核酸试样制造方法以及使用该方法的核酸扩增产物的制造方法

专利名称：核酸试样制造方法以及使用该方法的核酸扩增产物的制造方法
技术领域：
本发明涉及从含有细胞的细胞试样回收核酸、制造核酸试样的方法以及使用该方 法的核酸扩增产物的制造方法。
背景技术：
在医疗领域中，作为以基因水平诊断感染症和基因病等的方法，广泛实施着以从 患者采取的DNA等核酸作为模板进行核酸扩增，分析特定的突变或单核苷酸多态性(SNP) 的方法。核酸通常从患者的全血中回收，但是在全血中含有红细胞和血浆等各种成分，如果 在其中大量残存，则也存在对后续的扩增反应产生影响的成分。另外，核酸一般在白细胞中 含有，但是，释释放核酸后的白细胞残骸也可能影响后续的扩增反应。因此，在从患者的血 液试样回收作为模板的核酸时，必须使核酸从白细胞中释放，并且以某种程度将不需要的 成分除去。另外，近年来要求基因分析装置及其使用的芯片等工具的小型化。所以，与之相适 应，也必须从少量的全血高效率地回收作为模板的核酸。这样，从要求除去不需要成分和从 少量机体试样高效率地回收核酸出发，公开了以下的方法。首先，作为第1方法，可以列举在高浓度的离液盐存在下使核酸结合在二氧化硅 颗粒上的方法(专利文献1)。如果根据该方法，由于核酸结合在二氧化硅颗粒上，所以，通 过将核酸和二氧化硅颗粒的复合体与液体组分分离，就能够回收核酸。但是，离液盐是具有 腐蚀性的改性剂，对人体和环境的影响被视为问题。另外，离液盐对于核酸和二氧化硅颗 粒的结合是必须的，但是由于抑制DNA聚合酶和限制性酶等多种酶的反应，所以必须由乙 醇等核酸不溶性的有机溶剂进行清洗。但是，由于乙醇等有机溶剂也抑制各种酶的反应，所 以，必须通过例如干燥而完全除去，存在操作繁杂的问题。另外，上述有机溶剂通常是挥发 性的，所以在处理上也是困难的。而且，在该方法中，用于回收核酸的载体被限定为二氧化 硅及其衍生物的颗粒，另外，试剂也被限定为含有离液盐的特殊试剂。因此，不能以除此以 外的载体和试剂代用，存在成本和制备麻烦的问题。第2方法是在表面活性剂的存在下使机体试样接触珠状支持体，由此使上述机体 试样中的DNA结合在上述支持体上并回收的方法(专利文献2)。在该方法中，DNA能够作 为凝胶状的DNA-珠复合体回收。但是，在该方法中，为了使充分量的DNA从机体试样中释 放，必须以表面活性剂处理大量的细胞悬浮液，结果导致样品量变多，有可能不能有效地与 珠接触。因此产生预先通过离心过滤等浓缩细胞或除去不需要的细胞和物质以后、浓缩需 要的细胞等的前处理，操作变得繁杂。另外，存在该复合体被移液和涡流混合等操作简单地 破坏，DNA收量显著减少的问题。因此，需要轻缓地操作，或者使用磁性珠，通过利用磁铁回 收结合有DNA的磁性珠而从液相分离。第3方法是通过使细胞提取液接触无纺布而使上述细胞提取液中的核酸吸附在 无纺布上的方法(专利文献3)。但是，如果根据该方法，为了使核酸吸附在无纺布上，就必
5须将上述细胞提取液制成为高盐浓度条件。因此，在核酸扩增中使用所得到的核酸时，例 如，为了避免由盐产生的影响，必须预先除去盐，操作是繁杂的。另外，因为核酸非常坚固地 附着在无纺布上，所以从无纺布洗脱DNA是困难的。因此，洗脱必须在极其严酷环境下进行 处理，例如在PH12那样的强碱性条件下的长时间加热处理，此外的以活性氧进行处理等。 认为在这样的方法中，不仅操作繁杂，而且因洗脱而对核酸产生损伤的可能性极高。现有技术文献专利文献专利文献1 日本专利第沈80462号公报专利文献2 日本专利第3787354号公报
专利文献3 国际公开第03/006650号

发明内容
发明要解决的课题因此，本发明的目的在于提供一种不必像以往那样大量使用例如危险性高的离液 盐等、不受特殊载体的限制、安全性优异、简便的核酸试样制造方法以及使用该方法的核酸 扩增产物的制造方法。解决课题的方法本发明的核酸试样制造方法是从细胞回收核酸的核酸试样制造方法，其特征在 于，包括下述㈧ (E)工序(A)对于含有上述细胞的细胞试样，使核酸复合体从上述细胞中释放的工序；(B)使上述(A)工序后的含有上述细胞试样的处理液与载体接触的工序；(C)分离上述载体和上述处理液的工序；(D)对上述载体实施加热处理的工序；(E)在上述(D)工序之前或之后，向上述载体中添加分散介质的工序。本发明的核酸扩增产物的制造方法，是通过核酸扩增方法制造目的序列的核酸扩 增产物的方法，其特征在于，包括下述(a)和(b)工序(a)通过本发明的核酸试样制造方法，从含有细胞的细胞试样回收核酸试样的工 序；(b)以上述(a)工序中回收的上述核酸试样中的核酸为模板，通过核酸扩增方法 制造上述模板核酸中的目的序列的核酸扩增产物的工序。发明的效果如果根据本发明，通过使核酸复合体从细胞中释放，能够以优异的效率回收核酸。 因此，例如在基因组DNA和RNA以外，也能够回收线粒体DNA。另外，由于核酸复合体从上述 细胞中的释放能够不使用例如特殊的试剂而进行，所以安全性和操作性也很优异。这样，由 于本发明的安全性和操作性优异，且回收率优异，所以，即使例如从少量细胞或少量细胞试 样中也能够回收充分量的在核酸扩增等中所需要的作为模板的核酸。而且，由于能够以这 样简便的操作高效率地从少量细胞或少量细胞试样中进行回收，所以可以说在例如近年来 受关注的使用微芯片和微流体等的核酸回收以及核酸扩增中也是有用的。


图1是表示本发明的核酸回收用移液器吸头的一个例子的截面图。图2(A) (D)是表示使用本发明的核酸回收用移液器吸头的核酸回收方法概略 的模式图。图3(A) (D)是表示本发明的核酸回收用生物芯片的一个例子的模式图。图4(A) (D)是表示本发明的核酸扩增用生物芯片的一个例子的模式图。图5是表示本发明的实施例1中使用的夹具装置的一个例子的模式图，(A)是上 面图，(B)是截面图，(C)是表示液体相对于载体的通过方向的模式图。图6是表示在本发明的实施例2中使用的夹具装置的一个例子的模式图，(A)和 (B)是立体图、(C)是上面图、(D)是截面图。图7是表示参考例中的核酸复合体的吉姆萨染色的照片。
具体实施例方式<核酸试样制造方法>如前所述，本发明的核酸制造方法是从细胞中回收核酸的核酸试样制造方法，其 特征在于包括下述(A) (E)工序。本发明的核酸试样制造方法也可以称为核酸试样的制 备方法、核酸试样的回收方法或从细胞回收核酸的方法。(A)对于含有上述细胞的细胞试样，使核酸复合体从上述细胞中释放的工序；(B)使上述(A)工序后的含有上述细胞试样的处理液与载体接触的工序；(C)分离上述载体和上述处理液的工序；(D)对上述载体实施加热处理的工序；(E)在上述(D)工序之前或之后，向上述载体中添加分散介质的工序。在本发明的制造方法中，推测核酸的回收由以下机理产生，但本发明不受此限定。 以往的核酸回收，特别是在基因组DNA的回收中，通常，首先，作为血液等试样的处理，进行 细胞(例如白细胞)内的核的破坏、上述核内所包装的染色体的释放、通过除去不需要的蛋 白质和纤维等而将核基因组直链化，在此基础上，例如，将核基因组保持在各种载体上，并 将上述载体与液体组分分离，由此回收核基因组。与此相对，在本发明中，虽然将含有核基 因组的染色体从细胞核中释放，但不使核基因组直链化，而是使核基因组作为缠绕的高度 的高级结构的颗粒形状的核酸复合体得到维持。该核酸复合体通常为直径50 200 μ m左 右，比直径为10 μ m以下的核大，另外，空间位阻也比直链的核基因组大，而且具有高度的 高级结构。因此，例如容易被保持在载体上。所以，来自细胞的核基因组能够高效率地被载 体捕获。而且，通过这样以核酸复合体的状态将核基因组捕获在上述载体上，也能够回收线 粒体基因组。线粒体基因组是约17000个左右的核苷酸连接成的环状DNA，因为非常微细， 所以将其回收是极其困难的。但是，如果根据本发明，由于被上述载体捕获的核酸复合体是 核酸缠绕而成的结构，所以认为在该结构内也还可以捕获线粒体基因组。另外，这样的核酸 复合体，例如，与直链的核基因组相比较，稳定性非常优异，因此，即使例如移液和涡流混合 等操作也难以被破坏。因此，能够防止由回收操作导致的回收率下降。而且，仅通过对上述 载体所捕获的核酸复合体实施加热处理，就能够在分散介质中回收上述核酸复合体中所含 有的各种核酸，例如基因组DNA、线粒体DNA、质粒DNA、RNA等。
