一种口蹄疫病毒非结构蛋白基因3abc及其制备方法与应用的制作方法

专利名称：一种口蹄疫病毒非结构蛋白基因3abc及其制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及动物病毒学技术领域。具体涉及一种新的含有口蹄疫病毒非结构蛋白基因3ABC的重组大肠杆菌菌株(Escherichia coli BL21/pKG3ABC)，利用该菌株表达口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC，并建立酶联免疫吸附试验(ELISA)鉴别诊断方法，用于区分口蹄疫灭活疫苗免疫动物与野毒感染动物。本发明提供含有口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC基因的融合表达质粒(pKG-3ABC)、重组大肠杆菌菌株(Escherichiacoli BL21/pKG3ABC)、3ABC蛋白的表达与纯化方法以及用该蛋白建立的可区分口蹄疫灭活疫苗免疫动物与野毒感染动物的鉴别诊断方法。
背景技术：
口蹄疫(Foot-and-mouth disease，FMD，下文称之为FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease，FMDV，下文称之为FMDV)感染引起的人及偶蹄动物共患的一种烈急性、高度接触性、发热性传染病。口蹄疫在世界上许多国家流行，近年来在亚洲流行尤为严重。发生口蹄疫的国家进出口贸易受到严格限制，影响该国家或地区的外汇收入，造成重大的经济损失和政治影响。国际兽医局(OIE)和联合国粮农组织(FAO)将口蹄疫列为A类烈性传染病之首。
FMDV属于小RNA病毒科(Picornaviridae)，口蹄疫病毒属(Aphthovirus)，该病毒基因组为单股正链RNA，长约8500个核苷酸，由5’非翻译区(URT)、3’非翻译区和一个开放阅读框(ORF)构成。开放阅读框包含L蛋白基因、结构基因(P1区)和非结构基因(P2、P3区)等。P3区含有3A、3B、3C、3D四种基因和一个终止密码子，其聚合蛋白裂解后产生3A，3个3B、3C和3D共6个蛋白。
由于FMD是世界各国密切关注的最重要的动物传染病。不同的国家或地区采取不同的控制政策，发达国家往往通过捕杀感染动物及同居动物、可疑畜群来控制和消灭本病。而发展中国家多采用注射常规疫苗的方法控制该病的流行。
感染FMD后康复和亚临床感染的动物都可以携带病毒而不表现临床症状，但可引起新的口蹄疫爆发。在采取捕杀政策的国家，如何检测隐性感染动物；在采取注射疫苗预防的国家，如何区分野毒感染动物和注苗动物是控制和消灭该病的关键。因而建立有效的鉴别诊断方法以区别注苗动物和野毒感染动物、检测隐性感染动物就成为口蹄疫防制技术研究的重要课题。
目前用于口蹄疫检测的方法可以分为抗原检测和抗体检测方法两大类。前者主要包括病毒分离鉴定、RT-PCR、核酸杂交等，该类方法检测周期长、技术、设备要求高，不适用于临床大规模检测；后者主要指血清学检测方法，主要包括琼脂扩散试验(AgarDiffusion Test；ADT)、补体结合试验(Complement Fixation Test；CFT)、病毒中和试验(Virus Neutralization Test；VNT)、间接凝集试验(Indirect Hemagglutination Test；IHA)、全病毒酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked Immunosorbent Assay；ELISA)等，该类方法操作较前者简单易行，适合临床大规模的抗体监测，其不足是不能区分灭活疫苗免疫动物和野毒感染动物。因为常规的ELISA或病毒中和试验是检测口蹄疫病毒的结构蛋白的抗体。结构蛋白的抗体既可以通过免疫获得，也可以由野毒感染而引起。因此这些方法只能用于动物口蹄疫病毒抗体水平的监测，在及时发现野毒感染，清除野毒感染动物方面显的无能为力。
现在发展中国家主要用口蹄疫灭活疫苗对本病进行防疫。由于口蹄疫灭活疫苗的成分主要是纯化的灭活病毒粒子，疫苗免疫动物后，动物体内不会有病毒增殖，因而也就无病毒非结构蛋白的表达，动物体内也没有抗非结构蛋白抗体产生。而野毒感染动物体内则有病毒的增殖，病毒在增殖过程中非结构蛋白也得到了表达，其中的一些非结构蛋白具有免疫原性，引起动物体产生抗非结构蛋白的抗体(Tesar等，VirusGenes.1989，3(1)29-44)。.动物体这种抗体差异，为建立检测隐性带毒动物，区别注苗动物和野毒感染动物的鉴别诊断方法提供了理论依据。
