eIF3m在癌症的诊断和治疗中的用途的制作方法

专利名称：eIF3m在癌症的诊断和治疗中的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及包含用于测量eIF;3m表达水平的试剂的癌症诊断组合物和通过调节所述表达水平用于癌症的治疗和预防的组合物。更具体而言，本发明涉及检测癌症标志物的组合物，其包含用于测量eIF3m的mRNA或蛋白表达水平的试剂；包含所述试剂的癌症诊断试剂盒；通过用所述试剂处理生物样本以检测与所述试剂特异性地结合的物质并定量比较个体和正常对照之间的所述物质来检测eIF;3m多核苷酸或蛋白的方法；以及用于癌症的治疗和预防的方法，其包括用于下调eIF;3m多核苷酸或蛋白表达的试剂。背景领域癌症是当今世界发病率和死亡率的最常见原因之一。随着平均预期寿命的增加，预计癌症发病率会增加，伴随发病年龄降低。ACS(美国癌症协会(American Cancer Society))的年度癌症统计文章报导称，在2007年，全世界诊断了 1200万或更多的新癌症病例，癌症患者的死亡人数约为760万，死亡速率约每天2万。肺癌、乳腺癌和结肠癌是最致命癌症的代表。特别是关于结肠癌，其结肠癌的发病率在韩国已显著升高。在韩国的男性中，其是胃癌、肺癌和肝癌之后第四位主要的癌症相关死亡的原因。相似的癌症死亡率的速率见于女性中。大部分病例发生在50多岁的患者之间，并且其次在60多岁的患者之间。在韩国结肠癌的最高发病率的年龄低于例如美国和欧洲的西方世界国家10年。在30多岁的人中，结肠癌的高发病频率占全部病例的5% -10%。 年轻人中的病例是不常见的，除非存在早期结肠癌的家族病史。影响癌症发生的因素在多数情况下是环境的，例如饮食的西方化，特别是动物脂肪和蛋白的过量摄入，而不是遗传。 仅5%的结肠癌病例是归因于遗传因素。根据这个事实和新近的报道，具有发展为结肠癌的高风险的人是1)已经被结肠息肉侵袭的人，2)具有结肠癌家族史的人，3)长期患有溃疡性结肠炎的人，4)被顽固性肛瘘侵袭的人。当早期被检测出时，通过内窥镜切除术或外科手术几乎可以完全治愈结肠癌。此外，即使转移到肝或肺(远处转移)，通过外科治疗仍然可以完全治愈结肠癌，除非发现太晚而不能手术。然而，在无症状患者中检出结肠癌是非常困难的，因为具有结肠癌的患者在早期没有主观症状。因此，即使不放便和疼痛，必须进行定期检测以在早期检测结肠癌，这允许实施外科手术用于治疗。隐血试验(occult blood test)被认为是相对方便的结肠癌筛选。然而，该试验中的阳性反应通常确定为假阳性。同样，并不是所有的阴性反应都能保证不存在结肠癌。也就是说，使用隐血试验作为准确诊断方法是不合理的。对结肠癌的诊断治疗进行的广泛和透彻研究发现，某些基因及其表达产物可以用作在早期准确检测结肠癌的诊断标志物和用作治疗结肠癌的靶标，从而导致本发明。发明公开技术问题因此，本发明的目的是提供用于检测癌症标志物的组合物，其包含用于测量eIF3m 的mRNA或蛋白表达水平的试剂。本发明的另一目的是提供癌症诊断试剂盒，其包含用于测量eIF;3m的mRNA或蛋白表达水平的试剂。本发明还一目的是提供检测eIF;3m多核苷酸或蛋白的方法，所述方法包括用所述用于测量eIF;3m的mRNA或蛋白表达水平的试剂处理生物样本，检测所述试剂和与其互补的多核苷酸或蛋白的复合物，并定量比较个体和正常对照之间的所述复合物。本发明还一目的是提供用于癌症的治疗和预防的组合物，其包含抑制eIF3m多核苷酸表达的寡核苷酸。本发明的另一目的是提供用于癌症的治疗和预防的组合物，其包含具有针对 eIF3m多肽的抑制活性的抗体或其抗原结合片段。本发明的另一目的是提供筛选用于癌症的治疗药物的方法，所述方法包括用候选化合物处理表达eIF;3m多肽和/或多核苷酸的细胞，并测量所述细胞中eIF;3m多肽或多核苷酸表达水平。问题的解决方案按照本发明的一方面，本发明涉及用于检测癌症标志物的组合物，其包含用于测量eIF3m的mRNA或蛋白表达水平的试剂。