QC洗涤纯化柱2次，每次30mL，洗去树脂上样品中的杂质；最后用15mL QF将质粒从纯化柱上洗脱下来，收集洗脱液，加入10.5mL异丙醇室温沉淀10min，15,000rpm室温离心30min，5mL 70％乙醇洗涤沉淀，吹干，沉淀重悬于适量灭菌水中。(P1，P2，P3，QBT，QC，QF为QIAGEN试剂盒提供)B)化学法质粒转化1.感受态细胞的制备挑取单个宿主菌GS115或KM71，接种于10mL YPD培养基中，28-30℃过夜培养。次日将培养的菌液稀释至OD600为0.1-0.2，取10mL继续培养4-6小时。使OD600为0.6-1.0，500g，5分钟，室温离心收集菌体，沉淀重悬于10mL溶液I中，同上离心，沉淀重悬于1mL溶液I中，即得酵母菌感受态细胞。制备好的感受态细胞可分装成50-200μL的小份，迅速冻存于-70℃保存。
2.转化取50μL感受态细胞，加入3μg线性化的DNA，再加入1ml溶液II，振荡混匀，30℃放置1小时，并且每15分钟摇动混合一次；42℃，10分钟，热激活；将转化液分成两管，每管中加入1ml YPD，30℃放置1小时；3000g室温离心5分钟，收集沉淀，沉淀重悬于500μL溶液III中，并将转化液合并成一管；同上离心，沉淀重悬于100-150μL溶液III中；将转化液涂布于YPDs平板上，30℃倒置培养2-4天待转化子出现。
C)电击转化法1.感受态细胞的制备接种宿主菌GS115或KM71于5ml YPD培养基中，30℃过夜培养；次日以0.02-0.1％的比例接种于200ml YPD中，继续培养至OD600为1.2-1.5；1500g 4℃离心5分钟，收集菌体，分别用200ml；、100ml用冰预冷的灭菌水和8ml用冰预冷的1mol/L山梨醇溶液洗涤沉淀，最后将沉淀重悬于0.4mL用冰预冷的1mol/L山梨醇溶液中，即得感受态细胞。制备好的感受态细胞始终置于冰上，当天使用，不能保存。
2.转化取80μL感受态细胞，加入5-10μg线性化的DNA(溶于5-10μL灭菌水中)，混匀，加到预冷的0.2cm电击杯中；冰浴5分钟；选取电压400V，电容20μF，电阻200Ω，时间5-10ms，电击；电击后迅速加入1mL用冰预冷的1mol/L山梨醇溶，30℃静置1-2小时；每份10-200μL涂布于YPDs平板上，30℃倒置培养2-4天待转化子出现。
D)酵母重组子的筛选1.直接PCR筛选法模板的制备挑取单个菌落，于YPD培养基中过夜培养，次日取10μL，加到1.5mL离心管中，加入5μL的5U/μL裂解酶，30℃温浴10分钟；再将样品于-70℃中冻10分钟；随后取5μL作为细胞裂解物模板。
PCR反应按照第一部分“标准PCR反应体系加入Taq酶和底物。反应程序为95℃ 1分钟变性，54℃ 1分钟退火，72℃ 1分钟延伸，共30个循环。反应结束后，琼脂糖凝胶电泳分析结果。
2.营养表型的确定用灭菌牙签挑取单个克隆，按照先MMH平板后MDH平板的顺序平行点板，以GS115/Albumin为Muts阴性对照，以GS115/pPICZ/lacZ为Mut+阳性对照。点好的平板于30℃温箱内倒置培养2天，观察、分析结果。
3.双层滤膜筛选法将经PCR鉴定确有VEGF基因整合的重组子点在灭菌的醋酸纤维素薄膜上，于丰富培养基BMGY平板上培养40小时，将此醋酸纤维素薄膜重叠放在灭菌的硝酸纤维素薄膜上，于诱导培养基BMMY平板上诱导培养60-72小时，取下硝酸纤维素薄膜，进行免疫印迹分析。
实施例4、重组蜱抗凝肽(rTAP)在酵母中的高密度发酵将保存的重组蜱抗凝肽工程菌种于平板上活化，转接于YPD液体培养基，30摄氏度、300rpm震荡培养至OD600值为5-25作为种子液上发酵罐。
发酵培养基为半合成培养基，配方如下85％的磷酸26.7ml/L，硫酸钙0.93g/L，硫酸钾18.2g/L，七水合硫酸镁14.9g/L，氢氧化钾4.13g/L，甘油40.0g/L，EDTA 0.8g/L，PTM1 6ml/L。其中PTM1的配方为五水合硫酸铜6.0g/L，碘化钾0.08g/L，硫酸锰3.0g/L，钼酸钠0.2g/L，硼酸0.02g/L，氯化钴0.5g/L，氯化锌20.0g/L，硫酸铁6.5g/L，生物素0.2g/L，硫酸5.0ml/L。