在口蹄疫病毒的非结构蛋白中，L蛋白的免疫力较弱，并不是所有感染动物都产生L蛋白的抗体，即使产生抗体的动物，其体内L蛋白抗体的存留期也比较短(Mackay等，Vaccine.1998，16(5)446-459)。利用其他非结构蛋白的抗体来鉴别免疫动物与感染动物已有不少报道。有的是采用几种非结构NS蛋白联合使用(Bergmann等，Am.J.Vet.Res.1993，54825-831；Berger等，Vaccine.1990，8(3)213-216；Mackay等，)；有的是用单一非结构蛋白，如2C(Lubroth等，Vet Q.1998b，20 Suppl 2S9-11)或单一多聚蛋白如3ABC(Rodriguez.A.等，Virology.1992，189(1)363-367；DeDiego M等，Arch Virol.1997；142(10)2021-2033)等。
Lubroth和Brown曾认为2C是区分注苗动物和感染动物的标志；Meyer等(JVirol Methods.1997，65(1)33-43)用昆虫杆状病毒表达的2C进行ELISA检测也得到了较好的效果；但是Mezenico等(Vet Q，1998，20Suppl 211-13)研究表明2C抗体在动物体内(牛、猪)的衰减要比3ABC抗体快，而且偶尔也在注苗牛体内检测到2C的抗体。2B可引起感染动物产生抗体，并证明它含有一个B细胞抗原位点。但没有建立可重复的方法来检测2B的抗体。
在单个NS蛋白中，多聚蛋白3ABC的抗体是检测FMDV感染的最可靠指标。由于不同毒株的3ABC基因变异较小，以3ABC聚蛋白作为诊断抗原，检出的机率大，结果更可靠。许多研究都集中于建立检测3ABC抗体的方法。几乎所有的文章都一致认同3ABC抗体作为感染标记的可靠性。Mezenico等(Vet Q，1998，20Suppl2s11-13)实验证明，感染过FMDV的牛至少一年以后都能检测出3ABC的抗体；Sorensen等(Vet Q，1998，20Suppl 217-20)在感染过的牛中进一步确证了这个结果；Malirat等(Vet Q，1998，20Suppl 224-26)比较了3ABC-ELISA和EITB(Enzymelinked Immunoelectrotransfer Blot；EITB)鉴别感染动物的效果，证明3ABC-ELISA方法是可靠的，认为3ABC-ELISA是进行大规模检测的有效方法，阳性或可疑样品可通过其他方法进一步证实。Brocchi等(Vet Q，1998，20Suppl 2S20-24)在A型口蹄疫流行时的实验表明，3ABC抗体阳性的动物都表现出临床症状，而注射疫苗的动物，无论何种疫苗何种佐剂、免疫过几次，3ABC抗体都是阴性。
目前我国在口蹄疫的临床抗体检测中用的ELISA检测方法是用灭活的口蹄疫全病毒包被酶标板制备酶标抗原。该方法存在病毒灭活不彻底，从而造成活病毒逃逸、扩散的潜在危险。
鉴于口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC的上述特性，利用该蛋白研制出快速、准确、安全、廉价的鉴别口蹄疫免疫动物与野毒感染动物的诊断试剂盒，将为口蹄疫的防制和消灭提供有效工具。

发明内容
本发明目的之一是提供编码口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC基因的cDNA序列。
本发明目的之二是提供一种可以特异性表达口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC的重组大肠杆菌。该菌株由原核表达载体经转化大肠杆菌感受态细胞后筛选得到，它经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷诱导后可以特异性表达口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC，为ELISA鉴别诊断方法提供抗原。
本发明的目的之三是提供一种表达及纯化口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC的方法。
