专利名称：促进胶原蛋白生物合成的中药复方及其提取物制备方法
技术领域：
本发明涉及促进胶原蛋白合成的中药复方及其提取物的制备方法，以及它们在化妆品、皮肤科药物中的应用。该复方由中药丹参、黄芪和当归构成，能够刺激胶原蛋白特别是I型胶原蛋白和III型胶原蛋白的合成。
背景技术：
胶原是一种由真皮产生和分泌的不溶性蛋白，皮肤真皮含有大约90%的胶原蛋白，其中I型胶原占皮肤总胶原蛋白的70-90%，其余大约10-30%的皮肤总胶原蛋白主要是 III型胶原蛋白。胶原具有支撑皮肤结构、提供细胞生存环境以及保湿的功能，在维持皮肤弹性方面起重要作用。为了维持皮肤弹性，胶原的产生和降解必须以正常的方式进行。当皮肤受到某些特定外界影响，如紫外线照射、干燥时，胶原蛋白会丢失；当衰老和处于压力状态下时，皮肤中的胶原蛋白也会丢失；同时发现这些外界影响和/或衰老能引起皮肤细胞 (主要是成纤维细胞)中胶原蛋白的合成减少，这些都与皮肤老化及皮肤皱纹的形成紧密相关。保持一定数量的胶原蛋白以及表现良好的胶原蛋白合成能力对保持健康皮肤是很重要的。另外，胶原还在创伤愈合中起重要作用，通过促进受伤表皮内的胶原合成可以迅速地无疤痕地愈合创伤。传统上，利用胶原的润肤作用和创伤愈合作用，通过混合胶原和皮肤外用组合物获得的产品，例如化妆品和软膏被带入市场。然而，由于这些产品中的胶原是大分子，不能仅通过涂在皮肤上被皮肤吸收。因此，不能期望它们体现有效的润湿和愈合创伤作用。为了解决该问题，可促进胶原合成的物质的研发越来越受到关注。对于胶原的生物合成，已有维生素C和某些植物提取物(例如大豆提取物、石榴提取物、葡萄籽提取物等)被用作化妆品中的活性组分。综上所述，促进胶原生物合成的物质是明显合适、并且可实际地用于改善皮肤状态的化妆品中的。
发明内容
本发明的发明者通过许多研究发现组合中药材丹参、黄芪和当归而提取的化合物组合对胶原蛋白，特别是I型和III型胶原蛋白的合成具有显著的刺激活性，因而特别适用于对抗皮肤老化以及改善伤口愈合。具体而言，本发明的目的之一是提供具有胶原合成促进作用的药材组合及其提取物的制备方法，该药材组合包括丹参、黄芪和当归。本发明的另一目的是将上述的药材组合用作一种促进胶原蛋白合成的外用制剂， 提供一种在防止或治疗皮肤老化或改善伤口愈合中具有良好效力的化妆品或药物组合物。 更具体而言，上述组合物可用于预防或治疗因光化学原因或自发(按年月顺序)发生的皮肤老化作用；可用于促进皮肤组织系统的形成；可用于愈合皮肤伤口。
本发明的再一目的涉及下列促进胶原蛋白合成的方法包括在皮肤上施用丹参、 黄芪、当归组合而提取的化合物组合；在培养基中添加此提取物以促进成纤维细胞的胶原
蛋白产生量。此处使用的术语“丹参、黄芪、当归组合而提取的化合物组合”指从丹参、黄芪、当归的各种器官和部位(如叶、花、根、茎、枝、树皮和果实)；优选从根、茎、枝和果实；更优选从根和枝；最优选从根获得的提取物。根据示例方法，如下所示可获得提取物
(a)称取下列中药材作原料
丹参10-100重量份、黄芪15-75重量份、当归15-50重量份；
(b)用醇将丹参、黄芪、当归浸泡M小时后超声提取1小时，过滤分离滤液和滤渣，收集滤液，用醇将滤渣再浸泡M小时后超声提取1小时，过滤分离滤液和滤渣，合并两次滤液；
(c)两次滤液合并后经大孔树脂以50%乙醇进行洗脱，经浓缩干燥得到活性提取物；
(d)直接把活性提取物加入附加剂，制成各种剂型。此外，其他常规溶剂可以用于制备丹参、黄芪、当归组合提取物，并且与上述溶剂显示相同的效果，对于本领域普通技术人员是显然的。根据本发明的丹参、黄芪、当归组合提取物包括通过公知的方法进行额外纯化的提取物。本发明的提取物包括使用各种额外的纯化方法获得的活性提取物，如使用规定的分子量截取值的超滤和各种色谱法(根据大小、电荷、疏水性和亲水性而设计的用于纯化)。根据本发明的丹参、黄芪、当归组合提取物可以通过如冻干法和喷雾干燥的附加方法被粉碎。以构建的药物筛选模型证明丹参、黄芪、当归组合提取物在细胞学水平上以 0. 