发酵过程采用二步生长法。在甘油培养阶段，起始生长以甘油为碳源，温度为26-32℃，pH值为5，空气流量为30L/min，经过18-24小时培养，菌浓度达到OD600＝120。补充甘油，甘油补液浓度为500g/L，补液速度为2-15ml/min，补料时间约4小时。补料完毕后，菌体浓度达到OD600＝160以上，在甘油培养末期，调节pH值为4。诱导表达阶段，甲醇补料至浓度为0.01-10％，溶氧控制为大于30％，诱导至48小时以上达到表达最高峰，放罐。此时菌体浓度OD600大于500，重组蜱抗凝肽表达量经SDS-PAGE分析，浓度大于4g/L。
菌体生长及诱导表达曲线如图1所示。
实施例5、重组蜱抗凝肽(rTAP)发酵后纯化方案I离心收集发酵上清，或以3000-100000截留量的超滤膜超滤法收集发酵上清。上清经1000-10000截留量的外压式中空纤维柱超滤浓缩、脱盐。浓缩上清调pH3.5-8后直接上CM阳离子交换柱，以pH3.5-8的50mM NaAC-HAC缓冲液平衡柱子，用0.01-0.8M NaCl盐梯度洗脱，收集目标蛋白峰A(参见图2)。
CM离子交换收集峰A经处理后再上DEAE离子交换柱，以pH3.5-8的50mM PB缓冲液平衡柱子，用0.01-0.8M NaCl盐梯度洗脱收集峰B，收集峰B过SepHacyl S-200柱脱盐。平衡液为pH6-8的5-100mM PB，用平衡液加0.01-0.100M NaCl洗脱收集目标峰C，见图3，即为精纯化的高纯度重组蜱抗凝肽。经RP-HPLC、SDS-PAGE分析，纯度大于97％，符合药用标准。Western Blot，N端和C端氨基酸分析证明制备的重组蜱抗凝肽的序列和结构完全正确。
实施例6、重组蜱抗凝肽(rTAP)的纯化制备方案II离心收集发酵上清，或以3000-100000截留量的超滤膜超滤法收集发酵上清。上清经1000-10000截留量的外压式中空纤维柱超滤浓缩、脱盐。浓缩上清调pH3.5-8后直接上DEAE阴离子交换柱，以pH3.5-8的10-50mM PB缓冲液平衡柱子，用0.01-0.8M NaCl盐梯度洗脱，收集目标蛋白峰A。
DEAE离子交换收集峰A经处理后再上CM离子交换柱，以pH3.5-8的10-50mM NaAC-HAC缓冲液平衡柱子，用0.01-0.8M NaCl盐梯度洗脱收集峰B，收集峰B过SepHacyl S-200柱脱盐。平衡液为pH6-8的5-100mM PB，用平衡液加0.01-0.100M NaCl洗脱收集目标峰C，见图4，即为精纯化的高纯度重组蜱抗凝肽。经RP-HPLC、SDS-PAGE分析，纯度大于97％，符合药用标准。Western Blot，N端和C端氨基酸分析证明制备的重组蜱抗凝肽的序列和结构完全正确。
实施例7、重组蜱抗凝肽(rTAP)生物活性检测经高密度酵母发酵后的上清可以直接用于生物学活性检测。实例5得到的发酵液经过10000rpm离心5分钟，用T-BSA(140mM NaCl，100mMTris pH7.4，0.1％BSA)稀释1000倍和10000倍，取100ul稀释液，加入50ul Xa因子(0.2ng/ul)混匀，用酶标仪读取波长405的吸收值作为本底，再加入50ul S-2765(1mg/ml)，37℃反应30分钟，再次读取波长405的吸收值，扣除本底后，与负对照(不加样品)作对比，可以发现稀释1000倍、10000倍样品与负对照有明显差异。
实施例8、重组蜱抗凝肽(rTAP)比活测定由于还没有rTAP的标准品，其比活测定采用与低分子量肝素国际标准品的比较来测定。低分子量肝素国际标准品抗Xa因子活性单位的标准曲线用CHROMOGENIX公司提供的试剂盒(COATEST LMWHeparin/Heparin)来制定。
AT购自CHROMOGENIX公司(25IU，11mg)，配制成1IU/ml。低分子量肝素标准品CHROMOGENIX公司(100IU/ul)取1ul加到100ul AT(1IU/ul)溶液中，混匀，按1.0IU，0.8IU，0.5IU，0.3IU，0.1IU配制好10ul标准品。
制定标准曲线及测定样品比活方法S-2732(与缓冲液按1∶3配制) 60ul标准品(或样品) 7.5ulXa因子(试剂盒提供) 60ul37℃反应8分钟加终止液(20％乙酸) 60ul检测，用A405的倒数对活力作图，得到标准曲线。(对应A405可计算出样品的活力，然后根据稀释倍数计算质量，二者的比值即为样品的比活。
比活单位AFXa IU/mg(抗Xa因子活性国际单位/毫克)。
样品处理样品浓度为1mg/ml。稀释倍数10000倍结果如表1和图5所示
表1
权利要求