在上述(B)工序中，使上述(A)工序后的上述处理液与上述载体接触的方法，以 及在上述(C)工序中，分离上述载体与上述处理液的方法分别不受特别限制，例如，如后所 述，可以根据上述载体的形状及其配置状态等适当决定。在上述(C)工序中，上述载体与上 述处理液的分离，例如也可以称为上述载体与液体组分的分离，另外，也可以称为上述处理 液或上述液体组分的除去。另外，上述处理液(液体组分)例如可以不从上述载体完全除 去，例如，在上述载体中也可以残留上述处理液。上述(E)工序中的分散介质的添加，如前所述，既可以在实施加热处理的上述(D) 工序之前进行，也可以在之后进行。在上述(D)工序后进行上述(E)工序时，本发明的制造 方法例如以上述㈧工序 (C)工序的顺序进行，接着，在进行了加热处理的上述⑶工序 后，进行添加上述分散介质的上述(E)工序。另外，在上述(D)工序前进行上述(E)工序时， 本发明的制造方法例如以上述(A)工序 (C)工序的顺序进行，接着，在进行了添加上述分 散介质的上述(E)工序后，进行加热处理的上述(D)工序。(第1实施方式)在本发明的核酸试样制造方法中，上述(A)工序的使核酸复合体释放的方法没有 特别限制。作为本发明的核酸试样制造方法的一个例子，可以列举上述(A)工序例如是混 合含有蛋白酶和表面活性剂的处理试剂与上述细胞试样的(Al)工序的第1制造方法。在 第1制造方法中，例如，这样地在上述(A)工序中，通过混合上述细胞试样与上述处理试剂， 可以得到使核酸复合体从上述细胞中释放的处理液。以下，说明本发明的第1制造方法，但本发明不受其限制。在本发明中，以下将与 细胞试样混合前的、含有上述蛋白酶和表面活性剂的试剂称为“处理试剂”，将混合上述处 理试剂和细胞试样而得到的混合物称为“处理液”或“混合处理液”。另外，在本发明中，所谓 上述细胞试样与上述处理试剂的混合，例如，既可以在上述细胞试样中添加上述处理试剂， 也可以在上述处理试剂中添加上述细胞试样。在本发明的第1制造方法中使用的上述处理 试剂，例如也称为“第1处理试剂”。在混合上述处理试剂和上述细胞试样而得到的处理液中，上述蛋白酶的浓度例如 优选为0. 5mU/ μ L以上，上述表面活性剂的浓度例如优选为0. 1体积％以上。通过以这样的 条件处理上述细胞试样，能够充分地释放上述核酸复合体。上述蛋白酶浓度和上述表面活 性剂浓度，例如，分别是含有上述处理试剂和上述细胞试样的处理液中的浓度，是将上述处 理液中的细胞含量假定为约IXlO2 IXlO9个时的浓度。另外，上述蛋白酶浓度和上述表 面活性剂浓度，例如，也可以分别是含有上述处理试剂和上述细胞试样的处理液中的浓度， 是将上述处理液中的上述细胞试样的添加比例假定为50 100 μ L、优选假定为50 μ L时的 浓度。在上述处理液中，上述蛋白酶浓度的下限，例如为0.5mU/l·! L以上，优选为ImU/ μ L以上，更优选为2mU/y L以上。在上述处理液中，上述蛋白酶浓度的上限没有特别限制， 但例如为IU/μ L以下，优选为500mU/y L以下。作为上述蛋白酶的浓度范围，例如为0. 5 IOOOmU/ μ L,优选为1 IOOOmU/ μ L,更优选为2 500mU/ μ L,特别优选为5 15mU/ μ L 的范围。蛋白酶的活性单位(U:单位)，一般以血红蛋白作为底物，将在37°C、1分钟内生成 相当于1 μ mol酪氨酸的肽的酶量作为1U。在上述处理液中，例如，蛋白酶相对于IX IO2 IX IO9个上述细胞的比例没有特别限制，但下限例如为0. 02mU以上，优选为0. 08mU以上，上限例如为100U以下，优选为50U 以下。另外，在上述处理液中，例如，蛋白酶相对于50 μ L上述细胞试样的比例没有特别限 制，但下限例如为0. 02mU以上，优选为0. 08mU以上，上限例如为100U以下，优选为50U以下。在上述处理液中，上述表面活性剂浓度的下限没有特别限制，但例如为0. 1体 积％以上，优选为0. 2体积％以上。另外，在上述处理液中，上述表面活性剂浓度的上限没 有特别限制，例如为20体积％以下，优选为10体积％以下，更优选为5体积％以下，进一步 优选为2体积％以下。上述表面活性剂的浓度范围例如为0. 1 20体积％，优选为0. 1 5体积％，更优选为0. 1 2体积％，特别优选为0. 2 0. 8体积％的范围。另外，在上述处理液中，表面活性剂相对于IXlO2 IX IO9个上述细胞的比例没 有特别限制，但下限例如为1毫微微摩尔(1X10-15摩尔)以上，优选为2毫微微摩尔以上， 上限例如为200毫微微摩尔以下，优选为100毫微微摩尔以下。另外，在上述处理液中，上 述表面活性剂相对于50 μ L上述细胞试样的比例没有特别限制，但下限例如为1毫微微摩 尔以上，优选为2毫微微摩尔以上，上限例如为200毫微微摩尔以下，优选为100毫微微摩 尔以下。上述蛋白酶和表面活性剂的比例，当上述细胞是真核细胞(有核细胞)时，优选是 相对于IXlO2 IX IO8个细胞的比例，更优选是相对于IXlO3 IX IO7个细胞的比例。 在上述真核细胞中，特别是上述细胞来自全血的细胞(例如白细胞)时，例如优选是相对于 5Χ103 IXlO7个细胞的比例，更优选是相对于2. 5Χ104 IXlO7个细胞的比例。在上 述真核细胞中，特别是来自唾液的细胞时，例如优选是相对于IXlO2 IXlO7个细胞的比 例，更优选是相对于1 XIO3 1 X IO6个细胞的比例。另夕卜，当上述细胞是原核细胞时，例如 优选是相对于1 XIO3 1 X IO9个细胞的比例，更优选是相对于1 X IO3 1 X IO8个细胞的 比例，例如，大肠杆菌等也是同样的。上述处理试剂中的蛋白酶浓度和表面活性剂的浓度没有特别限制，例如，优选设 定为在将上述处理试剂与上述细胞试样混合时，在上述处理液中为上述那样的浓度。在上述处理试剂中的蛋白酶浓度没有特别限制，但下限例如为lmU/μ L以上，优 选为2mU/ μ L以上，更优选为4mU/ μ L以上，上限例如为2U/ μ L以下，优选为IU/ μ L以下， 浓度范围例如为1 2000mU/ μ L，优选为2 2000mU/ μ L，更优选为4 IOOOmU/ μ L，特 别优选为10 30mU/mL的范围。作为在上述处理试剂中的表面活性剂的浓度，没有特别限 制，但下限例如优选为0. 2体积％以上，上限例如为40体积％以下，更优选为20体积％以 下，进一步优选为10体积％以下，特别优选为4体积％以下；浓度范围例如为0. 