本发明的目的之四是提供一种快速、准确、安全、廉价的区分口蹄疫免疫动物与野毒感染动物ELISA鉴别诊断方法及鉴别诊断试剂盒的制备方法，为我国口蹄疫的防制和消灭提供一种新型工具。
本发明通过以下技术方案实现一种包含口蹄疫病毒非结构蛋白基因3ABC并能表达该基因的重组的大肠杆菌株Escherichia coli BL21/pKG3ABC，保藏在CCTCC，保藏日期2003年9月12日，保藏编号M203068，其中所说的非结构蛋白基因3ABC含有如序列表SEQ ID No1所示的cDNA序列。
一种口蹄疫病毒的非结构蛋白基因3ABC的cDNA序列，其特征在于，它的cDNA序列如序列表SEQ ID No1所示。
所述的一种包含口蹄疫病毒非结构蛋白基因3ABC并能表达该基因的重组大肠杆菌的制备方法，它包括下列步骤1)以分离的口蹄疫病毒基因组为模板，通过RT-PCR方法扩增得到口蹄疫病毒非结构蛋白基因3ABC的cDNA序列；2)原核表达载体pGEX-KG(Vet Q，1998，20Suppl 224-26)的BamHI和Xba I多克隆位点定向插入口蹄疫病毒非结构蛋白基因3ABC的cDNA序列，构建得到原核表达载体pKG-3ABC；3)将步骤2)所说的原核表达载体pKG-3ABC转化至大肠杆菌BL21感受态细胞，用氨苄青霉素抗性筛选单个重细菌，该菌株经诱导可以特异性地表达口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC；4)将步骤3)所述的表达的3ABC蛋白质进行纯化。
所说的口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC纯化的具体步骤包括挑取单个重组大肠杆菌BL21/pKG-3ABC菌落至LB培养基，加氨苄青霉素至终浓度为50μg/mL，37℃摇床培养12小时后放4℃冰箱过夜；用含50μg/mL氨苄青霉素的LB培养基将该菌液按1∶100比例稀释后，分装至细菌培养瓶中，置37℃摇床培养至OD600≅0.6,]]>用0.4mmol/L的异丙基硫代-β-D-半乳糖苷进行诱导，每30分钟取样100μl，诱导3.5小时后进行SDS-PAGE电泳分析，诱导的菌体经离心、超声波破碎后提取包涵体，经PEG纯化、透析后分装于-20℃保存备用。
所述的一种包含口蹄疫病毒非结构蛋白基因3ABC并能表达该基因的重组大肠杆菌，其特征在于所述的口蹄疫病毒非结构蛋白基因3ABC特异性蛋白在口蹄疫上的防治。
区分口蹄疫野毒感染动物与灭活疫苗免疫动物的鉴别诊断方法的应用2)利用所说的口蹄疫非结构蛋白3ABC建立酶联免疫吸附试验；3)用步骤1)所说的方法制备用于口蹄疫鉴别诊断的试剂盒。
更详细的技术方案如下所述1、口蹄疫病毒非结构蛋白基因3ABC的克隆以分离的口蹄疫病毒基因组为模板，通过RT-PCR扩增得到3ABC基因的cDNA，经测序分析确定该3ABC基因的cDNA序列如序列表SEQ IDNo1所示。
2、原核表达载体pKG-3ABC的构建将口蹄疫病毒非结构蛋白基因3ABC的cDNA序列定向插入到原核表达载体pGEX-KG(Vet Q，1998，20Suppl 224-26)的BamHI和Xba I多克隆位点定。
3、重组大肠杆菌Escherichia coli BL21/pKG3ABC的构建将2所述的原核表达载体转化至大肠杆菌BL21感受态细胞，经氨苄青霉素抗性筛选得到阳性重组菌株。该菌株保藏在保藏在CCTCC，保藏日期2003年9月12日，保藏编号M203068。
4、口蹄疫病毒非结构蛋白基因在大肠杆菌BL21中的表达及表达蛋白的纯化方法将3所述的重组大肠杆菌Escherichia coli BL21/pKG3ABC在LB液体培养基中培养，经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导，Western-blot分析，证实该重组大肠杆菌可以特异性地表达口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC，表达的蛋白以包涵体的形式存在大肠杆菌BL21中，且具有免疫学活性。