如本文所用的术语“elFIBm”表示真核翻译因子: 亚基。eIF3是哺乳动物起始因子，分子量大至800kDa。E1F3由称为eIF3a、b、c…、m的13个非等同亚基(non-identical subunit)组成。已知某些亚基在某些癌症中显示异常表达，但是至今在之前的资料中没有报道关于本发明的亚基在某些癌症中的特异性表达的信息。eIF;3m也称为PCIDl (含有蛋白1的PCI结构域)，已知作为单纯疱疹病毒(HSV)进入的受体或共受体，但是还没有关于该亚基与肿瘤发生以及进一步癌症治疗的关联的报道。此外，在本发明中，首次公开了 eIF;3m在特异性癌细胞系和癌症中超表达。本发明人证实，在人肿瘤组织以及人癌细胞系中，eIF;3m在转录和翻译水平的表达都显著升高。在本发明中，还发现elFIM在肺癌、乳腺癌、肝癌、白血病、淋巴瘤、结肠癌、黑素瘤和直肠癌中以高水平表达，并且发现在人结肠组织的肿瘤部位中保持eIF;3m水平升高的表达。如本文所用的术语“标志物”或“诊断标志物”意图表示能够通过将癌细胞或患有癌症的个体区别于正常细胞或个体来诊断癌症的物质，并且包括有机生物分子，例如多肽、 蛋白或核酸(例如mRNA等)、脂质、糖脂、糖蛋白和糖(单糖，二糖，寡糖等)，所述有机生物分子的量在癌症细胞中相对于在正常细胞中增加或减少。对于本发明的目的而言，所述癌症的诊断标志物是eIF;3m多肽或编码该多肽的多核苷酸，所述多肽或多核苷酸在癌症细胞中相对于在正常细胞或组织中以高水平特异性地表达。如本文所用的术语“mRNA表达水平的测量”或相应短语意指评价生物样品中癌症标志物基因的mRNA的存在和表达水平以诊断癌症的过程，其中测量mRNA的量。用于测量 mRNA水平的分析方法包括但不限于，RT-PCR、竞争性RT-PCR、实时RT-PCR、RNA酶保护试验 (RPA)、Northern印迹和DNA芯片检测。如本文所用的术语“蛋白表达水平的测量”或相应短语意指评价生物样品中从结肠癌标志物基因表达的蛋白的存在和表达水平以诊断癌症的过程，其中使用与所述蛋白特异性地结合的抗体测量所述标志物基因的蛋白产物的量。用于测量蛋白水平的分析方法包括但不限于，Western印迹、酶联免疫吸附检测(ELISA)、放射免疫检测(RIA)、放射免疫扩散、Ouchterlony免疫扩散、火箭免疫电泳、免疫组织染色、免疫沉淀检测、补体结合检测、FACS(荧光激活的细胞分类仪)和蛋白芯片检测。用于测量mRNA水平的试剂可以示例为引物对、探针或反义核苷酸，其与本发明的 eIF;3m多核苷酸或其片段有关。根据本发明的多核苷酸序列，本领域技术人员可以容易地设计所述引物、探针或反义核苷酸序列。如本文所用的术语“引物”是指具有游离的3'羟基基团的短核酸链，其与互补模板形成碱基对，以便作为产生新模板链的起点。除引物外，DNA合成或复制需要合适的缓冲液、适当的温度、聚合酶(DNA聚合酶或逆转录酶)和4种三磷酸核苷酸。在本发明中，对 eIF;3m多核苷酸具有特异性的有义和反义引物可以用于PCR扩增，以便用PCR产物诊断癌症。根据本领域的已知信息，可以适当改变所述有义和反义引物的长度。如本文所用的术语“探针”意指诸如RNA或DNA的核苷酸序列的片段，其长度范围从短至1个碱基至长至数百个碱基，其可以与目的mRNA特异性地结合并且用标签进行标记用于检测所述目的mRNA。本发明中有用的探针可以构建为寡核苷酸探针、单链DNA探针、双链DNA探针或RNA探针的形式。在本发明的实施方案中，通过测定与本发明的eIF3m多核苷酸互补的探针是否与目的核苷酸序列杂交，可以实现癌症发生的诊断。按照本领域已知的信息可以更改合适的探针和杂交条件的选择。本发明中有用的引物或探针可以使用亚磷酰胺固相载体法或其他熟知技术化学合成。使用本领域已知的各种手段可以修饰它们的核苷酸序列。