03mg/mL的浓度即能够增加成纤维细胞中胶原合成基因的表达。在本发明的框架内，将丹参、黄芪、当归组合提取物掺入到化妆品和药物上可接受的、特别是皮肤科可接受的赋形剂、载体中。这样的载体是本领域技术人员熟知的，并且也可见于如下述有通用范围的化妆品组合物或药物组合物，特别是皮肤科药物组合物的实施例中。除丹参、黄芪、当归组合提取物外，本发明的化妆品组合物可以包含辅剂以及载体。辅剂的非限制例子包括防腐剂、抗氧化剂、稳定剂、增溶剂、维生素、色素、香味改良剂、 或这些组分的混合物。本发明的化妆品组合物可以以多种形式被制剂，其非限制的例子包括溶液、悬浮液、乳液、软膏、凝胶、乳霜、洗剂、粉末、皂剂、含表面活性剂的清洁剂、油剂、粉底霜、乳液底霜、蜡剂底霜和喷雾剂。详细地，可以以皮肤软化剂(皮肤洗剂)、收敛洗液、营养乳液、营养面霜、按摩霜、香精、眼霜、清洁霜、清洁泡沫、清洁水和面膜、喷雾剂和粉末的形式提供本发明的化妆品组合物。本发明的化妆品组合物中包含的化妆品可接受的载体可以根据制剂的类型变化。 例如，软膏剂、糊膏剂、面霜剂和凝胶剂可以包含动物和植物脂肪、蜡、石蜡、淀粉、黄芪胶、 纤维素衍生物、聚乙二醇、硅酮、膨润土、甲硅烷、滑石粉、氧化锌、或这些组分的混合物。在粉末或喷雾制剂中，其可以包含乳糖、滑石粉、甲硅烷、氢氧化铝、硅酸钙、聚酰胺粉末和这些组分的混合物。喷雾剂可以额外地包含常规的推进剂，例如，氯氟代烃、丙烷或丁烷。
溶液和乳液制剂可以包含溶剂、增溶剂和乳化剂，如水、乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、 苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1，3_ 丁二醇、油类，具体地，包含棉籽油、花生油、玉米胚芽油、 橄榄油、蓖麻油、和芝麻油、甘油脂肪酸酯、聚乙二醇、山梨聚糖的脂肪酸酯或这些组分的混合物。悬浮液制剂可以包含液体稀释剂，例如水、乙醇、丙二醇；悬浮剂，例如乙氧化异硬脂醇类、聚氧化乙烯山梨醇酯和聚氧化乙烯山梨聚糖酯；微结晶纤维素；偏氢氧化铝； 膨润土 ；琼脂和黄芪胶；或这些组分的混合物。具有表面活性剂的清洁组合物制剂可以包含脂肪醇硫酸酯、脂肪醇醚硫酸酯、磺基琥珀酸单酯、咪唑啉衍生物、甲基牛磺酸酯、甘草酸酯、脂肪酸酰胺醚硫酸酯、烷胺甜菜碱、脂肪醇、脂肪酸甘油酯、脂肪酸二乙醇胺、植物油、羊毛脂衍生物、乙氧化甘油脂肪酸酯或这些组分的混合物。本发明还特别涉及使用丹参、黄芪、当归组合提取物作为改善成纤维细胞培养过程中I型和/或III型胶原蛋白合成之培养基的成分。该制剂可用于任何成纤维细胞培养基中。从下列几个实施例的解释性描述将会进一步了解本发明的其他目的、特征和优点，这些实施例只是举例说明本发明，因而不能以任何方式限制本发明的范围。
图1示经过丹参、黄芪、当归组合提取物处理后，HFF细胞中胶原相关基因在mRNA 水平上发生的变化。A为pro- α 1 ( I )基因在0. 03mg/mL提取物作用48小时后在mRNA水平上发生的变化；B为pro- α 2 ( I )基因在0. 03mg/mL提取物作用48小时后在mRNA水平上发生的变化；C为pro- α 1 (III)基因在0. 03mg/mL提取物作用48小时后在mRNA水平上发生的变化。p<0. 05 ； p<0. 01 及 p<0. 001 与对照(0.3% DMS0)相比。图2示经过丹参、黄芪、当归组合提取物处理后，NIH3T3细胞中胶原相关基因在 mRNA水平上发生的变化。A为pro-α 1( I )基因在0. 03mg/mL提取物作用48小时后在mRNA 水平上发生的变化；B为pro- α 2 ( I )基因在0. 03mg/mL提取物作用48小时后在mRNA水平上发生的变化；C为pro- α 1 (III)基因在0. 03mg/mL提取物作用48小时后在mRNA水平上发生的变化。p<0. 05 ； p<0. 01 及 p<0. 001 与对照(0.3% DMS0)相比。