5、区分口蹄疫野毒感染动物与灭活疫苗免疫动物的3ABC-ELISA鉴别诊断方法的建立与鉴别诊断试剂盒的制备经离心破碎BL21细胞，从4中所述的包涵体中纯化3ABC表达蛋白。用该蛋白包被ELISA酶标板制备ELISA抗原酶标板。用空白对照菌(Escherichia coli BL21/pKG)诱导产物制备血清稀释液，按照普通ELISA方法检测待检血清。根据反应后的吸光值确定阴性、可疑、阳性的判断临界值。按照如下的配方配置包被液、洗涤液、封闭液、底物缓冲液、TMB母液、终止液。按以下配比制备包被液(25mmol/L碳酸盐缓冲液)Na2CO31.59g，NaHCO32.93g，ddH2O加至1000mL(pH9.6)。
洗涤液(含0.05％Tween-20的PBS溶液)NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na2HPO4·12H2O 2.9g，KH2PO40.2g，Tween-20 0.5mL，ddH2O加至1000mL(pH7.4)。
封闭液0.2g牛血清白蛋白(BSA)溶于100mL洗涤液。
底物缓冲液(磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液)0.2mol/L Na2HPO425.7mL，，0.1mol/L柠檬酸24.3mL加ddH2O 50mL(pH5.0)。
TMB母液0.2g TMB干粉溶于100mL的无水乙醇中配制而成。
底物液(TMB)(新鲜配制)TMB母液用底物缓冲液按1∶20的比例稀释，每毫升底物液加入0.2μL 30％H2O2。
终止液(0.025％HF)HF(40％)625μL，ddH2O 100mL将3ABC抗原酶标板、口蹄疫野毒感染标准阳性血清、灭活疫苗免疫标准阴性血清、包被液、洗涤液、封闭液、底物缓冲液、TMB母液、终止液组装成3ABC-ELISA鉴别诊断试剂盒。
本发明的有益效果1、本发明的有益效果之一是生物安全性高。本发明所涉及到的原核表达载体pGEX-KG是分子生物学中常用的原核表达载体，没有生物危险性，在此基础上构建的原核表达载体pKG-3ABC也没有任何生物危险性。重组大肠杆菌BL21/pKG-3ABC是将原核表达载体pKG-3ABC转化至分子生物学中常用的大肠杆菌BL21感受态细胞后经氨苄青霉素抗性筛选获得，也不具生物危险性。本发明所用的抗原酶标板是用口蹄疫病毒的非结构蛋白制备的，制备过程中不涉及口蹄疫活病毒，因此没有口蹄疫活病毒逃逸、扩散的潜在危险。
2、本发明的有益效果之二是生产成本低。本发明所提供的口蹄疫鉴别诊断方法和诊断试剂盒所需抗原是口蹄疫病毒的非结构蛋白。该蛋白可以通过重组大肠杆菌BL21/pKG-3ABC在体外得到大量的表达，适合大规模的生产。而目前常用的口蹄疫全病毒ELISA诊断方法和诊断试剂盒的抗原是用口蹄疫全病毒制备的，需要大量的增殖活病毒，所需生产设备、生产工艺和生产成本较高。
3、本发明的有益效果之三是可以提供区分口蹄疫野毒感染动物和灭活疫苗免疫动物鉴别诊断方法和鉴别诊断试剂盒。本发明ELISA鉴别诊断方法和试剂盒所用抗原为口蹄疫病毒非结构蛋白。由于口蹄疫灭活疫苗免疫未感染口蹄疫病毒的动物后，被免疫动物体内无活病毒的增殖，故无口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC的产生，也就无抗非结构蛋白3ABC抗体的产生，而口蹄疫野毒感染动物体内有口蹄疫活病毒的增殖，病毒在增殖的过程中会转录翻译出非结构蛋白3ABC，动物机体就会产生抗非结构蛋白3ABC的抗体。因此用口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC作为ELISA酶标抗原可以与抗非结构蛋白3ABC抗体发生特异性结合，从而达到鉴别诊断口蹄疫灭活疫苗免疫动物和野毒感染动物的效果。目前我国临床上使用的常规ELISA诊断方法和试剂盒其ELISA抗原是用灭活的口蹄疫全病毒制备的。该方法检测的是口蹄疫病毒的抗体。由于无论是灭活疫苗免疫动物还是野毒感染动物，都会产生抗口蹄疫病毒的抗体。因此常规的ELISA诊断方法和试剂盒不能达到本发明鉴别诊断的目的。
4、本发明的有益效果之四是提供的鉴别诊断试剂盒使用方便。本发明在提供了鉴别诊断方法的基础上，还将该方法所需的各种试剂组装成试剂盒，操作简单易行，非常适合口蹄疫的临床大规模检测。
序列表、附图及说明序列表SEQ ID No1是本发明的口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC的cDNA序列。