修饰的示例性、非限制性实例包括甲基化、加帽、用一个或多个同系物取代天然核苷酸和核苷酸之间的改变，例如不带电荷的连接物(例如甲基磷酸、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等)或带电荷的连接物(例如磷硫酰，二硫代磷酸酯等)。优选地，所述引物或探针优选含有8个或更多核苷酸。通过将所述引物或探针暴露于本发明的eIF;3m多核苷酸或使所述引物或探针与本发明的eIF;3m多核苷酸接触，可以实现杂交。优选地，将这些序列在使非特异性配对最小化的严紧条件下彼此杂交。为了检测与本发明的eIF;3m多核苷酸共享80% -90%同源性的序列，例如，杂交条件可以包括在 42°C、含有0. 25M Na2HP04、pH7. 2、6. 5% SDS和10%硫酸葡聚糖的缓冲液中杂交过夜并最终在50°C、用含有0. IX SSC^PO. 1% SDS的溶液洗涤。适于检测与本发明的elFIBm多核苷酸共享90%同源性的序列的严紧条件包括在65°C、在0. 25M Na2HPO4, pH7. 2、6. 5% SDSU0% 硫酸葡聚糖中杂交过夜，并最终在60°C、用含有0. IXSSC和0. SDS的溶液洗涤。根据本发明的实施方案，测量eIF3m蛋白(下文与“elF^ii多肽”交换使用)的表达水平的试剂优选为抗体。如本文所用的术语“抗体”是指指示抗原区的特异性蛋白分子。对于本发明的目的而言，所述抗体与本发明的标志物，即eIF;3m多肽特异性地结合。该抗体可以使用常规方法自蛋白产生，通常克隆到表达载体的标志物基因编码所述蛋白。此外，可产生自由所述标志物基因编码的蛋白的部分肽，落入所述抗体的范围。为了作为抗体而发挥功能，所述部分肽需要含有至少7个氨基酸残基，优选地9个或更多氨基酸残基，以及更优选地12个或更多氨基酸残基。不给予本发明的抗体的形式特定的限制。其中有多克隆抗体、单克隆抗体及其含有互补位的片段以及所有免疫球蛋白抗体。此外，诸如人源化抗体的特殊抗体也在本发明的范围内。因此，只要可以使用本领域已知的方法产生，针对本发明的eIF;3m蛋白的任何抗体都可以用于本发明中。
此外，用于检测癌症的诊断标志物的本发明的抗体包括抗体分子的功能性片段以及具有两个全长轻链和两个全长重链的完整形式。所述抗体分子的功能性片段是指，至少保留抗原结合功能的片段，并且包括Fab、F (ab' )、F(ab' )2、Fv等。如本文所用的术语“癌症”是指与细胞死亡调节相关的一类疾病，其中细胞群表现出凋亡不足产生的不受控制的过度生长。所述过度生长的细胞侵袭邻近组织和器官以破坏正常结构和使正常结构变形，形成肿瘤块，以上情况定义为癌症。通常，肿瘤是细胞的异常过度生长所形成的赘生物或实体病变。肿瘤可以是良性的或恶性的。通常生长远快于良性肿瘤的恶性肿瘤侵袭邻近组织并有时转移，威胁生命。恶性肿瘤通常视为癌症。可以用检测癌症标志物的本发明的组合物检测到的癌症的实例包括髓样癌、头颈癌、肺癌、乳腺癌、胸腺瘤、间皮瘤、食道癌、胰腺癌、结肠癌、肝癌、胃癌、胆管癌、肾癌、膀胱、前列腺癌、睾丸癌、精原细胞瘤、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、淋巴瘤、急性白血病、慢性白血病、多发性骨髓瘤、肉瘤和恶性黑素瘤，但不局限于此。在本发明优选的实施方案中，将所述用于检测癌症标志物的组合物应用于肺癌、肝癌、结肠癌、乳腺癌、白血病、淋巴瘤和黑素瘤细胞系以检查其中癌症标志物的表达水平。当应用所述组合物时，观察到eIF;3m蛋白在来自具有癌症的个体的组织中具有显著高于来自正常个体的组织中的表达水平。按照本发明的另一方面，本发明提供了包含用于测量eIF;3m的mRNA或蛋白表达水平的试剂的癌症诊断试剂盒。本发明背景中的术语“诊断”是指，测定生物样本或组织样品中本发明的eIF;3m多肽或多核苷酸的有无，从而鉴定与所述基因的表达相关的疾病的存在或特征的过程。通过使用本发明的试剂盒测定所述eIF;3m多肽或编码其的多核苷酸的表达水平可以实现癌症标志物的检测。