具体实施例方式以下特定的实施例旨在解释本发明，而不应理解为限定本发明的范围。实施例1
证明丹参、黄芪、当归组合提取物在人前皮肤成纤维细胞(Human Foreskin Fibroblasts, HFF)中对I型和III型胶原蛋白生物合成的促进作用 A.方法 Α. 1.药物测试
在60mm培养皿中接种HFF细胞，培养M小时，待细胞融合度至80% 90%，小心移除培养液，加入含所述丹参、黄芪、当归组合提取物(终浓度0. 03mg/mL)的新鲜培养液(对照加同体积溶剂)培养48小时后以TRIzoI —步法提取总RNA。同时以已知的另一化合物组合(终浓度0. 03mg/mL)作为阴性对照。A. 2.细胞总RNA的提取
按每IX IO7Cell加入1 mL Trizol试剂，反复吹打，使细胞裂解，冰上孵育5分钟。加 Λ 0. 2ml氯仿/1 mL Trizol，剧烈振荡15秒，冰上孵育3分钟。4°C，13，OOOXg离心15分钟，吸取上层水相至一新的RNase-free的离心管中，加入0. 5 mL异丙醇，上下混勻，冰上放置30分钟，13，000乂8，41离心15分钟，弃上清，每1 mL TRIZOL试剂加入Iml 75%的乙醇，振荡，13，000X g，4°C离心10分钟，弃上清于室温下干燥，溶于20 50 μ L DEPC处理水，测OD值定量，以Α260/Α^0，Α260/Α230比值判断RNA样品是否有蛋白、苯酚的污染，以甲醛琼脂糖变性凝胶鉴定RNA的完整性。Α. 3.逆转录合成cDNA第一链
在 RNase-free 的 200 μ L 离心管中加入 Oligo-dT 及 IOmM dNTP 各 1 μ L、1 μ gRNA,以 DEPC水补至12 μ L，65°C加热5分钟，迅速置于冰上。加入5 X RT Buffer 4 μ L,0. 1 M DTT 2 μ L 和 Recombinant Ribonuclease inhibitor 1 μ L，轻弹混勻，短暂离心，37°C孵育 2 分钟。加入1 μ L M-MLV Reverse ^Transcriptase，反应总体积为20 yL，混勻后37°C孵育 50分钟。70°C加热15分钟灭活逆转录酶的活性。离心后-20°C保存备用。A.4.实时定量荧光PCR扩增目的片段
先将模板cDNA的含量调整一致，分别取5 μ L模板，加入IOXBuffer 2 μ L、dNTP (2. 5mM) 1. 5 μ L、Mg2+(25mM) 2 μ L、20XEvagreenl μ L、ROX Reference DyeO. 5 μ L、上游弓| 物(Pl)和下游引物(P2)各2 μ L,Platium Taq DNA聚合酶0. 5 μ L，加去离子水补足体积至 20 μ L，将反应混合物置于 Applied Biosystems 7300 Real-time PCR 仪中。PCR 参数 940C 10分钟；94°C 15秒，60°C 30秒，72°C 45秒，40个循环，在每个循环72°C延伸45秒时读取荧光值；循环结束后，机器以0. 1°C/秒的速度从60°C升至95°C，从而得到产物的融解曲线，以帮助分析产物的单一性及排除引物二聚体。反应结束后各取10 μ L PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。Α. 5.统计方法
以2_Δ Δετ方法分析实时定量荧光PCR结果，分析其中mRNA的表达差异。B.所得到的结果
应用上述方法研究丹参、黄芪、当归组合提取物对HFF细胞中I型和III型胶原蛋白合成之刺激作用的影响。图1给出了每毫升含有丹参、黄芪、当归组合提取物所侧得的结果。已知每股成熟I型胶原由α 1 ( ι )与2d (I)胶原纤丝以二比一的比例构成，而每股成熟III胶原由α (III)胶原纤丝构成同源三聚体。结果显示丹参、黄芪、当归组合提取物对pro-α (1)与？1~0-2(1 ( I)基因的表达均有显著的促进作用(图1Α，1Β)，pro-α ( I )的表达为对照组的1. 92倍，pro-2 α ( I )的表达为对照组的1. 78倍。结果显示丹参、黄芪、当归组合提取物对III型胶原的构成成分pro-α 1 (III)的表达也有明显的促进作用(图1C)，pro-α 1 (III)的表达为对照组的1. 53倍。实施例2