图1显示了表达口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC基因表达载体pKG-3ABC物理图谱及构建流程图。
图2显示的是诱导表达的口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC的SDS-PAGE电泳图。
图3显示的是诱导表达的口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC的Western-blot检测结果。
图4显示的是在同一块酶标板上进行的阴阳血清方阵滴定的效果照片。
具体实施例方式
实施例1口蹄疫病毒非结构蛋白基因3ABC cNDA序列的克隆在长满单层的仓鼠肾传代细胞(BHK)上接种口蹄疫病毒，待80％细胞出现细胞病变时收集病毒。以提取的口蹄疫病毒RNA为模板，通过RT-PCR扩增口蹄疫病毒非结构蛋白基因3ABC cDNA。RT-PCR所用引物根据D.K.J Mackay等(Vaccine.1998，16(5)446-459)报道的FMDV的基因组序列设计，其序列如下P15’-TGGATCCATGATTTCAATCCCTTCC-3’(上游引物)P25’-GCGAATTCATCACTCGTGGTGTGG-3’(下游引物)RT-PCR反应体系为模板RNA 8μL，2×Reaction buffer 25μL，P1、P2引物各1.0(终浓度为10pmol/L)，Taq/mix 1.0μL，加DEPC处理水至50μL。RT-PCR反应条件为50□30分钟，94□1分钟；然后65□退火1分钟，72□延伸1分30秒，共35个循环，最后72□延伸10分钟。将RT-PCR产物回收、纯化，与克隆载体pMD18-T连接后，转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆子(命名为pT-3ABC)，小量提取质粒，经酶切鉴定后测序得到3ABC的cDNA全序列(如序列表SEQ ID No1所示)。
实施例2口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC基因原核表达载体的构建用BamHI和Xba I分别酶切pT-3ABC和载体pGEX-KG，回收3ABC基因和载体pGEX-KG；然后用T4 DNA ligase连接，16□水浴过夜，转化DH5α感受态细菌，37□培养，从中随机挑选多个单菌落，分别放入LB液体培养基中37℃培养12小时后从中提取质粒，经酶切鉴定后筛选得到阳性重组质粒，并命名为pKG-3ABC。
实施例3重组大肠杆菌Escherichia coli BL21/pKG3ABC和Escherichia coli BL21/pKG的构建将重组表达载体pKG-3ABC转化至大肠杆菌BL21感受态细胞，涂布LB/氨苄青霉素(Amp)平皿，挑选多个单菌落放入LB液体培养基中37℃培养12小时后分别用异丙基硫代-D-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达，然后进行SDS-PAGE和Western-blot检测，从中筛选出能够在大肠杆菌BL21中诱导表达口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC的重组大肠杆菌Escherichiacoli BL21/pKG3ABC。
同时，将载体pGEX-KG同步转化至大肠杆菌BL21细胞，按以上方法在大肠杆菌BL21中诱导表达，筛选出无口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC表达的空白对照重组大肠杆菌菌Escherichia coli BL21/pKG。
实施例4最佳诱导物浓度及最佳诱导时间的确定挑取单个重组大肠杆菌Escherichia coli BL21/pKG3ABC菌落至3mL LB培养基，加氨苄青霉素(Amp)至终浓度为50μg/mL，37℃摇床培养12小时后放4℃冰箱过夜。用含50μg/mL氨苄青霉素(Amp)的LB培养基将该菌液按1∶100比例稀释后，分装至5支细菌培养瓶中(3mL/瓶)，置37℃摇床培养至OD600≅0.6,]]>加入诱导剂异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)至终浓度分别为0.2、0.4、0.6、0.8和1.0mmol/L，继续培养3h后，等量取样进行SDS-PAGE。根据3ABC蛋白表达情况确定IPTG最佳诱导浓度为0.4mmol/L。