本发明的试剂盒可以包含用于测量所述癌症诊断标志物的表达水平的引物或探针，选择性地识别所述癌症标志物的抗体或其保留抗原结合功能的片段和/或一种或多种适于分析所述多肽或多核苷酸的试剂或组合物。例如，用于定量分析本发明的多核苷酸或基因的诊断试剂盒可以包含至少一个与编码所述eIF3m多肽的多核苷酸特异性地结合的寡核苷酸。在优选的实施方案中，本发明的诊断试剂盒特征为，包括实施 RT-PCR所需要的必需元件。RT-PCR试剂盒包括对eIF3m的核苷酸序列或其部分序列具有特异性的引物对、逆转录酶、Taq聚合酶、PCR引物和dNTP。只要其利用“mRNA表达水平的测量”的上下文中已知的分析方法，可以使用任何试剂盒而没有限制。在另一优选的实施方案中，本发明的癌症诊断试剂盒可以包含与本发明的eIF;3m 蛋白特异性地结合的抗体。只要其利用“蛋白表达水平的测量”的上下文中已知的分析方法，可以使用任何试剂盒而没有限制。优选的是ELISA试剂盒或蛋白芯片试剂盒。使用抗体测量蛋白表达水平是基于所述eIF;3m蛋白和其抗体之间抗原-抗体复合物的形成。为了测定蛋白表达水平，可以使用各种方法测量抗原-抗体的量。如本文所用的术语“抗原-抗体复合物”意指癌症标志物蛋白与对其具有特异性的抗体的结合产物。通过测量检测标记的信号大小，可以定量测定因此形成的所述抗原-抗体复合物。例如，可以根据可疑个体和正常对照之间抗体-抗原复合物的量的比较，通过测定所述可疑个体中eIF;3m蛋白表达水平的显著升高来诊断癌症。在这方面，用对本发明的 eIF;3m蛋白具有特异性的抗体处理来自具有可疑癌症的个体的样品，以形成可以使用试剂盒定量分析的抗原-抗体复合物，所述试剂盒是基于ELISA检测、RIA检测、夹心ELISA检测、Western印迹检测、放射免疫扩散检测、ouchterlony免疫扩散检测、火箭免疫电泳检测、免疫组织染色检测、免疫沉淀检测、补体结合试验、FACS、蛋白芯片检测或免疫斑点检测。所述分析数据与正常个体的分析数据的比较允许与eIF;3m蛋白表达升高有关的癌症的诊断。根据本发明的其他方面，本发明涉及检测eIF;3m多核苷酸或蛋白的方法，所述方法包括用测量eIF;3m的mRNA或蛋白表达水平的试剂处理生物样本，检测所述试剂与与其互补的多核苷酸或蛋白的复合物，并定量比较个体和正常对照之间的复合物。详细而言，可以在mRNA水平或蛋白水平检测基因的表达。使用熟知的方法，可以实现从生物样本分离mRNA或蛋白。如本文所用的术语“生物样本”意指从中可以测量eIF3m的基因或蛋白表达水平的样品。本发明中有用的生物样本的实例包括组织、细胞、全血、血清、血浆、唾液、痰、脑脊液和尿液，但不局限于此。在本发明检测方法的实施方案中，可以将具有可疑癌症的个体中的表达水平与正常对照中的基因表达水平进行比较，以诊断所述个体中的癌症发病率。详细地说，测量来自具有可疑癌症的个体的生物样品的本发明的标志物的表达水平。将该水平与来自正常对照的生物样品中测量的水平进行比较。当所述个体中本发明的标志物的表达水平高于所述正常对照中时，可以确定所述个体受到癌症侵袭。在编码本发明的eIF;3m多肽的多核苷酸被用作标志物的情况下，所述方法包括
(a)提供生物样本；(b)用测量eIF3m的表达水平的试剂处理所述生物样本；(c)检测所述试剂与与其互补的多核苷酸的结合产物；并且(d)定量比较个体和正常对照之间的所述结合产物。在本发明的eIF;3m多肽被用作标志物的情况下，所述方法包括(a)提供生物样本；
