专利名称：高效表达重组人胰高血糖素样肽-1(1-37)的基因工程菌及其构建方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种高效表达重组人胰高血糖素样肽-I (1-37)的基因工程菌及其构建方法和应用，属于生物工程技术领域。
背景技术：
截短型GLP-1( 7-37)是胰高血糖素原翻译加工后的产物，并由小肠L细胞分泌，它不仅能够依赖葡萄糖刺激胰岛素的分泌，抑制胰高血糖素的分泌从而降低餐后血糖水平，而且诱导P细胞的增殖和 胰岛新生、抑制P细胞的凋亡，此外，GLP-I (7-37)还能抑制胃蠕动，减少食欲。GLP-I (7-37)的这些功能使其成为治疗2型糖尿病的有效药物。胰高血糖素原在小肠中经加工先产生GLP-I (1-37)，然后在特定的蛋白酶的作用下切除上游6个氨基酸残基从而产生GLP-I (7-37)。目前大部分研究针对截短型GLP-I (7_37)的作用，GLP-I (1-37)的功能仍然不明确。最近，有研究发现GLP-I (1-37)能够抑制趋化因子诱导的人⑶-4淋巴细胞的迁移，也有研究证明GLP-I (1-37)能够将胎鼠小肠上皮细胞转化成分泌胰岛素的细胞。然而GLP-I (1-37)能否调节血糖这一功能还不清楚。本发明通过研究发现，提出一种重组人GLP-I (1-37)能够激活GLP-I受体(GLP-1R)，对动物体内血糖具有调节作用。另外，要研究重组人胰高血糖素样肽-I (1-37)的功能，则需要合成重组人胰高血糖素样肽-I (1-37)，目前国外对多肽的制备多采用化学合成的方法，其存在着难度大、合成成本高、纯化困难等缺陷。用现有方法制备的产品，价格昂贵。鉴于此，本发明提出一种通过基因工程的方法合成产量高、纯度较高的GLP-1( 1-37)，合成方法简便、原料便宜、适于大规模生产。
发明内容
为生产低成本的重组人胰高血糖素样肽-1(1-37)，首先得找到并构建一种高效表达人胰高血糖素样肽-I (1-37)，即能生产人胰高血糖素样肽-I (1-37)的基因工程菌。本发明的目的之一是提出一种高效表达重组人胰高血糖素样肽-I (1-37)的基因工程菌。该基因工程菌是携带重组质粒的大肠杆菌DH5 a、BL21 (DE3)，所述重组质粒是含人胰高血糖素样肽-I (1-37)，即GLP-I (1-37)基因的质粒pET32a(+)。其中，所述重组质粒是pET32a(+)-PT7-TrxA_6 XHis-GLP-I (1-37)，Pt7 是所述质粒pET32a(+)的启动子；TrxA是硫氧还蛋白；6XHis是组氨酸纯化标签。本发明的目的之一是提供一种高效表达重组人胰高血糖素样肽-I (1-37)的基因工程菌的构建方法。本发明通过采用以下技术方案解决以上技术问题。根据GLP-I (1-37)的氨基酸序列，设计引物，通过PCR扩增获得GLP-I (1-37) DNA序列，经双酶切，插入质粒pET32a(+)，构建成重组质粒pET32a-GLP-l (1-37)，转化大肠杆菌，获得高效表达重组人胰高血糖素样肽-I (1-37)的基因工程菌。本发明所述高效表达重组人胰高血糖素样肽-1(1-37)的基因工程菌的构建方法，包括以下具体操作步骤
第一步扩增获得GLP-I (1-37) DNA片段
委托专业的生物技术公司通过化学合成方法合成如下碱基序列P1-上游引物，引入GLP-I (1-6)基因序列，P2-上游引物，引入汝"/ II酶切位点和肠激酶EK位点，P3-下游引HWHind III酶切位点和终止密码子TAA。Pl-上游引物(39bp)序列为
5’ -CATGATGAATTTGAACGCCATGCCGAAGGCACCTTTACC-3’
GLP-I (1-6)基因序列
P2-上游引物(43bp)序列为
5’ - GGAGATCTGGACGACGACGACAAGCATGATGAATTTGAACGCC-3’
Bgl 11酶切位点肠激酶EK位点P3-下游引物(32bp)序列为
5， - GGAAGCTTGTTAGCCTCTGCCTTTCACCAGCC-3’