2 40体 积％，优选为0. 2 10体积％，更优选为0. 2 4体积％，特别优选为0. 4 1. 6体积％的 范围。上述细胞试样( 和上述处理试剂(T)的添加比例(体积比S T)没有特别限 制，但例如为1 0. 5 1 20，优选为1 0. 5 1 10，更优选为1 0. 5 1 5。作为上述蛋白酶，例如，可以列举蛋白酶K、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、组织蛋白酶 D、木瓜蛋白酶等。这些蛋白酶既可以使用任意一种，也可以并用二种以上。作为表面活性剂，没有特别限制，例如优选非离子型表面活性剂。作为上述非离 子型表面活性剂，例如，可以列举聚氧乙烯对异辛基酚(polyoxyethylene-p-isooctylphenol)、聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸酯(polyoxyethylene Sorbitan Monolaurate)、 聚氧乙烯壬基酚醚和壬基酚多硫代乙氧基化物等。作为这些表面活性剂，例如，可以列举 Triton (商标)X-100、Triton (商标)X_114 等 Triton 类；Nonidet (商标)P40 等 Nonidet 类；Tween (商标)20、Tween (商标)80等Tween类的表面活性剂。这些表面活性剂既可以 使用任意一种，也可以并用二种以上。上述处理试剂的形态没有特别限制，例如，既可以是固体(干燥体)，也可以是液 体。当为后者时，例如，优选在溶剂中添加上述蛋白酶和上述表面活性剂。上述溶剂没有 特别限制，例如，可以列举水、各种缓冲液、缓冲生理食盐水等水性溶剂、有机溶剂或它们的 混合液。作为上述缓冲液，例如，可以列举Tris-HCl, BES、PIPES、SSC、TAE、TBE、TG、MES、 Bis_Tris、ADA、ACES、M0PS0、M0PS、TES、HEPES、DIPS0、TAPS0、P0PS0、HEPPS0、EPPS、Tricine、 Bicine、TAPS、CHES, CAPSO, CAPS、PBS、硼酸、二甲胂酸、柠檬酸、甘氨酸、双甘氨肽、咪唑、 柠檬酸锂、磷酸钾、柠檬酸钠、磷酸钠、三乙基乙酸铵(TrithylammoniumAcetate)等。上述 处理试剂中的缓冲液的浓度没有特别限制，但例如为0. 1 lOOmmol/L，更优选为0. 1 50mmol/L,特别优选为0. 1 20mmol/L。上述处理试剂的pH例如为7. 8 9. 5，优选为 8. 5 8. 9。上述处理试剂例如还可以含有蛋白质改性剂。作为上述蛋白质改性剂，例如，可以 列举尿素、β-巯基乙醇、十二烷基硫酸钠、二硫苏糖醇、盐酸胍等。上述处理试剂中的上述 蛋白质改性剂的浓度没有特别限制，但例如为O 8mol/mL，优选为1 5mol/mL，更优选为 1 3mol/mL。这些蛋白质改性剂既可以使用一种，也可以并用二种以上。上述处理试剂例如还可以含有螯合剂。作为上述螯合剂，例如，可以列举EDTA、 EGTA、NTA、DTPA、GLDA、HEDTA、GEDTA、TTHA、HIDA、DHEG 等。上述处理试剂中的上述螯合剂的 浓度没有特别限制，但例如为O lOmmol/mL，优选为O Immol/mL，更优选为O 0. Immol/
mLo作为上述细胞，例如，只要是含有核酸的细胞即可，可以列举真核细胞和原核细 胞。作为上述真核细胞，例如，可以列举白细胞等血中细胞、口腔内细胞、指甲细胞和毛发细 胞等体细胞、生殖细胞和肿瘤细胞等，另外，也可以是这些细胞的培养细胞。另外，含有上述 真核细胞作为上述细胞的细胞试样没有特别限制，例如，可以列举血液、唾液、口腔粘膜、指 甲和毛发等，另外，也可以是上述真核细胞的培养物。作为上述原核细胞，没有特别限制， 例如，可以列举大肠杆菌，另外，也可以是其培养细胞。另外，作为上述细胞，含有上述原核 细胞的细胞试样没有特别限制，例如，可以是上述原核细胞的培养物。作为上述培养物，例 如，可以列举细胞的培养液、回收的培养细胞等。另外，上述细胞试样，例如，可以是未稀释 的细胞试样和稀释的细胞试样中的任一种，但本发明优选适用从未稀释的细胞试样回收核 酸。上述细胞试样例如是口腔内细胞或培养后回收的培养细胞等的情况下，例如，既可以将 预先在生理食盐水和缓冲液等中悬浮上述细胞而得到的悬浮液作为细胞试样与上述处理 试剂混合，也可以将细胞直接作为细胞试样与上述处理试剂混合。另外，上述细胞试样，例 如，既可以是刚刚采取后的细胞试样，也可以是室温放置、冷藏保存或冷冻后解冻的细胞试 样。作为上述血液，例如，可以列举全血、溶血的全血、全血的血细胞组分、上述血细胞 组分的分散液等。上述血液可以是未稀释血液和稀释血液中的任意一种，但优选例如适用从未稀释血液回收核酸。上述血液，例如，既可以是刚刚采取后的血液，也可以是室温放置、 冷藏保存或冷冻后解冻的血液。由本发明回收的核酸是例如DNA和RNA中的至少一种。作为上述DNA，例如，在基 因组DNA以外，还可以列举质粒DNA、线粒体DNA等。在上述(B)工序中，使上述载体接触上述(A)工序后的含有上述细胞试样的处理 液，例如混合上述处理试剂和上述细胞试样而得到的处理液。上述(B)工序中的载体没有 特别限制，例如，只要在上述(A)工序中，通过与上述处理试剂的处理能够捕获从上述细胞 中释放的上述核酸复合体的就可以。上述核酸复合体的平均直径例如为50 200 μ m。因 此，上述载体优选具有例如上述核酸复合体难以通过且液体组分可以通过的空隙。由此，例 如能够保持上述核酸复合体且能够除去液体组分。另外，由于上述核酸复合体如上所述具 有高度的高级结构，所以，例如容易附着在纤维等上(容易络合)。因此，上述载体中的空隙 大小没有特别限制，例如，可以通过在纺织布和无纺布纤维等载体本身附着上述核酸复合 体而保持上述核酸复合体。另外，可以认为由于其高级结构，附着在上述载体的核酸复合体 进一步保持其它核酸复合体。作为上述载体，例如，可以列举无纺布、网孔状纺织布等纺织布、海绵等多孔质体 等。其形状也没有特别限制，例如，可以列举片状、膜状、块状、珠状等。另外，上述珠状载体 例如可以由无纺布、纺织布、多孔质体等形成，也可以由非孔质体形成。以下例示上述各载体的特性，但本发明不受这些的限制。<无纺布>平均纤维直径例如为20nm 100 μ m,优选为约2 μ m克重例如为20 150g/m3，优选为约20g/m3。<纺织布>网孔的尺寸例如为10 1000 μ m,优选为100 250 μ m线直径(线径)例如为40 500 μ m，优选为47 152 μ m开孔例如为50 300 μ m,优选为50 105 μ m<多孔质体>平均孔径例如为10 μ m 1000 μ m,优选为30 μ m 1000 μ m平均密度例如为15 85kg/m3，优选为30 80kg/m3孔的形状例如为独立气泡体、连续气泡体〈珠〉形状正球、椭园球等球形直径(粒径)例如为30nm 100 μ m,优选为约5 μ m表面积比例如为0. 5 200m2/g，优选为1. lm2/g填充率例如为0. 1 10%，优选为0. 1 5%上述载体例如可以列举聚合物制载体。作为上述聚合物，没有特别限制，例如，可 以列举聚丙烯、聚乙烯、聚酯、聚酰胺(例如商品名尼龙)、聚氨酯、聚醚、聚苯乙烯、聚氯乙 烯、例如特富龙(注册商标)等聚四氟乙烯等。其中，例如优选为聚四氟乙烯、聚丙烯、聚酰 胺、聚氨酯、聚酯，更优选为聚丙烯、聚氨酯、聚酯。上述聚合物制载体，例如，既可以是全部由上述聚合物形成的载体，也可以是只与