(b)用对所述eIF;3m蛋白具有特异性的抗体处理所述生物样本；(c)检测抗原-抗体复合物；并(d)定量比较个体和正常对照之间的所述复合物。按照本发明还一方面，本发明涉及用于癌症的治疗和预防的组合物，所述组合物包含作为活性成分的抑制eIF;3m多核苷酸的表达的寡核苷酸或抑制eIF;3m多肽的活性的抗体或其抗原-结合片段。在该方面的优选的实施方案中，所述药物组合物可以包括抑制本发明的eIF3m多核苷酸的表达的物质。所述eIF;3m表达抑制物质可以选自siRNA、shRNA、适体和反义寡核苷酸。如本文所用的术语“siRNA(小干扰RNA) ”意指介导RNA干扰或基因沉默的约20 个核苷酸的小核酸分子。当将siRNA引入细胞时，其被dicer识别从而降解编码eIF3m的基因，导致eIF;3m基因的特异性抑制(knockdown)。术语“shRNA”是指短发夹RNA，其中siRNA靶序列的有义和反义序列被5_9个碱基的环状结构隔开。如本文所用的术语“适体”是指长度为20-60nt的寡核糖核酸分子。取决于序列， 其具有不同三维结构并且与特异性靶分子结合以有效地调节所述靶分子的功能。最近，RNA干扰(RNAi)现象已被研究应用于在基因水平控制蛋白表达的方法。通常，siRNA已表现出通过与mRNA特异性地结合来抑制蛋白表达，所述mRNA具有与靶基因互补的序列。为了干扰癌基因或转移基因(metastagenes)的表达，可以将包含按照本发明的 siRNA或shRNA的组合物根据适用于基于这些RNA的基因治疗的典型方法给予个体。例如， 可以按照 Filleur et al.，Cancer Res. ,63(14) :3919_22，2003 所述的方法，通过 siRNA 的低量静脉内注射来调节基因表达。为了增加siRNA的细胞摄取和稳定性，按照Chien et al.，Cancer Gene Ther.，12 (3) 321-8，2005，也可以联合注射 siRNA 与结合物。可以通过直接化学合成(SuiG et al.，(2002) Proc Natl Acad Sci USA 99: 5515-5520)或体外转录(BrummelkampTR et al.，(2002) Science 296 :550-553)制备包含在本组合物中的所述短干扰RNA分子(siRNA)，但是本发明不限于这些方法。此外，可以从基于RNA聚合酶III的启动子表达经设计克服siRNA的缺点的shRNA，所述启动子包含在被引入细胞的腺病毒、慢病毒(rentiviral)或质粒表达载体系统中，所述siRNA的缺点包括昂贵的siRNA生物合成和低转染效率，这导致RNA干扰效果的短期持续性。使用siRNA加工酶(Dicer或RNaseIII)在细胞中将所述shRNA分子加工为功能性siRNA分子，并且随后诱导靶基因的沉默。如本文所用的术语“反义”意指寡聚物具有核苷酸碱基的序列和亚基对亚基的骨架，所述骨架允许所述反义寡聚物与RNA中的靶序列通过Watson-Crick碱基配对杂交，从而在靶序列中形成RNA 寡聚物异源双链，通常与mRNA杂交。所述寡聚物可以与所述靶序列具有严格的序列互补性或与其接近的互补性。这些反义寡聚物可以阻断或抑制所述mRNA 的翻译和/或修饰mRNA的加工以产生所述mRNA的剪接变体。因此，本发明的反义寡聚物是与编码eIF;3m多肽的多核苷酸互补的反义寡聚物。对于基因治疗，可以通过通常方法给予本发明的反义寡核苷酸。给予所述组合物可以防止或抑制癌基因表达。例如，如J. S.Kim et al. ,J controlled Release 53,175-182(1998)所述，通过静电吸引将反义寡脱氧核苷酸装载到基于多聚左旋赖氨酸的微颗粒载体上，并且静脉内注射所述装载了寡核苷酸的微颗粒，但是本发明不限于此方法。优选地，本发明的组合物可以包括已知治疗剂，所述治疗剂直接地或间接地与所述试剂结合或以未结合形式存在。能够与抗体结合的治疗剂包括但不限于，放射性核素、药物、淋巴因子、毒素和双特异性抗体。只要其当与抗体结合或与siRNA、shRNA或反义寡核苷酸联合给药时能发挥对于癌症的治疗效果，在本发明中可以使用任何已知治疗剂。放射性核素的实例包括但不限于，3H、14C、32P、35S、36Cl、51Cr、57C0、58C0、59Fe、9°Y、125I、 1311、和 186Re。