Hind III酶切位点终止密码子以质粒pET32a(+)-GLP-I (7-37)为模板，加入Pl-上游引物和P3-下游引物，使用ExTaq DNA聚合酶进行PCR扩增，用DNA纯化试剂盒纯化回收反应产物，然后以纯化的基因片段为模板，加入P2-上游引物和P3-下游引物进行再次PCR扩增，反应产物再用DNA纯化试剂盒回收，最终获得含有汝"/ W、Hind III、EK位点的GLP-I (1-37) DNA片段，序列如下
5’ ^GAGATCTC.GACGACGACG#￡MC CMCATGMTTTGAACGCCATGCCGMGGC CCTTWCAGC6ATCTG C.CAGCTATCTGfiMGGCC GCCGCCAMGMTrmTTGCCTCGCTGGTCMMWa 3AGG€TMCMGCTRX 胃 3,第二步构建含人胰高血糖素样肽-I (1-37)基因序列的基因工程菌
用两种限制性内切酶双酶切第一步获得的GLP-I (1-37) DNA片段，所述的两种限制性内切酶是汝"/ II取Hind III，纯化回收小片段，用同样两种限制性内切酶双酶切质粒pET32a(+)，纯化回收大片段，使用T4 DNA连接酶连接上述回收的小片段和大片段，得到含GLP-I (1-37) DNA片段的重组质粒pET32a⑴-GLP-1 (1_37)，将重组质粒pET32a(+)-GLP-I (1-37)转化到大肠杆菌DH5 a，制得含人胰高血糖素样肽-I (1-37)基因序列，即GLP-I (1-37) DNA序列的基因工程菌，将该基因工程菌委托专业的生物技术公司测序，证实该基因工程菌含完整的重组GLP-I (1-37)基因片段。第三步构建高效表达人胰高血糖素样肽-I (1-37)的基因工程菌
从第二步构建好的基因工程菌抽提重组质粒pET32a(+)-GLP-I (1_37)，转化到大肠杆菌BL21(DE3)，得到高效表达的人胰高血糖素样肽-I (1-37)的基因工程菌。上述构建涉及到的质粒pET32a(+)、大肠杆菌DH5a、BL21 (DE3)，限制性内切酶Bgl II,Hind III.Ex Taq DNA聚合酶和T4 DNA连接酶均可从市场购得。委托合成所述的碱基序列的生物技术公司是上海英骏生物技术有限公司，委托测序的生物技术公司是上海钼尚生物技术有限公司。本发明的目的之一是提出一种用所述基因工程菌生产人胰高血糖素样肽-I(1-37)的方法，具体操作步骤包括
第一步液体培养将上述构建好的高效表达人胰高血糖素样肽-I (1-37)的基因工程菌在LB液体培养基中培养至OD6tltlnm=O. 6 0. 8时，加入终浓度为0. 6 I. 0 mM的IPTG进行诱导表达4 h，生产和积累可溶性表达的人胰高血糖素样肽-I (1-37)融合蛋白。第二步纯化制得的人胰高血糖素样肽-I (1-37)融合蛋白
离心收集菌体，用缓冲液重悬菌体，超声破菌后，离心收集上清，进行亲和层析，收集人胰高血糖素样肽-I (1-37)的融合蛋白组分，用截留分子量为IOKDa Amicon Ultra-15超滤管将蛋白浓缩至2 5 mg/mL。第三步制备重组人胰高血糖素样肽-I (1-37)
用肠激酶EK酶解人胰高血糖素样肽-I (1-37)融合蛋白，25°C降解12h，终止反应，再次进行亲和层析，收集穿透峰，冷冻干燥，获得重组人胰高血糖素样肽-I (1-37)。本发明的目的之一是提供重组人胰高血糖素样肽-I (1-37)在制备预防或治疗糖尿病的药物中作药物活性成分的应用。本发明的目的之一是提供一种药物组合物，所述组合物含有有效量的重组人胰高血糖素样肽-I (1-37)以及药学上可接受的成分。本发明的优点包括以下方面
通过本发明基因工程技术的方法生产重组人胰高血糖素样肽_1( 1-37)，比化学合成的方法生产重组人胰高血糖素样肽-I (1-37)成本低；
通过本发明基因工程技术的方法构建含人胰高血糖素样肽-I (1-37)基因的基因工程菌，大大提高了人胰高血糖素样肽-I (1-37)的表达量；