11血液接触的部分，例如只是露出的表面被上述聚合物包覆的载体。上述珠状的聚合物制载体，例如，如上所述，既可以由多孔质体形成，也可以由非 多孔质体形成。作为上述珠状的聚合物制载体，例如，因为能够由磁铁回收，所以，也优选带 有磁性的磁性珠。作为构成上述磁性珠的聚合物，没有特别限制，例如，可以列举聚苯乙烯、 聚乙烯亚胺(PEI)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚乳酸(PLA)、壳聚糖和这些聚合物与马来 酸的共聚物等。另外，上述磁性珠，例如也可以以PEG-C00H、alkyl-0H、S03H、SiA等进行表 面处理。另外，上述磁性珠例如也可以是在由金属等磁性体构成的珠表面以如上所述的聚 合物包覆的珠。作为上述金属，例如，可以列举磁铁矿、磁赤铁矿、铁、镍等。另外，作为上述载体，此外，例如可以列举金属制载体。作为上述金属，例如，可以 列举不锈钢、钛、铝等。这些金属既可以是一种，也可以是二种以上。上述载体，例如既可以是单层体，也可以是二层以上的叠层体。上述叠层体，例如 既可以由任意的一种部件构成，也可以由不同的二种以上的部件构成，另外，也可以由不同 材质的部件构成。使用的上述载体的大小没有限制，例如，可以根据在上述(A)工序中的上述细胞 试样量、混合上述细胞试样和上述处理试剂而得到的处理液量以及上述载体的形状等适当 决定。另外，关于具体例子在后叙述。在上述(B)工序中，使上述处理液与上述载体接触的方法以及在上述(C)工序中， 使上述处理液与上述载体分离的方法分别不受特别限制，例如，如后所述，可以根据上述载 体的形状及其配置状态等决定。另外，上述处理液也可以如上所述不从上述载体完全分离。关于本发明的第1核酸试样制造方法，作为一例，说明从全血回收核酸的方法，但 本发明不受此限定。血液的处理工序首先，在全血中添加上述处理试剂。由此，从全血的白细胞释放核酸复合体。在该 核酸复合体中，例如，在基因组DNA和RNA以外，包含线粒体DNA。上述处理试剂的处理条件没有特别限制，但处理时间例如为1 600秒，优选为 5 600秒，更优选为5 300秒；处理温度例如为4 60°C，优选为10 60°C，更优选为 15 40"C。与载体接触的工序接着，使混合上述全血和上述处理试剂而得到的上述处理液与上述载体接触。由 此，从作为核酸含有细胞的全血的白细胞释放的核酸复合体被上述载体捕获。上述载体的大小如上所述没有特别限制，例如，可以根据处理的全血的量、上述载 体的材质和形状等适当决定。在以下表示具体例子。上述载体例如是由无纺布、纺织布或多孔质体构成的片状、膜状或块状等的载体 时，例如，在以下那样的条件下使全血与载体接触。上述载体的体积(Y:包括空隙)相对 于在上述(A)工序中处理的全血体积(X)的比(X Y)例如为1 2. 2X10—3 1 0.7， 优选为1 2. 2X10—3 1 0. 31，更优选为1 2. 2X10—3 1 0.13。另外，上述载 体的体积(Y 包括空隙)相对于上述(A)工序后的包含全血的上述处理液体积(X’ )的比 (X， Y)例如为 1 1·1Χ1(Γ3 1 0. 35，优选为 1 1·1Χ1(Γ3 1 0.16，更优选为 1 1. 1Χ1(Γ3 1 0. 07。
上述载体例如为珠时，优选使用多个珠。上述珠的形状没有特别限制，例如，可以 列举正球、大致真球、椭园球等。上述珠的平均直径例如为30nm 100 μ m,优选为30nm 20 μ m，更优选为30nm 5μπι。例如，在从50 μ L全血回收核酸时，上述多个珠的总表面积 (Z)例如为5 2000cm2，优选为10 2000cm2，更优选为200 2000cm2。另外，上述珠的 填充率例如为0. 1 10%，优选为0. 1 5%，更优选为1 5%。使上述处理液与上述载体接触、使上述核酸复合体被上述载体捕获时的处理条 件没有特别限制，但处理温度例如为15 40°C，优选为20 35°C，特别优选为室温(约 250C )；处理时间例如为1秒 10分钟，优选为30秒 5分钟。使上述处理液与上述载体接触的方法没有特别限制，如上所述，例如可以根据上 述载体的形状等适当决定。上述两者例如可以在微量离心管、试管、具备流路的芯片等的 容器内接触。具体而言，既可以通过将上述载体和上述处理液加入上述容器内而使上述两 者接触，也可以通过将上述处理液加入预先固定有上述载体的上述容器内而使上述两者接 触。另外，如后所述，例如通过在芯片等的流路内配置上述载体，在上述流路中流动上 述处理液，使之通过上述载体的内部，也可以使两者接触。如果根据这样的方法，就可以将 上述处理液中的核酸复合体保持在上述载体上，并能够除去此外的成分。在这里，所谓“通 过上述载体”，意指例如上述处理液进入上述载体内部，在上述载体内部移动。特别优选供 给上述载体的上述处理液的全部或一部分进入上述载体内部，从上述载体内部向上述载体 的外部穿过。这样，如果使上述处理液从上述载体内部向上述载体外部通过，例如，就能够 减少上述载体内残留的上述处理液中的不需要成分的量。由此就能够进一步减少在最终得 到的核酸试样中的不需要成分的含量。另外，例如也可以通过在芯片等的流路内配置多个 上述载体(例如珠)，使上述处理液通过上述载体与载体之间而使两者接触。由此，也与上 述同样地可以使上述核酸复合体保持在上述载体上，并能够除去此外的成分。上述处理液 例如通过减压或加压能够通过上述流路内的上述载体内部或上述载体之间。分离工序接着，分离上述载体和上述处理液。上述两者的分离方法没有特别限制，例如可以 根据上述载体的形状及其配置状态等适当决定。上述载体不被固定在容器中时，例如，通过 从上述容器中取出上述载体或上述处理液能够分离两者。另外，在上述磁性体珠的情况下， 例如，通过以磁铁等回收珠能够分离两者。另一方面，上述载体被固定在容器中时，例如通 过从上述容器中除去(排出)上述处理液能够分离两者。另外，如上所述地在流路内配置 上述载体时，通过使上述处理液通过上述载体内部或在多个上述载体与载体之间，例如，能 够使从血中细胞释放入上述处理液中的核酸复合体被上述载体捕获，并且分离上述处理液 和上述载体。分散介质的添加工序接着，在除去了上述处理液的上述载体中添加分散介质。其中，上述分散介质的添 加既可以这样地在后续工序的加热处理前进行，也可以在加热处理后进行。优选通过上述分散介质的添加，上述载体成为在上述分散介质中浸渍的状态。上 述分散介质没有特别限制，可以列举水、各种缓冲液、缓冲生理食盐水等水性溶剂、有机溶 剂或它们的混合液。作为上述缓冲液，例如，可以列举！"ris-HCl、BES、MOPS、TES, HEPES,
