专利名称：塔式蚯蚓生态滤池复合填料微生物群落结构分析方法
技术领域：
本发明涉及到利用DNA提取试剂盒和PCR-DGGE技术，对塔式蚯蚓生态滤池中的多级复合填料(土壤、砂石、碎青石)中的微生物群落组成进行分析检测，属于环境微生物分子生态学领域。
背景技术：
塔式蚯蚓生态滤池是一种根据蚯蚓具有提高土壤透水性能和促进有机物质分解转化的生态学功能而设计的一种生物、生态相结合技术，因为脱氮除磷能力强、运行费用低、无污泥产生等优点，在农村生活污水处理领域应用广泛。为了提高废水处理性能和稳定性，人们对塔式蚯蚓生态滤池的运行条件和污染物去除机理进行了大量研究。废水处理过程中主要是依赖土壤、砂石和碎青石中的微生物群落来降解和转化污染物，但由于研究技术和手段的缺乏，人们对塔式蚯蚓生态滤池中微生物群落研究甚少，只好通过控制和监控塔式蚯蚓生态滤池的物化参数来实现废水的无害化排放。但这些物化条件的改变是否破坏微生物群落结构，能否长期稳定的达到废水的高效处理，都是工程师们和微生物学家热衷的问题。因此需要对参与废水处理的微生物群落中各个种群的组成、丰度、分布及其在环境中生理生化特性进行全面研究，确定出塔式一级蚯蚓生态滤池、塔式二级蚯蚓生态滤池和塔式三级蚯蚓生态滤池在废水处理过程中的优势微生物种群。以此为基础改变操作条件，以适应废水生物处理中涉及的微生物的生长，优化塔式蚯蚓生态滤池废水处理效率。目前自然界中只有很少部分微生物能够被分离和纯化，因此传统的微生物培养和鉴定方法不足以代表微环境中的真实情况。rRNA基因同源分析方法是目前分子生物学研究的热点，是多种分子生物学技术的组合，它通过对微生物的rRNA进行分析，揭示微生物的多样性，是分子微生物生态学的重要方法，目前取得了大量的成果。同源性分析方法中包括环境样品的总DNA提取，探针及引物的设计，PCR扩增，梯度电泳(DGGE&TGGE)，基因文库的筛选，序列测定及分析，系统树的构建，原位杂交等技术。rRNA基因分析方法是微生物多样性及微生物生态学研究方法的重大革新，使人们对微生物群体有全面的，进一步的认识。(denaturing gradient gelelect rophoresis) ^^ 才目同但是序列不同的DNA片断的混合物，对于特异性引物PCR扩增的环境微生物的16SrDNA基因，一般的电泳很难将序列不同的片断分开，DGGE胶在聚丙烯酰胺胶中添加了线性梯度的变性剂，可以形成从低到高的线性梯度，在一定的温度下，同一浓度的变性剂中，不同序列的产物，其部分解链程度不同，DNA解链程度不同决定其电泳的迁移率，结果不同的产物在凝胶上分离开。在变性条件适当的情况下，该技术能分辨一个碱基对，DGGE在微生物群落结构的研究，微生物种群的动态分析，富集培养物以及分离物的分析，16SrDNA同源性的分析中得到广泛应用。目前有利用DGGE技术分析污水厂污泥和工业废水处理中的微生物群落的专利申请，但是用来处理农村生活污水的塔式蚯蚓生态滤池填料复杂，微生物种类繁多，所以这方面的研究较少。
发明内容
本发明的目的是提供一种塔式蚯蚓生态滤池复合填料微生物群落组成的检测技术，即填料中DNA的提取，总DNA的PCR再经DGGE分离DNA条带，分离的DNA再次PCR后测序进而对塔式蚯蚓生态中多种填料如土壤、砂石和碎青石中微生物群落组成进行检测的技术。本发明技术方案是①塔式蚯蚓生态滤池不同填料层取多种填料进行预处理，利用DNA提取试剂盒提取基因组总DNA ；②设计16S rDNAV3 区引物 R3F和 1387R(—次PCR) ；338F-GC和 518R(二次PCR)]对样品DNA进行巢式PCR扩增；③利用变性梯度凝胶电泳即DGGE技术分析PCR扩增产物，得到的DGGE图谱利用Quantity one软件分析；④特征DGGE条带切割回收，样品DNA再次PCR后测序分析，判定微生物种类；步骤①中，样品的预处理取塔式蚯蚓生态滤池少量的土壤、砂石和碎青石放入无菌带，放入冷冻干燥仪冷冻干燥后用研钵研磨，最后过100目的塞子，无菌带分装放入-20°c中冷藏备用。