挑取单个重组大肠杆菌BL21/pKG-3ABC菌落至3mL LB培养基，加氨苄青霉素(Amp)至终浓度为50pg/mL，37℃摇床培养12小时后放4℃冰箱过夜。用含50μg/mL氨苄青霉素(Amp)的LB培养基将该菌液按1∶100比例稀释后，分装至5支细菌培养瓶中(3mL/瓶)，置37℃摇床培养至OD600≅0.6,]]>以最佳诱导物浓度(IPTG浓度为0.4mmol/L)进行诱导，每30分钟取样100μl，共诱导5小时后进行SDS-PAGE电泳分析，根据3ABC表达情况确定最佳诱导时间为3.5小时。
实施例5口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC的大量诱导表达和蛋白纯化挑取单个重组大肠杆菌Escherichia coli BL21/pKG3ABC菌落至3mL LB培养基，加氨苄青霉素至终浓度为50μg/mL，37□摇床培养至混浊，放4□冰箱过夜。取该菌液2mL加入200mL含50μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，置37□摇床培养至OD600≅0.6,]]>加入诱导剂IPTG至终浓度为0.4mmol/L，继续诱导培养3.5小时。
离心收集诱导后的菌体，用细菌裂解液重悬，-40℃速冻1小时，超声波破碎2-3分钟，至溶液为透明。4℃离心后弃上清，用少许TE溶液(pH7.4)轻轻洗涤沉淀。
加入原细菌培养液体积1/10的包涵体变性溶液，用吸管吹打沉淀或搅拌，静置1-2h，使其沉淀缓慢溶解。4℃ 12000转离心10min，弃沉淀，取上清，加入PEG4000至0.2％(W/V)、氧化型谷光苷肽至1mM、还原性谷光苷肽2mM，静置至少30min后，转至处理好的透析袋中，于TE溶液(pH7.4)或PBS溶液(pH7.4)中透析2-3d，取出立即使用或分装至1.5mL管，-20℃或-40℃保存备用细菌裂解液配方Tris-Cl 50mM/L、EDTA 0.5mM/L、NaCl 50mM/L、Glycerol 5％(W/V)、DTT 0.5mM/L(使用前加入)。
包涵体变性溶液细菌裂解液+SKL 0.3％(W/V)。
实施例6口蹄疫病毒3ABC-ELISA鉴别诊断试剂盒构成及制备方法1、3ABC-ELISA试剂盒包括抗原酶标板2块、10×洗涤液50mL、阴阳血清各500μL、10×血清稀释液50mL、底物液各50mL、终止液25mL、二抗工作液50mL。
2、ELISA 相关溶液配方包被液(25mmol/L碳酸盐缓冲液)Na2CO31.59g，NaHCO32.93g，ddH2O加至1000mL(pH9.6)。
洗涤液(含0.05％Tween-20的PBS溶液)NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na2HPO4·12H2O 2.9g，KH2PO40.2g，Tween-20 0.5mL，ddH2O加至1000mL(pH7.4)。
封闭液0.2g牛血清白蛋白(BSA)溶于100mL洗涤液。
底物缓冲液(磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液)0.2mol/L Na2HPO425.7mL，，0.1mol/L柠檬酸24.3mL加ddH2O 50mL(pH5.0)。
TMB母液0.2g TMB干粉溶于100mL的无水乙醇中配制而成。
底物液(TMB)(新鲜配制)TMB母液用底物缓冲液按1∶20的比例稀释，每毫升底物液加入0.2μL 30％H2O2。
终止液(0.025％HF)HF(40％)625μL，ddH2O 100mL3、抗原酶标板的制备将上述实施例5制备的3ABC蛋白用所说的包被液按1∶40稀释，按100μL/孔加入到酶标板中，置37℃1h后放入4℃冰箱过夜；弃包被液，加入所说的封闭液(200μL/孔)于37℃封闭1h；弃封闭液，于37□1h；弃封闭液，风干；将酶标板放入专用锡泊袋，加一小袋干燥剂，抽真空，热压封口。
4、血清稀释剂的制备将空白对照菌(BL21/pGEX-KG)作同步诱导，离心收集菌体，TEN溶液(pH7.4)洗涤1次，加入原培养物体积1/10的PBS溶液(pH7.4)重悬，-40℃速冻1h，超声波破碎至透明(2-3min)；取该溶液20mL，加入封闭液80mL，即为血清稀释液。