13DIPSO、TAPSO, P0PS0、HEPPSO, EPPS, Tricine, Bicine, TAPS 等。上述缓冲液的浓度没有特 别限制，但例如为0. 1 100mmol/L，优选为0. 1 50mmol/L，特别优选为0. 1 10mmol/L。 上述分散介质的PH例如为7. 8 9. 5，优选为8. 5 8. 9。上述分散介质的添加比例没有特别限制，例如，分散介质的体积(D)相对于在上 述(A)工序处理的全血体积(X)的比(体积比X D)例如为1 0.5 1 10，优选为 1 0. 5 1 5，更优选为1 1 1 3。另外，在向上述载体供给上述分散介质前，例如也可以进行清洗液的供给和除去。 由此能够进一步排除在上述载体中残留的不需要成分。作为上述清洗液没有特别限制，例 如，可以使用和上述分散介质同样的物质。另外，在供给上述分散介质前实施加热处理时， 优选在上述加热处理之前向上述载体供给清洗液和除去清洗液。加热处理工序对上述分散介质中的上述载体实施加热处理。由此，从上述载体所捕获的上述核 酸复合体中释放核酸，上述被释放的核酸在上述分散介质中被解离(游离)。加热处理的温度没有特别限制，但例如为50 130°C，优选为80 130°C，更优选 为90 100°C。加热处理例如既可以在一定的温度下进行，也可以连续地或阶段地使温度 上升。另外，处理时间没有特别限制，但例如为1 30分钟，优选为1 5分钟。另外，在添加上述分散介质之前进行加热处理时，可以通过加热处理使核酸从上 述核酸复合体释放后，添加上述分散介质使释放的上述核酸在上述分散介质中游离。接着，回收加热处理后的上述分散介质。如上所述，因为核酸被释放在上述分散介 质中，所以，可以将该分散介质作为含有来自全血的核酸的核酸试样回收。由本发明得到的 核酸试样的用途没有特别限制，例如，优选在后述的核酸扩增中使用。另外，对于全血以外 的细胞试样而言，也能够同样地进行处理，回收核酸试样。如果根据本发明的方法，例如，上述细胞试样是全血，处理的全血是50 μ L，使用的 上述处理试剂是50 μ L，上述分散介质是100 μ L时，例如能够回收100 10000copy/ μ L的 核酸试样。如果是该量的核酸，例如，在PCR法等核酸扩增法中就能够作为充分的模板。另 外，如果根据本发明的方法，不仅基因组DNA和RNA，而且以往回收困难的线粒体DNA也能够 回收。(第2实施方式)在本发明的制造方法中，细胞是真核细胞，含有真核细胞的细胞试样是冷藏保存 或冷冻解冻后的试样时，例如优选以下所示的第2制造方法。本发明的第2制造方法，例 如，是上述(A)工序是混合不添加表面活性剂且含有蛋白酶的处理试剂和冷冻解冻后或冷 藏保存后的上述细胞试样的m工序的制造方法。在本发明的第2制造方法中使用的上 述处理试剂例如也称为“第2处理试剂”。另外，只要没有特别表示，第2制造方法例如取代 上述(α )工序而进行上述m工序即可，其它的能够和上述第1制造方法同样地进行。作为在本发明中的细胞试样，可以列举含有上述真核细胞的细胞试样。在本发明 的第2制造方法中，上述第2处理试剂如上所述地可以使用不添加表面活性剂且含有蛋白 酶的试剂。冷冻解冻后或冷藏保存后的细胞试样中，因为真核细胞的一部分或大部分细胞 膜被破坏，所以，可以省略例如由表面活性剂进行的细胞膜破坏，推测即使是不含有表面活 性剂的上述处理试剂，也能够有效地释放核酸复合体。因此，可以进一步降低处理试剂的成本。另外，该推测对本发明没有任何限制。上述细胞试样的冷冻解冻条件没有任何限制，在将细胞冷冻后进行解冻即可。冷 冻温度例如为-15 _200°C，解冻温度例如为4 50°C。另外，上述细胞试样的冷藏保存 条件没有任何限制，冷藏温度例如为0 8°C，保存时间例如为4日 1年，也可以是1周 1个月。上述第2处理试剂，例如既可以从冷藏保存前或冷冻保存前向上述细胞试样中添 加，也可以在冷藏保存后或冷冻解冻后向上述细胞试样中添加。上述第2处理试剂的组成除了不添加表面活性剂以外，与在上述第1制造方法中 的第1处理试剂是同样的。另外，在混合上述第2处理试剂和细胞试样而得到的处理液中， 蛋白酶相对于真核细胞及细胞试样的比例也与上述第1制造方法是同样的。(第3实施方式)在本发明的制造方法中，细胞是真核细胞，含有真核细胞的细胞试样是冷冻解冻 后的试样时，例如优选以下所示的第3制造方法。本发明的第3制造方法，例如，是上述(A) 工序是混合不添加表面活性剂且不添加蛋白酶的处理试剂和冷冻解冻后的上述细胞试样 的(Α； )工序的制造方法。在本发明的第3制造方法中使用的上述处理试剂，例如也称为 “第3处理试剂”。另外，只要没有特别表示，第3制造方法例如取代上述(Al)或m工序 而进行上述(Α； )工序即可，其它的能够与上述第1或第2制造方法同样地进行。另外，在 第3制造方法中，例如，可以在上述(A)工序中不与上述第3处理试剂混合，在上述(B)工 序中使上述冷冻解冻后的上述细胞试样接触上述载体。作为在本发明中的细胞试样，可以列举含有上述真核细胞的细胞试样。在本发明 的第3制造方法中，上述第3处理试剂，如上所述可以使用不添加表面活性剂且不添加蛋白 酶的试剂。可以认为冷冻解冻后的细胞试样中，真核细胞的一部分或大部分细胞膜及核膜 被破坏，同时，在一部分细胞中，在核内，包装核酸的蛋白质发生变性，丧失了包装的功能， 由此释放核酸复合体。因此，例如即使是不含有表面活性剂和蛋白酶的处理试剂，也能够有 效地使核酸复合体释放。因此，可以进一步降低处理试剂的成本。上述细胞试样的冷冻解冻条件没有任何限制，在将细胞冷冻后进行解冻即可。冷 冻温度例如为-15 _200°C，解冻温度例如为4 50°C。上述第3处理试剂，例如既可以从冷冻保存前向上述细胞试样中添加，也可以在 冷冻解冻后向上述细胞试样中添加。上述第3处理试剂的组成，例如，除了不添加表面活性剂和蛋白酶以外，与在上述 第1制造方法中的第1处理试剂是同样的，例如，可以列举上述的各种溶剂等。(第4实施方式)在本发明的制造方法中，细胞是原核细胞，含有原核细胞的细胞试样是冷藏保存 或冷冻解冻后的试样时，例如优选以下所示的第4制造方法。本发明的第4制造方法，例 如，是上述(A)工序是将含有上述原核细胞的细胞试样冷冻解冻或冷藏保存的工序的制造 方法。另外，只要没有特别表示，第4制造方法例如取代上述(Al)、(A2)或(Α； )工序而进 行上述(A4)工序即可，其它的能够与上述第1至第3制造方法同样地进行。作为在本发明中的细胞试样，可以列举含有上述原核细胞的细胞试样。在第4制 造方法中，例如，只将细胞试样冷藏保存或冷冻解冻就能够使上述核酸复合体释放。
在第4制造方法中，例如，通过如上所述地在上述(A)工序中将上述细胞试样冷冻 解冻或冷藏保存，就能够得到使核酸复合体从上述细胞中释放了的处理液。该上述(A)工 序后的处理液，例如在使之接触上述载体的上述(B)工序前，例如优选与处理试剂混合。作 为上述处理试剂，例如，可以列举不含有上述蛋白酶和上述表面活性剂中的任意一种的试 剂或含有上述蛋白酶和上述表面活性剂中的任意一种且不添加另一种的试剂。在本发明的 第4制造方法中使用的上述处理试剂，例如也称为“第4处理试剂”。在上述第4试剂含有 蛋白酶或表面活性剂时，其添加比例例如与在上述第1制造方法中的第1处理试剂是同样 的。另外，相对于细胞试样的添加比例也与上述第1制造方法是同样的。在上述第4试剂 不含有蛋白酶和表面活性剂时，上述第4处理试剂，例如除了不添加这些试剂以外，与在上 述第1制造方法中的第1处理试剂是同样的，例如，可以列举上述的各种溶剂等。冷冻解冻后或冷藏保存后的细胞试样中，原核细胞的细胞壁被破坏，或变得容易 被破坏。这样，由于原核细胞不存在细胞核，所以，如上所述地细胞壁被破坏或变得容易被 破坏。