DNA提取采用Ultra Clean Soil DNA isolation KIT试剂盒，具体步骤是称量0. 5g预处理完的填料样品加到Bead Solution Tubes中，然后分别加60ul的SolutionSl和200ul的^S solution在漩涡仪上漩涡15min ；IOOOOg离心30s上清液转移到2mlCollection Tubes 中，加 250ul Solution S2 漩涡 5s 然后 4°C下静置 5min ；IOOOOg 离心 Imin 上清液转移到 2mlCollection Tubes 中加 1. 3ml Solution S3 后漩涡，取 700ul溶液转移到Spin Filter中IOOOOg离心lmin，弃掉过滤液，再取700ul溶液按上步骤操作直到Collection Tubes中的液体转移完；把Spin Filter中的硅胶柱转移到新的2mlCollection Tubes中，加入50ul Solution S5到硅胶柱的白色滤膜上，IOOOOg离心30s，DNA 转移到了 Collection Tubes 中。步骤②中，使用16S rDNAV3区设计引物对提取的DNA进行扩增，一次PCR扩增条件为预变性94°C 5min,然后94°C变性45s，55°C退火lmin，72°C延伸4 共30个循环，最后在72°C下延伸lOmin。二次PCR扩增条件为预变性95°C lOmin，然后95°C变性lmin，63°C退火2min，72°C延伸lmin共30个循环，最后在72°C下延伸lOmin。步骤③中，DGGE分析PCR扩增产物的条件为制备变性剂尿素浓度梯度50% -75%，丙烯酰胺凝胶浓度为10%的变性梯度凝胶电泳(DGGE)，电泳电压90V，电泳时间12h，二溴乙锭染色15min，脱色25min。步骤④中特征条带回收DNA再次PCR，PCR引物为338F和518R，扩增条件预变性940C lOmin，然后94°C变性lmin，62°C退火2min，72°C延伸Imin共30个循环，最后在72°C下延伸lOmin。根据DGGE分离后的条带经测序并在Genbank中比对，判断其代表的微生物种类。本发明的有益效果利用PCR-DGGE技术，初步判定出塔式蚯蚓生态滤池复合填料的微生物群落组成。
①可以确定土壤、砂石和碎青石中的优势微生物②分析判断出塔式蚯蚓生态滤池中一级、二级、三级土壤中微生物种群的变化，相应的可以确定砂石和碎青石中的微生物群落变化③与污染物质去除率联合分析，分别确定出对有机物、氮和磷去除作用最大的微生物种类。
图1复合填料DNA提取琼脂糖电泳2复合填料一次PCR产物琼脂糖电泳3复合填料二次PCR产物琼脂糖电泳4复合填料PCR产物DGGE电泳图
具体实施例方式1、填料样品收集、预处理用IOcm 8cm的无菌带收集塔式蚯蚓生态滤池一级、二级、三级中的土壤(10cm)、砂石(5cm)和碎青石(3cm)填料50g左右，收集后在-80°C下冷冻干燥5天。冷冻干燥后的填料样品用消过毒的研钵研磨，然后用100目的塞子过塞，过塞后分装到新的无菌带中在-20°C中冷藏。2、DNA提取、纯化称量0.5g预处理完的填料样品加到Bead Solution Tubes中，然后分别加60ul的Solution Sl和200ul的IRS solution在漩涡仪上漩涡15min ； IOOOOg离心30s上清液转移到 2mlCollection Tubes 中，加 250ulSolution S2 漩涡 5s 然后 4°C下静置 5min ；IOOOOg 离心 Imin 上清液转移到 2mlCollection Tubes 中加 1. 