实施例7口蹄疫病毒3ABC-ELISA检测步骤及判断标准从4℃冰箱中取出试剂盒，平衡各组分至室温。按需要量将10×洗涤液和10×血清稀释液用双蒸是水稀释为工作液。将待检血清、阴性血清及阳性血清用血清稀释液按1∶40稀释后加入到酶标板中(100μL/孔)置37℃45min。用所说的洗涤剂洗涤酶标板4次，每次200μL，甩干。加入酶标二抗，每孔100μL，置37℃30min。用洗涤剂洗涤酶标板6次，每次200μL，甩干。每孔加入底物液100μL，37℃作用10min。每孔加入50μL所说的终止液，轻轻振荡终止反应，置酶标仪，0D630测吸光值。判断标准OD630≥3.5为阳性，疑为口蹄疫感染；OD630＜3.5为阴性。
试验结果显示，利用口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC基因表达抗原，建立的ELISA检测方法可以快速、准确地区分口蹄疫免疫动物与野毒感染动物。
尽管本发明的内容是结合本实施例进行说明，但是不能认为是对本发明范围的限制，本发明的范围由所附权利要求书限定。另外，本领域的技术人员在所附权利要求书限定的范围内对本发明进行各种改动或修饰，这些改动或修饰形式同样落在本发明的保护范围内。
口蹄疫病毒非结构蛋白基因3ABC的cDNA序列<110>华中农业大学<120>一种口蹄疫病毒非结构蛋白基因3ABC及其制备方法与应用<130>
<141>2003-09-28<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1317<212>DNA<213>口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus)
<220>
<221>gene<222>(1)..(1317)<223>
<400>1atgatttcaa tcccttccca aaaggctgtg ctgtactttc tcattgagaa gggccagcac 60gaagcagcaa ttgaattctt tgaggggatg gtgcatgact ccatcaagga ggagctccgg 120cctctcatcc aacagacctc atttgtgagg cgcgctttta agcgcttgaa ggaaaacttt 180gagatagttg ccctgtgttt gactcttttg gcaaacatag tgatcatgat ccgcgagact 240cgcaagagac agcagatggt ggatgatgca gtgaacgagt acgttgagaa ggcaaacatc 300accacggatg acaagactct cgacgaggcg gaaaagaacc ctctggagac cagcggtgtc 360accactgttg gttttagaga gaaaactctc ccgggacaca aggcgagtga tgacgtggac 420tctgagcccg ccaaacccgt ggaagaacaa ccacaagctg aaggacccta taccggtcca 480ctcgagcgtc aaagacctct gaaagtgaga gccaagctcc cacagcagga gggaccctat 540gctggcccga tggagaggca gaaaccgctg aaagtgaaag tgaaagcccc ggtcgttaag 600gaaggacctt acgaaggacc ggtgaagaaa cctgtcgctt tgaaagtgaa agcaaagaac 660ttgattgtca ctgagagtgg tgctcccccg actgacttgc aaaagatggt catgggtaac 720accaagcctg ttgagctcat cctcgacggg aagacggtgg ccatctgctg cgccaccgga 780gtgtttggta ctgcttacct tgtccctcgt catcttttcg cagagaagta ttacaaaatc 840atgttggatg gcagagccat gacagacagt gactacagag tgtttgagtt cgagattaaa 900gtgaaaggac aggacatgct ctcagacgcc