由此，例如即使是不含表面活性剂和蛋白酶或不含其任意一种的第4处理试剂，也能 够有效地使核酸复合体释放。因此，可以进一步降低处理试剂的成本。上述第4处理试剂，例如，既可以从冷藏保存前或冷冻保存前向上述细胞试样中 添加，也可以在冷藏保存后或冷冻保存后向上述细胞试样中添加。〈扩增产物的制造方法〉如以上那样由本发明的核酸试样制造方法得到的核酸试样，例如，能够作为各种 核酸扩增方法的模板试样使用。因此，本发明是通过核酸扩增方法制造目的序列的核酸扩 增产物的方法，其特征在于，包括下述(a)和(b)工序。另外，本发明也可以称为目的序列 的扩增方法。(a)通过本发明的核酸试样制造方法，从含有细胞的细胞试样回收核酸试样的工 序，(b)以上述(a)工序中回收的上述核酸试样中的核酸为模板，通过核酸扩增方法 制造上述模板中的目的序列的核酸扩增产物的工序。本发明的核酸扩增产物的制造方法的特征在于通过本发明的核酸试样制造方法 回收核酸方面，其它工序和条件等没有任何限制。另外，如上所述，如果根据本发明的核酸 试样制造方法，能够得到可以作为模板使用的充分量的核酸，因此，例如能够将上述(a)工 序的核酸直接在上述(b)工序中使用。在上述(b)工序中的核酸扩增方法的种类没有任何限制，可以列举以往公知的扩 增方法。作为具体例子，可以列举 PCR(Polymerase Chain Reaction)法、NASBA(Nucleic acid sequence based amplification!)(Transcription-mediated amplification) 法、SDA(Strand Displacement Amplification)法、SMart Amplification Process 法、 LAMP(Loop-Mediated Isothermal Amplification)法、ICAN(Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids)法等。另外，各种核酸扩增方法的 工序和反应条件等没有限制，例如，可以按照以往公知的条件进行。作为在上述核酸扩增方法中使用的试剂，没有特别限制，可以使用以往公知的试 剂，例如，可以列举聚合酶、核苷三磷酸(dNTP)、缓冲剂、水和缓冲液等溶剂。此外，例如也可 以含有甘油、肝素、甜菜碱、KCl、MgCl2、MgS04等。
〈核酸回收用试剂〉本发明的第1核酸回收用试剂是用于在本发明的第1核酸试样制造方法中使用的 试剂，含有上述蛋白酶和上述表面活性剂。本发明的第1核酸回收用试剂，例如与在本发明 的第1核酸试样制造方法中的第1处理试剂是同样的。在上述核酸回收用试剂中，其特征在 于，上述蛋白酶和表面活性剂在与上述细胞试样混合时，以使上述蛋白酶相对于IXio2 IXlO9个上述细胞的比例例如为0. 02mU以上，上述表面活性剂相对于1 X IO2 1 X IO9个 上述细胞的比例为1毫微微摩尔以上的方式配合。另外，本发明的第1核酸回收用试剂，例如，在与上述细胞试样混合时，以使上述 蛋白酶和表面活性剂成为上述范围的方式配合即可。本发明的第2核酸回收用试剂是用于在本发明的第2核酸试样制造方法中使用的 试剂，没有特别限制，至少含有蛋白酶即可，在与上述细胞试样混合时，优选以成为与上述 第1处理试剂同样范围的方式含有上述蛋白酶。本发明的第2核酸回收用试剂，例如与本 发明的第2核酸试样制造方法中的第2处理试剂是同样的。另外，本发明的第3核酸回收 用试剂是用于在本发明的第3核酸试样制造方法中使用的试剂，例如，既可以是含有上述 蛋白酶和上述表面活性剂中的任意一种，也可以是均不含有的溶剂。本发明的第3核酸回 收用试剂，例如与在本发明的第3核酸试样制造方法中的第3处理试剂是同样的。本发明的 第4核酸回收用试剂是用于在本发明的第4核酸试样制造方法中使用的试剂，例如，既可以 是上述蛋白酶和上述表面活性剂中的任意一种均不含有的溶剂，也可以是含有上述蛋白酶 和上述表面活性剂中的任意一种且不添加另一种的溶剂。本发明的第4核酸回收用试剂， 例如与在本发明的第4核酸试样制造方法中的第4处理试剂是同样的。本发明的各核酸回收用试剂，例如，既可以是液体，也可以是固体。当为液体时，例 如，既可以将原液直接作为上述的处理试剂使用，也可以将在使用前将稀释的稀释液作为 上述的处理试剂使用。当为固体时，例如，在与上述细胞试样混合前，在上述的处理试剂的 溶剂中溶解或分散，也能够将其作为上述的处理试剂使用。本发明的各核酸回收用试剂，例 如，还可以含有其它成分。使用本发明的核酸回收用试剂，例如进行从细胞回收核酸以及目 的序列的核酸扩增时，本发明的各核酸回收用试剂还可以适当含有在核酸扩增中必须的成 分，例如，可以列举聚合酶、核苷三磷酸(dNTP)、缓冲剂、水和缓冲液等溶剂等。本发明的各 核酸回收用试剂，例如，也可以称为用于在本发明的核酸扩增产物制造方法中使用的制造 用试剂。〈核酸回收用试剂盒〉本发明的第1核酸回收用试剂盒是用于在本发明的第1核酸试样制造方法中使用 的试剂盒，其特征在于，包含上述载体、上述蛋白酶和上述表面活性剂。在本发明中，上述载 体、上述蛋白酶和上述表面活性剂如上所述。本发明的第1核酸回收用试剂盒中，作为上述载体，例如可以包含后述的具有上 述载体的本发明的核酸回收用芯片或核酸扩增用芯片。在本发明的第1核酸回收用试剂盒中，上述蛋白酶和上述表面活性剂，例如，既可 以分别收容在不同容器中，也可以两者共存收容在同一容器中。在上述蛋白酶和上述表面 活性剂共存时，本发明的第1核酸回收用试剂盒例如优选含有上述载体和上述本发明的第 1核酸回收用试剂。上述本发明的第1核酸回收用试剂如上所述，可以含有上述蛋白酶和上
17述表面活性剂，既可以是液体，也可以是固体。在本发明的第1核酸回收用试剂盒中，上述 蛋白酶和上述表面活性剂的比例没有特别限制，例如，在使用时，以能够成为上述那样的比 例的方式使用即可。本发明的第2核酸回收用试剂盒是用于在本发明的第2核酸试样制造方法中使用 的试剂盒，没有特别限制，包含上述载体和上述蛋白酶，例如，可以包含上述载体和上述本 发明的第2核酸回收用试剂。另外，本发明的第3核酸回收用试剂盒是用于在本发明的第 3核酸试样制造方法中使用的试剂盒，例如，既可以包含上述载体和上述蛋白酶以及上述表 面活性剂中的任意一种，也可以包含上述载体、和上述蛋白酶与上述表面活性剂均不含有 的溶剂，另外，例如，可以含有上述载体和上述本发明的第3核酸回收用试剂。本发明的第 4核酸回收用试剂盒是用于在本发明的第4核酸试样制造方法中使用的试剂盒，例如，既可 以包含上述载体、和上述蛋白酶与上述表面活性剂均不含有的溶剂，也可以包含上述载体、 和含有上述蛋白酶与上述表面活性剂中的任意一种且不添加另一种的溶剂，另外，例如，可 以含有上述载体和上述本发明的第4核酸回收用试剂。本发明的各核酸回收用试剂盒，例如，还可以包含使用说明书。另外，本发明的各 核酸回收用试剂盒，例如，还可以包含其它成分。使用本发明的核酸回收用试剂盒例如进行 来自细胞的核酸的回收以及目的序列的核酸扩增时，本发明的核酸回收用试剂盒还可以适 当含有在核酸扩增中必须的成分，例如，可以列举聚合酶、核苷三磷酸(dNTP)、缓冲剂、水和 缓冲液等溶剂等。本发明的核酸回收用试剂，例如，也可以称为用于在本发明的核酸扩增产 物制造方法中使用的制造用试剂盒。