3mlSolution S3 后漩涡，取700ul溶液转移到Spin Filter中IOOOOg离心lmin，弃掉过滤液，再取700ul溶液按上步骤操作直到Collection Tubes中的液体转移完；把Spin Filter中的硅胶柱转移到新的2mlCollection Tubes中，加入50ul Solution S5到硅胶柱的白色滤膜上，IOOOOg离心30s，DNA 转移到了 Collection Tubes 中。DNA的提取液中加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(25 24 1)，颠倒混勻，12000rpm 4°C离心20min，收集上清液；加入0. 1倍体积3M NaAc (ρΗ5· 2)，颠倒混勻，再加入0. 6倍体积异丙醇4°C沉淀DNA Ih ；沉淀后12000rpm 4°C离心20min，弃上清液，DNA沉淀用冷的70%乙醇洗涤2次，冷冻干燥后溶于50 μ 1灭菌TE缓冲液中。 3、总DNA巢式PCR扩增用移液枪依次将试剂加入0. 2mlEP管中，加入顺序如下无菌水 34. 75ul，IObuffer 5ul, MgCl2 (25mM) 4ul, dNTPs (2. 5mM)4ul, primerone(25mM) Iul, primer two (25mM) Iul, Taq 酶(5U/ul)0. 25ul，模板 DNAlul。每次试验，以同体积无菌dd水代替样品DNA做阴性对照，操作均在冰上进行。使用16S rDNA V3区设计引物对提取的DNA进行扩增，一次PCR扩增条件为预变性94°C 5min,然后94°C变性45s，55°C退火lmin，72°C延伸4 共30个循环，最后在72°C下延伸lOmin。二次PCR扩增条件为预变性95°C lOmin，然后95°C变性lmin，63°C退火2min，72°C延伸lmin共30个循环，最后在72°C下延伸lOmin。一次扩增引物63F和1387R，二次扩增正向引物338F-GC和反向引物 518R(5' -ATT ACC GCG GCT GCT GG-3')。电泳称取0. 36g琼脂糖溶于30ml的ITAE中，高温溶解至清澈透明。加1. 5ulEB,倒入做胶板，插入梳子，等待冷却。胶体冷凝后拔出梳子，放入电泳槽中，每孔道加入3ul6buffer和5ul PCR产物的混合物，添加DNA MARKER作为DNA长度判断的标尺。胶体在IOOmV电压下跑25分钟后于凝胶成像仪中观察，拍照。4、DGGE电泳分析PCR产物制备变性剂尿素浓度梯度50% -75%，丙烯酰胺凝胶浓度为10%的变性梯度凝胶电泳(DGGE)。其中变性剂和丙烯酰胺的浓度从胶的上方向下方依次递增。待变性梯度胶完全聚合后，将胶板放入装有电泳缓冲液的电泳槽中，取PCR样品15μ 1和相同体积的上样缓冲液混合后加入上样孔。60°C在90V电压下，DGGE电泳12h，电泳结束后，将凝胶进行EB染色染色15min，脱色25min，在凝胶成像系统中观察。5、特征条带回收，测序分析微生物种类用酒精棉对刀片消毒，同一水平位置的特征条带选较亮的一条割下，放入EP管中，加入30ul TE溶液溶解，4°C下静置Mh，取溶解液做为DNA模板进行PCR扩增。50ul PCR反应体系为无菌水 33. 75ul，IObuffer 5ul, MgCl2 (25mM) 4ul, dNTPs (2. 5mM) 4ul, primerone(25mM) lul,primer two (25mM) lul，Taq 酶(5U/ul) 0. 25ul，模板 DNA 2ul。PCR 扩增程序为预变性94°C lOmin，然后94°C变性lmin，62°C退火2min，72°C延伸Imin共30个循环，最后在72°C下延伸lOmin。根据DGGE分离后的条带经测序并在Genbank中比对，判断其代表的微生物种类。