本发明中有用的药物和毒素包括依托泊苷(etoposide)、替尼泊苷(teniposide)、 阿霉素、道诺霉素、去甲柔红霉素、氨喋呤、更生霉素、丝裂霉素、顺钼和顺钼类似物、博来霉素、埃斯培拉霉素(esperamicins)、5-氟尿嘧啶、美法仑(melphalan)和氮芥，但不限于此。通过抑制eIF;3m基因或蛋白表达，检查eIF;3m特异性siRNA抑制癌发生的活性。与对照的比较表明细胞生长和细胞周期相关的表达模式受到调节。在本发明的优选的实施方案中，本发明提供了包含抑制eIF;3m蛋白活性的物质的组合物。优选地，所述抑制活性的物质是特异性地识别eIF;3m蛋白的抗体。所述抗体包括所有单克隆抗体和嵌合抗体，所述单克隆抗体和嵌合抗体的人源化抗体和人抗体。只要抗体具有特异性地识别eIF3m的结合特性，则所述它们包括具有两条全长轻链和两条全长重链的完整形式，或可以是抗体分子的功能性片段的形式。如本文所用的术语“抗体分子的功能性片段”意指至少保留抗原结合功能的片段，所述片段以Fab、F(ab' )、F(ab)2和Fv作为示例。优选地，本发明的组合物可以包括适于其给药模式的可接受的载体。活性成分可以与药学上可接受的媒介、赋形剂或添加剂组合。本发明中有用的药学上可接受载体的实例包括生理盐水、无菌水、林格液、缓冲盐水、葡萄糖溶液、麦芽糊精溶液、甘油、乙醇和脂质体。它们可以单独使用或联合使用。必要的话，所述组合物还可以包含其他典型添加剂，例如抗氧化物、缓冲液等。根据给药模式，所述组合物可以与稀释剂、分散剂、表面活性剂，粘合剂和/或润滑剂配制为注射剂型，例如水溶液、悬液、乳液等，或口服剂型例如丸剂、胶囊剂、颗粒剂、片剂等。当与载体结合时，对靶器官或组织具有特异性的抗体或配体可以使活性成分定向于所述器官或组织。可以在本发明中使用本领域已知的典型的媒介、赋形剂和添加剂。本发明并不限于所述媒介、赋形剂和添加剂的实例。所述组合物或制剂可以按照目的或需要通过适合的途径以治疗有效量给予个体。 所述药物组合物可以口服给药、胃肠外给药、皮下给药、腹膜内给药或鼻内给药。对于局部免疫抑制治疗，如果需要的话，可以使用包括病灶内给药在内的适当方法给予所述组合物。 胃肠外注射包括肌内途径、静脉内途径、动脉内途径、腹膜内途径和皮下途径。包含所述反义寡核苷酸、siRNA或shRNA的组合物的治疗有效量可以根据医学领域熟知的各种因素而改变，所述因素包括待实现的反应的种类和程度、患者的年龄、体重和健康状况等。按照本发明的仍然另一方面，本发明涉及筛选癌症治疗剂的方法，所述方法包括用候选化合物处理表达eIF;3m多肽和/或多核苷酸的细胞并测量所述细胞中elFIM多肽或多核苷酸表达水平。在本发明的筛选方法中，所述候选化合物，如果诱导eIF;3m表达水平的增加，则被确定为致癌的。当eIF;3m表达水平因而降低时，所述候选化合物被确定为可能的癌症治疗剂。按照所述筛选方法，可以由eIF;3m表达水平很容易地确定所述候选者的活性。本发明的有益效果如目前所述，eIF;3m可以用作癌症标志物，其允许以高敏感性和特异性诊断癌症。 特别是，所述癌症标志物对于肺癌、乳腺癌、肝癌、白血病、淋巴瘤、直肠癌、黑素瘤和结肠癌的诊断是有用的。此外，当给予个体时，eIF;3m表达调节剂可以通过抑制eIF;3m基因的超表达来防止癌症的发作或进展。附图简述

图1表示成对的患者组织中eIF3亚基的表达水平。使用表1所列的引物进行所有qRT-PCR反应并且通过AQ方法定量。图2表示癌细胞系和人结肠组织中eIF3m(真核翻译因子: 亚基)的表达。图3表示患者样品中的eIF3m的表达升高。通过qRT_PCR分析来自结肠腺癌患者的20对正常-肿瘤组织的eIF;3m在转录水平的表达。图4表示正常人组织和人癌细胞系中eIF;3m的Northern印迹。图5表示用来自结肠癌患者的正常/肿瘤组织对的qRT-PCR和flfestern印迹的数据。图6表示人组织中eIF3m的免疫组织化学检测的结果。