〈核酸回收用芯片〉本发明的核酸回收用芯片是用于在本发明的核酸试样制造方法中使用的芯片，具 有芯片主体和上述载体，上述芯片主体的特征在于，具备液体流路，上述载体配置在上述流 路内。通过使用本发明的核酸回收用芯片和上述本发明的核酸回收用试剂，例如，能够实施 本发明的核酸试样制造方法。本发明的核酸回收用芯片，例如在上述细胞试样和上述处理试剂等液体通过的流 路中配置上述载体即可，不受其它的结构和形状等的任何限制。以下，例示本发明的核酸回 收用芯片的形态，但本发明不受此限制。(第1核酸回收用芯片)第1核酸回收用芯片例如具有上述芯片主体和上述载体，上述芯片主体具有液体 的流路，上述流路的一端具备用于导入和排出液体的第1开口部，上述流路的另一端具备 能够与压力控制单元连接的第2开口部，在上述流路内配置上述载体。上述载体，例如，既 可以是作为滤器的片状载体，也可以是多个珠状载体。上述第1核酸回收用芯片，例如，在使用时，在上述第2开口部连接压力控制单元， 由上述压力控制单元将上述流路控制在减压条件，由此可以将液体从上述第1开口部导入 上述流路内部，由上述压力控制单元将上述流路控制为加压条件，由此可以将被导入的液 体从上述第1开口部排出到上述流路外部。因此，如果首先以减压条件将含有上述细胞试 样的上述处理液导入上述流路内部，择上述处理液就通过所配置的上述载体。因此，例如利 用上述处理试剂从细胞试样中的细胞释放的核酸复合体在通过的时候就被上述载体捕获。 接着，如果以加压状态将被导入的上述处理液向上述流路外部排出，就可以除去来自上述细胞试样的不需要成分。然后，如果以减压条件将上述分散介质导入上述流路内部后，在上 述分散介质的存在下对上述载体实施加热处理，则核酸就从上述载体所捕获的上述核酸复 合体释放到上述分散介质中。因此，如果在加压条件下向上述流路外部排出上述分散介质， 就可以将含有上述核酸的分散介质作为核酸试样回收。核酸回收用芯片和压力控制单元的 连接既可以是直接的，也可以是间接的。另外，上述细胞试样和上述处理试剂的导入方法没 有特别限制，例如，既可以是预先准备混合有上述细胞试样和上述处理试剂的处理液而将 其导入，也可以是反复导入一种并将其排出至另一种中的操作(移液)，最终导入上述处理 液。作为这样的形态的核酸回收用芯片，例如，可以列举安装在抽吸装置上使用的移 液器吸头。此时，例如，手动和自动的吸移器等的抽吸装置相当于上述压力控制单元。作为 上述第1核酸回收用芯片，列举移液器吸头，使用图1进行说明。该图是核酸回收用移液器 吸头(以下称为“移液器吸头”)的截面图。如该图中所示，移液器吸头1具备中空的圆锥 状主体13、作为液体导出口的第1开口部11和能够安装在移液器上的第2开口部12，在圆 锥状主体13的内部，在第1开口部11 一侧配置有载体10。在移液器吸头1中，圆锥状主体 13的内部空隙成为液体的流路以及被导入的液体的容纳部。上述移液器吸头的大小和形状没有特别限制，例如，可以根据导入的含有上述细 胞试样的上述处理液的量适当设定。另外，由于本发明的核酸回收用芯片如上所述以具备 上述载体为特征，所以，例如能够通过仅在市售的移液器吸头中配置上述载体而制造。另 外，向移液器等抽吸装置安装的方法也可以和以往同样地进行。使用图2说明使用移液器吸头1的核酸试样制造方法(核酸回收方法)的一个例 子。另外，本发明不受此限制。图2是表示使用移液器吸头的核酸试样制造方法的工序概 略的截面图。在图2中，在与图1相同的地方标注相同符号。首先，将移液器吸头1从第2开口部12安装在移液器(未图示)上。然后，如图 2(A)中所示，通过移液器的操作，从第1开口部11抽吸处理液20。此时，优选抽吸的全部 处理液20通过移液器吸头1内的载体10。由此，在处理液20中所释放的核酸复合体被载 体10捕获。接着，如图2(B)中所示，由移液器的操作将抽吸的处理液20从第1开口部11 向外部排出。这里被排出的处理液20’，其核酸复合体被载体所除去，是核酸回收中不需要 的成分，例如是含有红细胞等的液体。接着，如图2(C)中所示，由移液器的操作从第1开口 部11抽吸分散介质30。此时，优选移液器吸头1内的载体10被抽吸的分散介质30充满。 然后，以该状态，即以载体10存在于分散介质30中的状态进行如上所述的加热处理。最后， 如图2(D)中所示，由移液器的操作从第1开口部11将加热处理后的分散介质40向外部排 出。在排出的分散介质40中，如上所述含有从载体10所捕获的上述核酸复合体中释放的 核酸。如果将该分散介质40作为核酸试样回收，例如，就可以在核酸扩增的模板试样中利 用。该核酸试样由于在图2(B)所示的工序中排出了核酸回收中不需要的成分，所以也减少 了上述不需要的成分的含量。(第2核酸回收用芯片)第2核酸回收用芯片，例如具有上述芯片主体和上述载体，上述芯片主体具有液 体的流路，上述流路的一端具备能够与加压单元连接且用于导入液体的第1开口部，上述 流路的另一端具备用于排出液体的第2开口部，在上述流路内配置本发明的核酸回收用载体。上述第2核酸回收用芯片在使用时，在上述第1开口部连接加压单元，通过由上述 加压单元对液体加压，可以将上述液体从上述第1开口部导入上述流路内部，由上述加压 单元对上述流路加压，可以将被导入的液体从上述第2开口部向上述流路外部排出。因此， 如果首先在加压条件下向上述流路内部导入上述处理液，则因为上述处理液通过被配置的 上述载体，所以上述处理液中的核酸复合体被上述载体所捕获。接着，如果在加压条件下向 上述流路外部排出上述处理液，就可以除去来自细胞试样的不需要的成分。然后，如果在加 压条件下向上述流路内部导入上述分散介质后，在上述分散介质的存在下对上述载体实施 加热处理，核酸就从上述载体所捕获的上述核酸复合体中释放入上述分散介质中。因此，如 果在加压条件下将上述分散介质向上述流路外部排出，就可以将含有核酸的分散介质作为 核酸试样回收。另外，核酸回收用芯片与加压单元的连接既可以是直接的，也可以是间接的 (以下同样)。作为这样形态的核酸回收用芯片，例如，可以列举由表面形成有凹状流路的支撑 基板和覆盖上述表面的覆盖基板形成的所谓生物芯片。作为上述第2核酸回收用芯片，列 举生物芯片，使用图3进行说明。该图是表示核酸回收用生物芯片(以下称为“生物芯片”) 的概略的模式图，㈧是侧面图，⑶是上面图，⑶是上述⑶的A-A方向的截面图。另外， 该图(C)是构成生物芯片的支撑基板22的上面图。如在该图中所示，生物芯片2包括支撑 基板22和覆盖基板21。在支撑基板22的表面，流路23、从流路23分支的流路27、与流路 27连接的排液部M、与流路23连接的核酸含有液(核酸试样)的收容部25形成为凹状的 沟。覆盖基板21覆盖在支撑基板22的形成有凹状沟的表面上，由此，流路23的末端(图 中左端)成为液体的导入口 26。然后，在流路23内部，比排液部M和收容部25的连接部 更靠近导入口沈一侧配置载体10。流路23与核酸试样的收容部25连接，并通过流路27 与排液部M连接，但向排液部M导入液体和向收容部25导入液体是能够适当切换的。生 物芯片的大小和形状没有特别限制。作为使用生物芯片2的核酸回收方法，使用图3对使用注射器加压等的加压送液 装置的一个例子进行说明。另外，本发明不受其限制。由加压送液装置(未图示)从导入口沈送入处理液。由此，被送入的处理液通过 配置在流路23内的载体10，通过流路27收容在排液部M中。这样，释放入处理液中的核 酸复合体被载体10捕获。