证明丹参、黄芪、当归组合提取物在小鼠胚胎成纤维细胞(Mouse Embryo Fibroblasts, NIH3T3)中对I型和III型胶原蛋白生物合成的促进作用Α.方法
与实施例1中促进HFF中I型和III型胶原蛋白生物合成的实验方法相同。B.所得到的结果
如图2所示，在丹参、黄芪、当归组合提取物存在下，小鼠胚胎成纤维细胞(ΝΙΗ3Τ3)中 I型和III型胶原蛋白的生物合成受到促进。pro-α (I)的表达为对照组的2. 44倍(图 2A)，pro-2 α ( I )的表达为对照组的1. 89倍(图2B),pro-a 1 (III)的表达为对照组的4. 03 倍(图2C)。下面给出各种化妆品或药物组合物，但以下制剂是说明性的，而本发明的化妆品组合物或药物组合物不受其限制。使用上文中描述的提取方法获得丹参、黄芪、当归组合提取物。制剂1 润肤夜(皮肤软化剂)
如下表所示，配制一个含有丹参、黄芪、当归组合提取物的润肤液的例子:
权利要求
1.一种用于促进胶原蛋白生物合成的中药复方及其提取物，由丹参、黄芪和当归组合而成。
2.应用丹参、黄芪和当归组合提取物或其中存在该提取物制备促进胶原蛋白，特别是 I型和III型胶原蛋白生物合成的化妆品或药物组合物特别是皮肤科药物组合物，其包含 (a)作为活性组分的丹参、黄芪和当归组合提取物；和(b)化妆品或药物特别是皮肤科药物可接受的载体。
3.根据权利要求2的应用，特征在于所说的化合物组合可用于防止或治疗皮肤老化作用。
4.根据权利要求2的应用，特征在于所说的化合物组合可用于促进皮肤组织系统的形成。
5.根据权利要求2的应用，特征在于所说的化合物组合可用于愈合皮肤伤口。
6.根据权利要求2至5中任何一项的应用，特征在于基于组合物的总重量，丹参、黄芪和当归组合提取物的浓度为0. 0001至20% (重量)，较好为0. 001至5% (重量)。
7.根据权利要求2的化妆品组合物，其中，所述组合物为选自溶液、悬浮液、乳液、糊齐 、软膏、凝胶、霜剂、洗剂、粉末、皂剂、含表面活性剂的清洁剂、油剂、粉底霜、乳液底霜、蜡剂底霜和喷雾剂之一的形式。
8.使用丹参、黄芪和当归组合提取物或其中存在该提取物作为促进I型和III型胶原蛋白合成的制剂。
9.根据权利要求7的应用，特征在于使用丹参、黄芪和当归组合提取物或其中存在该提取物作为成纤维细胞培养基的成分。
10.根据权利要求1至8中任何一项的应用，特征在于所说的提取物是用常规溶剂从丹参、黄芪和当归中提取制得的。
11.美容处理哺乳动物，特别是人的方法，特征在于给所说的哺乳动物使用美容有效量的丹参、黄芪和当归组合提取物或其中存在有该提取物，以刺激胶原蛋白特别是I型和III 型胶原蛋白的生物合成，特别是促进皮肤组织系统的合成或强化皮肤。
12.促进I型和III型胶原蛋白生物合成的方法，特征在于向成纤维细胞培养基中引入丹参、黄芪和当归组合提取物或其中存在有该提取物。
全文摘要
本发明涉及用于促进胶原蛋白特别是Ⅰ型和/或Ⅲ型胶原蛋白生物合成的中药复方及其提取物制备方法，由丹参、黄芪和当归组合而成。应用丹参、黄芪、当归组合而提取的化合物组合或含有该提取物制备的美容或医药组合物，以促进胶原蛋白的生物合成。给哺乳动物特别是人使用所述的美容或医药组合物，以促进胶原蛋白的合成。还公开了促进成纤维细胞生长培养基中胶原蛋白生物合成的方法。
文档编号C12N5/071GK102526183SQ20101059762
公开日2012年7月4日 申请日期2010年12月21日 优先权日2010年12月21日
发明者何农跃, 李智洋 申请人:南京龙梁生物科技有限公司