图7表示通过SiRNA沉默eIF3m的表达导致细胞增殖速率的降低。将eIFiBm siRNA-Ι转染的HCT-116 (wt)细胞孵育96小时。阴性对照包括无siRNA的单独缓冲液(BF) 和非人阴性对照SiRNA(NC)。图8表示通过siRNA-3的elFIBm表达的沉默导致细胞增殖的降低。eIF3m siRNA-3 转染的HCT-116(wt)细胞孵育96小时。阴性对照包括无siRNA的单独缓冲液(BF)和非人阴性对照SiRNA(NC)。图9表示在HCT-116细胞的免疫沉淀物中的eIF3m和RNA。(a)来自免疫沉淀的细胞裂解物的eIF3m的Western印迹。空白载体对照(pFLAG_CMV2)在输入对照 (IC)或抗FLAG抗体结合的亲和性凝胶的免疫沉淀物(IP)中未显示出任何可检出的条带。然而，在pFLAG-CMV2-eIF;3m转染的HCT-116细胞的IP中，出现具有指定大小的条带。 (b)从免疫沉淀物提取后，在甲醛凝胶上分辨的RNA。空白载体对照未得到RNA，但是在 pFLAG-CMV2-eIF3m转染的细胞中出现RNA。图10表示相关分子的肿瘤学分析结果。图11表示在eIF3m siRNA-1转染后0、M、48、72和96小时，在HCT-116细胞中通过 Wfestern印迹检测的巨噬细胞迁移抑制因子(MIF) (a)和金属硫蛋白2A(MT2A) (b)的蛋白表达。还检测了人β肌动蛋白，用于上样对照(laoding control) 0 (c)在eIF3m siRNA-I 转染后0、Μ、48、72和96小时，在HCT-116细胞中通过RT-PCR检测的MIF和ΜΤ2Α的转录水平。图12表示通过PCR产物测序确认的反应的特异性。在eIF3msiRNA-l转染后不同时间，在HCT-116细胞中通过qRT-PCR测量的(通过用β肌动蛋白mRNA表达标准化的相对定量)，MIF (a)和MT2A (b)的mRNA水平。图13表示在eIF3m siRNA-I转染后0,24,48,72和96小时，HCT-116细胞中细胞分裂周期25同系物(CDC25A)蛋白的可调型表达。还检测了人β肌动蛋白，用于上样对照。图14表示当沉默一正^！表达时，此！“-！化结肠癌细胞系的亚G0/G1群增加。处理后每M小时通过流式细胞仪测量siRNA转染的细胞的核含量，以检查细胞周期进程。BF和 NC对照在有丝分裂细胞周期阶段未显示出任何显著的细胞周期差异。eIF3m siRNA-I处理在M小时增加亚G0/G1阶段，并且保持升高，直至96小时。图15表示处理后每M小时通过流式细胞仪测量siRNA转染的细胞的核含量，以检查细胞周期进程。整个培养期中，BF和NC对照中的亚G0/G1期没有显著差异，但是eIF;3m siRNA-3处理后的亚G0/G1阶段升高，直至96小时。发明方式通过以下实施例可以获得对本发明的更好的理解，提出这些实施例是为了举例说明，而不应当解释为限制本发明。实施例1 结肠组织遵照赫尔辛基协定(Helsinki Treaty)，获得人结肠组织。按照实验方案从患者切除组织并保存在-80°C，直至使用。实施例2 细胞培养本发明所用的所有的细胞系获自ATCC(American Type Culture Collection(美国典型培养物保藏中心)，Manassas，VA)和Korean Cell Line Bank(韩国细胞系库)(首尔，韩国)。每种细胞系保持在补充了 10% 85(胎牛血清，Invitrogen)的维持液中。实施例3 实时定量RT-PCR使用Trizol试剂(Invitrogen)按照生产商使用说明，提取、洗涤总RNA。用DNA 酶处理I分离物，以去除残留的基因组DNA，然后通过RNeasy柱^jiagen)进行纯化。使用 Nanodrop 1000 (Thermo Scientific)定量 RNA。用数微克的总 RNA 合成 cDNA，使用 1μ 1 的在 50mM Tris-Hcl (pH8. 