权利要求
1.一种塔式蚯蚓生态滤池复合填料微生物群落结构分析方法，其特征在于，具体步骤如下①分别在塔式蚯蚓生态滤池不同填料层取多种填料进行预处理；②利用DNA提取试剂盒提取基因组总DNA；③利用16SrDNAV3区引物对样品DNA进行巢式PCR扩增；④利用变性梯度凝胶电泳即DGGE技术分析PCR扩增产物，得到的DGGE图谱利用Quantity one软件分析；⑤特征DGGE条带切割回收，样品DNA再次PCR后测序分析，判定微生物种类。
2.根据权利要求1所述塔式蚯蚓生态滤池复合填料微生物群落结构分析方法，其特征为步骤①中所述多种填料预处理，包括塔式一级蚯蚓生态滤池、塔式二级蚯蚓生态滤池和塔式三级蚯蚓生态滤池中的土壤、砂石和碎青石填料。填料先经过-80°C的冷冻干燥然后研磨、最后100目过塞。
3.根据权利要求1所述塔式蚯蚓生态滤池复合填料微生物群落结构分析方法，其特征为步骤②中所述的DNA提取试剂盒，具体为MOBIO公司的Ultra Clean Soil DNA isolationKIT试剂盒,包括Bead SolutionTubes、2ml Collection Tubes、Spin Filter Units in 2m 1Tubes、IRS soIution>Solution SKSolution S2>SoIutionS3>Solution S4、Solution S5。
4.根据权利要求1所述塔式蚯蚓生态滤池复合填料微生物群落结构分析方法，其特征为步骤③中所述的16S rDNAV3区引物，设计的引物为63F和1387R( —次PCR) ；338F-GC和518R( 二次PCR)。一次PCR扩增条件为预变性94°C 5min，然后94°C变性45s，55°C退火lmin，72°C延伸4 共30个循环，最后在72°C下延伸lOmin。二次PCR扩增条件为预变性950C lOmin，然后95°C变性lmin，63°C退火2min，72°C延伸Imin共30个循环，最后在72°C下延伸lOmin。
5.根据权利要求1所述塔式蚯蚓生态滤池复合填料微生物群落结构分析方法，其特征为步骤④中利用DGGE分析所述PCR扩增产物的条件为制备变性剂尿素浓度梯度50% -75%，丙烯酰胺凝胶浓度为10%的变性梯度凝胶电泳(DGGE)，电泳电压90V，电泳时间12h，二溴乙锭染色15min，脱色25min。
6.根据权利要求1所述塔式蚯蚓生态滤池复合填料微生物群落结构分析方法，其特征为步骤⑤中特征条带回收DNA再次PCR，PCR引物为338F和518R，扩增条件预变性940C lOmin，然后94°C变性lmin，62°C退火anin，72°C延伸Imin共30个循环，最后在72°C下延伸lOmin。
全文摘要
本发明公开了一种塔式蚯蚓生态滤池复合填料(土壤、砂石、碎青石)微生物群落组成分析方法，能够较好的反应出微生物种群多样性和动态性变化。具体步骤如下①分别在塔式蚯蚓生态滤池不同填料层取样进行预处理；②利用MOBIO DNA提取试剂盒提取基因组总DNA；③利用16S rDNA V3区设计引物对样品DNA进行巢式PCR扩增；④利用变性梯度凝胶电泳即DGGE技术分析PCR扩增产物，得到的DGGE图谱利用Quantity one软件分析；⑤特征DGGE条带切割回收，样品DNA再次PCR后测序分析，判定微生物种类。
文档编号C12Q1/04GK102559857SQ20101060861
公开日2012年7月11日 申请日期2010年12月28日 优先权日2010年12月28日
发明者汪龙眠, 王正芳, 罗艳, 郭敏, 郭飞宏 申请人:郭飞宏