只要进行一次亲和层析，便可从发酵液中得到较纯的人胰高血糖素样肽-I (1-37)融合蛋白，纯化步骤简便，比传统技术的多次层次更易于操作；
只要进行一次酶解便能得到重组人胰高血糖素样肽-I (1-37)，纯化极为简便，得率
闻;
通过基因工程技术的方法生产的重组人胰高血糖素样肽-I (1-37)具有降低血糖水平的作用。因而用本发明基因工程菌生产重组人胰高血糖素样肽-I (1-37)，产量高，纯化工艺简便，生产成本较低，本发明制备得到的人胰高血糖素样肽-I (1-37)具有降糖生物学活性。
图I是重组质粒pET32a (+) -GLP-I (1-37)的构建及GLP-1 (1-37)表达纯化的示意图。图2是重组人胰高血糖素样肽-I (1-37)的分离纯化和酶切结果图。图3是重组人胰高血糖素样肽-I (1-37)的降血糖活性图。其中，图3 (A)所示为腹腔注射糖耐量折线图，图3 (B)所示为腹腔注射糖耐量曲线下面积图。图4是GLP-I激动GLP-IR的检测结果图。其中，图4(A)所示为不同浓度的GLP-I(1-37)对GLP-I受体的激活率，图4 (B)所示为不同浓度的GLP-I (7-37)对GLP-I受体的激活率。
具体实施例方式以下结合附图和实施例进一步详细说明本发明。说明书和实施例中凡未注明具体条件的实验方法，按常规条件进行。实施例I构建一种高效表达人胰高血糖素样肽-I ( 1-37)的基因工程菌 第一步GLP-I (1-37) DNA序列的扩增
委托专业的生物技术公司化学合成如下碱基序列P1—上游引物，引入GLP-I (1-6)基因序列，P2-上游引物，切}KBgl II酶切位点和肠激酶EK位点，P3-下游引物，OlindIII酶切位点和终止密码子TAA。Pl (39bp)
5’ -CATGATGAATTTGAACGCCATGCCGAAGGCACCTTTACC-3’
GLP-I (1-6)基因序列 P2 (43bp)
5’ - GGAGATCTGGACGACGACGACAAGCATGATGAATTTGAACGCC-3’
Bgl 11酶切位点肠激酶EK位点 P3 (32bp)
5， - GGAAGCTTGTTAGCCTCTGCCTTTCACCAGCC-3’
Hind III酶切位点终止密码子以质粒pET32a(+)-GLP-I (7-37)为模板，加入引物Pl和P3，使用Ex Taq DNA聚合酶进行PCR扩增，反应产物用DNA纯化试剂盒纯化回收，然后以纯化的基因片段为模板，加入P2和P3进行再次PCR扩增，反应产物再用DNA纯化试剂盒回收，最终获得含有汝"/ W、HindIII、EK位点的GLP-I (1-37) DNA片段。两次PCR的反应体系如下
权利要求
1.一种高效表达重组人胰高血糖素样肽-I (1-37)的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是携帯重组质粒的大肠杆菌DH5 a、BL21 (DE3)，所述重组质粒是含人胰高血糖素样肽-I (1-37)的质粒 pET32a(+)。
2.根据权利要求I所述的基因工程菌，其特征在于，所述重组质粒是pET32a(+)-Pt7-TrxA-6XHis-GLP-I (1-37)，其中，Pt7是所述质粒pET32a(+)的启动子；TrxA是硫氧还蛋白；6 X Hi s是组氨酸纯化标签。
3.ー种根据权利要求I或2所述的基因工程菌的构建方法，其特征在干，包括以下步骤 第一歩扩增获得GLP-I (1-37) DNA片段 通过化学合成方法合成如下碱基序列P1-上游引物，引入GLP-I (1-6)基因序列，P2-上游引物，引入汝7 II酶切位点和肠激酶EK位点，P3-下游引物，引入沿·/ ゴIII酶切位点和終止密码子TAA ;所述Pl-上游引物、P2-上游引物、P3-下游引物序列如下 Pl-上游引物5’ -CATGATGAATTTGAACGCCATGCCGAAGGCACCTTTACC-3’ P2-上游引物5，-GGAGATCTGGACGACGACGACAAGCATGATGAATTTGAACGCC-3> P3-下游引物5’ -GGAAGCTTGTTAGCCTCTGCCTTTCACCAGCC-3’ 以质粒pET32a(+) -GLP-I (7-37)为模板，加入所述Pl-上游引物和P3-下游引物，使用Ex Taq DNA聚合酶进行PCR扩增，用DNA纯化试剂盒纯化回收反应产物，然后以纯化的基因片段为模板，加入P2-上游引物和P3-下游引物进行再次PCR扩增，反应产物再用DNA纯化试剂盒回收，获得含有取·/ II、沿/ ゴIII、EK位点的GLP-I (1-37) DNA片段； 第二步构建含人胰高血糖素样肽-I (1-37)基因序列的基因工程菌用限制性内切酶汝7 II取Hind III双酶切第一步获得的所述GLP-I (1_37)DNA片段，纯化回收小片段，用限制性内切酶汝7 II取Hind III双酶切质粒pET32a(+)，纯化回收大片段，使用T4 DNA连接酶连接所述回收的小片段和大片段，得到含GLP-I (1-37) DNA片段的重组质粒pET32a (+) -GLP-I (1-37);将重组质粒pET32a (+) -GLP-I (1-37)转化到大肠杆菌DH5ci，制得含人胰高血糖素样肽-I (1-37)基因序列的基因工程菌，经测序证实所述基因工程菌含完整的重组GLP-I (1-37)基因片段； 第三步构建高效表达人胰高血糖素样肽-I (1-37)的基因工程菌从第二步构建好的基因工程菌抽提重组质粒pET32a(+)-GLP-I (1_37)，转化到大肠杆菌BL21 (DE3)，得到高效表达的人胰高血糖素样肽-I (1-37)的基因工程菌。
4.一种用权利要求I或2所述的基因工程菌生产重组人胰高血糖素样肽-I (1-37)的方法，其特征在于，包括以下步骤 第一歩液体培养 将所述高效表达人胰高血糖素样肽-I (1-37)的基因工程菌在LB液体培养基中培养至OD6tltlnm=O. 6 O. 8时，加入IPTG使其终浓度为O. 6 I. O mM进行诱导表达4 h，生产和积累可溶性表达的人胰高血糖素样肽-I (1-37)融合蛋白； 第二步纯化制得的人胰高血糖素样肽-I (1-37)融合蛋白 离心收集菌体，用缓冲液重悬菌体，超声破菌后，离心收集上清，进行亲和层析，收集人胰高血糖素样肽-I (1-37)的融合蛋白组分，用截留分子量为IOKDa Amicon Ultra-15超滤管将蛋白浓缩至2-5 mg/mL ；第三步制备重组人胰高血糖素样肽-I (1-37) 用肠激酶EK酶解人胰高血糖素样肽-I (1-37)融合蛋白，25°C降解12h，終止反应，再次进行亲和层析，收集穿透峰，冷冻干燥，获得重组人胰高血糖素样肽-I (1-37)。
5.根据权利要求4所述方法制备的重组人胰高血糖素样肽-I(1-37)在制备治疗糖尿病的药物中的应用。
6.一种组合物，其特征在于，所述组合物含有有效量的根据权利要求4所述方法制备的人胰高血糖素样肽-I (1-37)，以及药学可接受的成分。
全文摘要
本发明公开了一种高效表达重组人胰高血糖素样肽-1(1-37)的基因工程菌，该基因工程菌是携带重组质粒的大肠杆菌DH5α、BL21(DE3)，所述的重组质粒是含人胰高血糖素样肽-1(1-37)的质粒pET32a(+)。本发明还公开了该基因工程菌的构建方法以pET32a(+)-GLP-1(7-37)为模板，根据GLP-1(1-37)基因的碱基设计引物，PCR扩增获得基因GLP-1(1-37)，经酶切，插入质粒pET32a(+)中，构建重组质粒pET32a(+)-GLP-1(1-37)，并转化大肠杆菌获得。本发明所制备的重组人胰高血糖素样肽-1(1-37)具有良好的降血糖作用。本发明方法具有生产重组人胰高血糖素样肽-1(1-37)成本低、重组人胰高血糖素样肽-1(1-37)表达量高、纯化步骤简便，易于操作，得率高等优点。
文档编号C12N1/21GK102660491SQ201210155539
公开日2012年9月12日 申请日期2012年5月18日 优先权日2012年5月18日
发明者劳勋, 吴自荣, 李冬青, 赵丽芬, 黄静 申请人:华东师范大学