3)中的 50μΜ oligo(dT)作为引物，然后通过 Superscript III 转录酶 Gnvitrogen)在 20 μ 1 的含有 75mM KCl、3mM MgCl2、5mM DTT、0. 5mM dNTP和 40U RNase Out (Invitrogen)的RT混合物中进行逆转录。通过与1 μ 1的RNaseHQ单位)在37°C孵育 20分钟去除模板RNA。自10倍连续稀释的克隆到pCR2. 1 Τ0Ρ0的扩增子，生成标准曲线， 所述扩增子的范围从1. OX 101°)拷贝/ y 1至1. OX IO2拷贝/ μ 1。使用通过Superscript RT III (Invitrogen, USA)和5pmoles的正向和反向引物(表1)合成的1/10的cDNA，在 QuantiFast SYBR Green PCR 预制混合物(Master mix, Qiagen, Germany)中，按照以下热曲线(thermal profile)进行实时PCR分析在LightCycler480 (Roche Applied Science, Switzerland)上 50°C保持 2 分钟，95°C保持 10 分钟，95°C 30 秒 -58°C 30 秒 -72°C 30 秒， 重复40个循环。通过用GAPDH或ACTB标准化的相对定量(RQ)或绝对定量(AQ)法分析数据。表 权利要求
1.用于检测癌症标志物的组合物，其包含用于测量eIF;3m的mRNA或蛋白表达水平的试剂。
2.如权利要求1所述的组合物，其中所述用于测量eIF3m的mRNA表达水平的试剂与 eIF3m mRNA特异性地结合，并且选自引物对、探针和反义寡核苷酸。
3.如权利要求1所述的组合物，其中所述用于测量eIF3m的蛋白表达水平的试剂是抗体。
4.如权利要求1所述的组合物，其中所述癌症标志物在选自肺癌、乳腺癌、肝癌、白血病、淋巴瘤、结肠癌、黑素瘤和直肠癌的癌症中被靶定。
5.癌症诊断试剂盒，其包含权利要求1-4中之一所述的组合物。
6.如权利要求5所述的癌症诊断试剂盒，其基于RT-PCR试剂盒、竞争性RT-PCR试剂盒、实时RT-PCR试剂盒、DNA芯片试剂盒或蛋白芯片试剂盒。
7.检测eIF;3m多核苷酸的方法，其包括(a)提供生物样本；(b)用权利要求2所述的试剂处理所述生物样本；(c)检测所述试剂与与其互补的多核苷酸的结合物；以及(d)定量比较个体和正常对照之间的结合物。
8.检测eIF;3m蛋白的方法，其包括(a)提供生物样本；(b)用对所述eIF;3m蛋白具有特异性的抗体处理所述生物样本；(c)检测所形成的抗原-抗体复合物；以及(d)定量比较个体和正常对照之间的复合物。
9.用于癌症治疗和预防的组合物，其包含抑制eIF3m多核苷酸表达的寡核苷酸。
10.如权利要求9所述的组合物，其中所述寡核苷酸是对eIF;3m基因具有特异性的反义寡核苷酸、适体、siRNA或shRNA。
11.用于癌症的治疗和预防的组合物，其包含具有针对eIF3m多肽的抑制活性的抗体或其抗原-结合片段。
12.如权利要求9或11所述的组合物，其中所述癌症选自肺癌、乳腺癌、白血病、淋巴瘤、结肠癌、黑素瘤和直肠癌。
13.筛选癌症的治疗药物的方法，其包括用候选化合物处理表达eIF;3m多肽和/或多核苷酸的细胞；并且测量所述细胞中 eIF3m多肽或多核苷酸表达水平。
全文摘要
本申请公开了检测癌症标志物的组合物，其包含用于测量eIF3m的mRNA或蛋白表达水平的试剂；包含所述试剂的癌症诊断试剂盒；通过用所述试剂处理生物样本以检测与所述试剂特异性地结合的物质并定量比较个体和正常对照之间的所述物质来检测eIF3m多核苷酸或蛋白的方法；以及用于癌症的治疗和预防的方法，其包括用于下调eIF3m多核苷酸或蛋白的表达的试剂。
文档编号C12N15/11GK102282268SQ201080001653
公开日2011年12月14日 申请日期2010年10月7日 优先权日2009年10月29日
发明者李娟受, 洪性惠, 郑珍淑, 金仁厚, 高晟豪 申请人:国立癌中心