gcgctcatgg tgctccaccg tgggaatcgc 960gtgcgggaca tcacgaagca cttccgtgat gtggcaagaa tgaagaaagg cacccccgtc1020gttggcgtga tcaacaacgc tgatgttggg agactgatct tctccggtga ggcccttacc1080tacaaggaca ttgtagtgtg catggatgga gacaccatgc ccggtctctt cgcctacaaa1140gccgccacca aggcgggtta ctgtggagga gccgttcttg caaaggacgg agccgagact1200ttcatcgtcg gcactcactc cgcaggcggc aatggggtcg gatactgctc atgcgtttcc1260aggtccatgc tgtttaaaat gaaggcacac atcgatcccg aaccacacca cgagtga 131权利要求
1.一种包含口蹄疫病毒非结构蛋白基因3ABC并能表达该基因的重组的大肠杆菌株Escherichia coli BL21/pKG3ABC，保藏在CCTCC，保藏日期2003年9月12日，保藏编号M203068，其中所说的非结构蛋白基因3ABC含有如序列表SEQ ID No1所示的cDNA序列。
2.一种口蹄疫病毒的非结构蛋白基因3ABC的cDNA序列，其特征在于，它的cDNA序列如序列表SEQ ID No1所示。
3.实现权利要求l所述的一种包含口蹄疫病毒非结构蛋白基因3ABC并能表达该基因的重组大肠杆菌的制备方法，其特征在于1)以分离的口蹄疫病毒基因组为模板，通过RT-PCR方法扩增得到口蹄疫病毒非结构蛋白基因3ABC的cDNA序列2)在原核表达载体pGEX-KG的BamHI和XbaI多克隆位点定向插入口蹄疫病毒非结构蛋白基因3ABC的cDNA序列，构建得到原核表达载体pKG-3ABC；3)将步骤2)所说的原核表达载体pKG-3ABC转化至大肠杆菌BL21感受态细胞，用氨苄青霉素抗性筛选单个重组菌，该菌株经诱导可以特异性地表达口蹄疫病毒非结构蛋白基因3ABC4)将步骤3)所述的表达的3ABC蛋白质进行纯化。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，表达蛋白质纯化的具体步骤包括挑取单个重组大肠杆菌BL21/pKG-3ABC菌落至LB培养基，加氨苄青霉素至终浓度为50μg/mL，37℃摇床培养12小时后放4℃冰箱过夜用含50μg/mL氨苄青霉素的LB培养基将该菌液按1∶100比例稀释后，分装至细菌培养瓶中，置37℃摇床培养至OD600≅0.6,]]>用0.4mmol/L的异丙基硫代-β-D-半乳糖苷进行诱导，每30分钟取样100μl，诱导3.5小时后进行SDS-PAGE电泳分析，诱导的菌体经离心、超声波破碎后提取包涵体，经PEG纯化、透析后分装于-20℃保存备用。
5.权利要求1或2所述的一种包含口蹄疫病毒非结构蛋白基因3ABC并能表达该基因的重组大肠杆菌，其特征在于所述的口蹄疫病毒非结构蛋白基因3ABC特异性蛋白在口蹄疫上的防治。
6.权利要求l的区分口蹄疫野毒感染动物与灭活疫苗免疫动物的鉴别诊断方法，其特征在于1)利用所说的口蹄疫非结构蛋白3ABC建立酶联免疫吸附试验；2)用步骤1)所说的方法制备用于口蹄疫鉴别诊断的试剂盒。
全文摘要
本发明涉及口蹄疫病毒的非结构蛋白基因3ABC；用该基因构建的原核表达载体；将该载体转化至大肠杆菌BL21而筛选得到的重组表达菌株(Escherichia coli BL21/pKG3ABC)；利用该表达菌株表达口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC及其表达蛋白的纯化方法；利用表达蛋白建立的酶联免疫吸附试验(ELISA)鉴别诊断方法。发明所包括的重组表达菌株Escherichia coli BL21/pKG3ABC，保藏在CCTCC，保藏日期2003年9月12日，保藏编号CCTCCM203068。
文档编号C12N1/21GK1605629SQ20031010011
公开日2005年4月13日 申请日期2003年10月9日 优先权日2003年10月9日
发明者陈焕春, 顾贫, 曹胜波, 钱平, 唐勇, 金梅林, 吴斌, 方六荣, 刘正飞, 吕建强 申请人:华中农业大学