1.一段选自下列物质组之一的寡核苷酸序列，其可用作引物扩增出重组蜱抗凝肽的基因序列①P1TCTCGAGAAAAGATGGAATAGGCTGTGTATTAAGCCTAGAAGATGGATTGATGAGT；②P2TGGAATAGGCTGTGTATTAAGCCTAGAAGATGGATTGATGAGTGTGATAGTAATGA；③P3CACAACCACCTTTACCGTTACGAAAATAGGCTCTTTCACCCCCTTCATTACTATCACACTC；④P4TAAAGGTGGTTGTGATTCCTTTTGGATCTGTCCGGAAGACCATACCGGTGCTGACTAT；⑤P5GATGCAAGCGTTGAAGCAGTCACGGTAGGAGGAGTAATAGTCAGCACCGGT。
2.根据权利要求1所述的寡核苷酸序列，其序列如下P1TCTCGAGAAAAGATGGAATAGGCTGTGTATTAAGCCTAGAAGATGGATTGATGAGT。
3.根据权利要求1所述的序列，其序列如下P2TGGAATAGGCTGTGTATTAAGCCTAGAAGATGGATTGATGAGTGTGATAGTAATGA。
4.根据权利要求1所的序列，其序列如下。P3CACAACCACCTTTACCGTTACGAAAATAGGCTCTTTCACCCCCTTCATTACTATCACACTC。
5.根据权利要求1所述的序列，其序列如下P4TAAAGGTGGTTGTGATTCCTTTTGGATCTGTCCGGAAGACCATACCGGTGCTGACTAT。
6.根据权利要求1所述的序列，其序列如下P5GATGCAAGCGTTGAAGCAGTCACGGTAGGAGGAGTAATAGTCAGCACCGGT。
7.一种在酵母中高效表达重组蜱抗凝肽的生产方法，包括①设计引物合成重组蜱抗凝肽的编码基因；②融合于酵母表达调控元件，构建甲醇酵母高表达工程菌；③运用甘油培养和诱导表达二步生长法，在酵母中高密度发酵表达重组蜱抗凝肽；④采用超滤、离子交换、分子筛柱层析等纯化技术的顺序组合，大量纯化回收重组蜱抗凝肽。
8.根据权利要求7所述的生产方法，其中所述引物为选自下列物质组之一的寡核苷酸序列①P1TCTCGAGAAAAGATGGAATAGGCTGTGTATTAAGCCTAGAAGATGGATTGATGAGT；②P2TGGAATAGGCTGTGTATTAAGCCTAGAAGATGGATTGATGAGTGTGATAGTAATGA；③P3CACAACCACCTTTACCGTTACGAAAATAGGCTCTTTCACCCCCTTCATTACTATCACACTC；④P4TAAAGGTGGTTGTGATTCCTTTTGGATCTGTCCGGAAGACCATACCGGTGCTGACTAT；⑤P5GATGCAAGCGTTGAAGCAGTCACGGTAGGAGGAGTAATAGTCAGCACCGGT。
9.根据权利要求7所述的生产方法，其中所述酵母表达调控元件包括AOX1启动子。
10.根据权利要求7所述的生产方法，其中所述的酵母是甲醇酵母P1-10。
11.根据权利要求7所述的生产方法，其中所述二步生长法包括在甘油培养阶段，将工程菌接种于以甘油或葡萄糖为碳源的半合成培养基上，在温度26-32℃，pH值3-6，下培养16-28小时，至甘油或葡萄糖耗尽，菌密度达到大于OD600＝160；在诱导表达阶段，溶氧浓度为15％-45％，以0.01-10％甲醇进行诱导。
12.根据权利要求11所述的生产方法，其中所述二步生长法包括在甘油培养阶段，在温度30℃，pH值为5的条件下进行培养；在诱导表达阶段，溶氧浓度为30％，以浓度为0.5-5％的甲醇进行诱导。
13.根据权利要求11或12所述的生产方法，其中甘油培养阶段的空气流量为30L/min，甘油培养阶段末期调节pH值为4。
全文摘要
本发明涉及一种在酵母中高效表达重组蜱抗凝肽的方法，包括设计引物合成重组蜱抗凝肽的编码基因；融合于酵母表达调控元件，构建甲醇酵母高表达工程菌；运用甘油培养和诱导表达二步生长法，在酵母中高密度发酵表达重组蜱抗凝肽；采用超滤、离子交换、分子筛柱层析等纯化技术的顺序组合，大量纯化回收重组蜱抗凝肽。本发明的方法能够大量生产重组蜱抗凝肽，产品能够达到药用标准。
文档编号C12N15/09GK1609115SQ200310100190
公开日2005年4月27日 申请日期2003年10月17日 优先权日2003年10月17日
发明者郑海发, 张永国, 张俊, 秦永发 申请人:北京华特森基因科技有限公司