在这里，收容在排液部M的处理液中，上述核酸复合体被载体10 除去，是含有核酸回收中不需要的成分，例如红细胞等的液体。接着，同样操作，由加压送液 装置从导入口沈送入分散介质。此时，流路23内的载体10优选被分散介质充满。然后， 以该状态，即以载体10存在于分散介质中的状态进行上述那样的加热处理。最后，由加压 送液装置使加热处理后的分散介质移动到核酸含有液的收容部25中。在收容部25所收容 的分散介质中，如上所述含有从被捕获的上述核酸复合体中释放的核酸。以该含有核酸的 分散介质作为核酸试样，能够用于例如核酸扩增的模板试样。另外，该核酸试样由于排出了 核酸回收中不需要的成分，所以也降低了上述不需要的成分的含量。上述方法是通过加压将液体导入和排出的例子，但本发明不受其限制。S卩，例如也 可以(1)通过减压导入和排出液体，( 通过加压导入液体且通过减压排出液体，或者(3) 通过减压导入液体且通过加压排出液体。作为在上述(1)的方法中使用的核酸回收用芯片，例如，优选上述芯片主体在上述流路的一端具备用于导入液体的第1开口部，在上述流 路的另一端具备能够与减压单元连接且用于排出液体的第2开口部。该核酸回收用芯片， 例如，优选在使用时，在上述第2开口部连接减压单元，由上述减压单元对上述流路内部进 行减压，从上述第1开口部将上述液体导入上述流路内部，并且从上述第2开口部将被导入 的液体向上述流路外部排出。其中，核酸回收用芯片和减压单元的连接既可以是直接的，也 可以是间接的(以下同样)。另外，作为在上述O)的方法中使用的核酸回收用芯片，例如， 优选上述芯片主体在上述流路的一端具备能够与加压单元连接且用于导入液体的第1开 口部，在上述流路的另一端具备能够与减压单元连接且用于排出液体的第2开口部。该核 酸回收用芯片，例如，优选在使用时，在上述第1开口部与加压单元连接，由上述加压单元 对液体进行加压，将上述液体从上述第1开口部导入上述流路内部，在上述第2开口部与加 压单元连接，由上述减压单元对上述流路内部进行减压，将被导入的液体从上述第2开口 部向上述流路外部排出。另外，作为在上述(3)方法中使用的核酸回收用芯片，例如，上述 芯片主体在上述流路的一端具备能够与加压单元连接且用于导入液体的第1开口部，在上 述流路的另一端具备能够与减压单元连接且用于排出液体的第2开口部，在使用时，优选 在上述第2开口部与减压单元连接，由上述减压单元对上述流路内部进行减压，将上述液 体从上述第1开口部导入上述流路内部，在上述第1开口部与加压单元连接，由上述加压单 元对上述流路进行加压，将被导入的液体从上述第2开口部向上述流路外部排出。这些形 态能够通过组合例如使导入液体的第1开口部能够与加压单元连接或者使排出液体的第2 开口部能够与减压单元连接等而适当设定。另外，作为上述载体，例如也可以使用多个珠状等的载体。此时，例如，可以列举在 上述流路内填充了上述珠状载体的形态。在本形态中，例如，通过在上述流路中输送上述处 理液，使上述处理液通过上述珠状载体之间，此时，在各珠状载体的表面捕获上述处理液中 的核酸复合体。另外，上述珠状载体例如为多孔质体时，不仅外侧表面，而且例如在空隙部 分的露出表面也能够捕获上述核酸复合体。本发明的核酸回收用生物芯片，例如，还可以具有进行使用核酸的各种反应的反 应部和检测部、收容上述反应中需要的试剂的试剂部等。具体而言，在核酸回收用生物芯片 内，上述收容部可以通过流路与反应部连接，另外，上述反应部也可以通过流路与上述试剂 部和检测部等连接。另外，可以预先在上述收容部中配置目的反应所需要的试剂，上述收容 部也可以通过流路与上述试剂部连接。在这样的形态中，例如，上述收容部成为上述反应 部。这样，通过这样将反应部与检测部等连接，例如，在一个生物芯片内，不仅能够回收来自 细胞试样的核酸，还能够使用回收的核酸进行目的反应，进而测定该反应的结果。因此，通 过在使用核酸的各种分析中，例如在核酸扩增和SNP检测等中利用本发明，就能够比以往 更简便地进行分析。另外，由于本发明的核酸回收用芯片仅在流路中配置上述载体就足矣， 所以也使例如生物芯片的小型化成为可能。作为这样的生物芯片的构成形态，作为一个例 子，以下列举核酸扩增用芯片。〈核酸扩增用芯片〉本发明的核酸扩增用芯片是用于在本发明的核酸扩增产物制造方法中使用的芯 片，其特征在于，具备芯片主体和载体，上述芯片主体具有导入液体的开口部、收容排液的 排液部、实施核酸扩增反应的反应部和液体的流路，上述流路的一段是上述开口部，上述流
21路与上述排液部和上述反应部连接，在上述流路内，在比上述排液部和上述反应部的连接 部更靠近上述开口部一侧配置上述载体。通过使用本发明的核酸扩增用芯片和上述本发明 的核酸回收用试剂，例如能够实施利用本发明的核酸试样制造方法的核酸扩增产物制造方法。本发明的核酸扩增用芯片，只要在上述处理液、上述细胞试样和上述处理试剂等 液体通过的流路中具备上述载体即可，其它的构成和形状没有限制。本发明的核酸扩增用芯片，例如，在上述流路(第1流路)以外，还包括第2流路和 第3流路，上述反应部可以通过上述第2流路直接或间接地与上述第1流路连接，上述排液 部可以通过上述第3流路直接或间接地与上述第1流路连接。另外，本发明的核酸扩增用 芯片，例如，优选向上述排液部导入液体和向上述反应部导入液体是能够切换的。更具体而 言，例如，进一步优选向上述第2流路导入液体和向上述第3流路导入液体是能够切换的， 由此使向上述排液部导入液体和向上述反应部导入液体是能够切换的。在本发明中，从上述载体捕获的上述核酸复合体释放核酸以及扩增反应所需要的 处理都是加热处理。因此，如果使用本发明的核酸扩增用芯片，例如，仅通过在具备温度控 制单元的装置中安装并进行温度控制，就能够实施核酸的回收与扩增反应。作为这样形态的核酸扩增用芯片，例如，可以列举由表面有形成凹状流路的支撑 基板、覆盖上述表面的覆盖基板形成的所谓生物芯片。作为本发明的扩增用芯片，列举生物 芯片，使用图4进行说明。其中，在图4中表示的生物芯片，只要没有特别表示，则与在图3 中表示的生物芯片是同样的形态，另外，可以同样操作使用。图4是表示核酸扩增用生物芯片(以下称为“生物芯片”)概略的模式图，(A)是 侧面图，(B)是上面图，(D)是上述⑶的A-A方向的截面图。另外，该图(C)是构成生物 芯片的支撑基板22的上面图。在该图中，在与图3相同的地方标注相同的符号。如该图所 示，生物芯片3包括支撑基板22和覆盖基板21。在支撑基板22的表面，作为凹状的沟，形 成第1流路23、与第1流路23连接的第3流路27、与第3流路27连接的排液部24、与第1 流路23连接的核酸含有液(核酸试样)的收容部25、与收容部25连接的第2流路33、与 第2流路33连接的反应部31。覆盖基板21覆盖在支撑基板22的形成凹状沟的表面上，由 此，流路23的末端(图中左端)成为液体的导入口 26。这样，在流路23内部，在比排液部 24和收容部25的连接部(和第3流路27的连接部)更靠近导入口沈一侧配置载体10。 另外，流路23与核酸含有液的收容部25连接，并通过第3流路27与排液部M连接，但向 排液部M导入液体和向收容部25导入液体是能够适当切换的。在生物芯片3中，例如，进一步使收容部25所容纳的核酸含有液通过第2流路33 移动到反应部31。这样，在将扩增反应所需要的试剂配置在反应部31时，可以直接使扩增 反应开始。另外，在具备收容个别试剂的试剂部(未图示)时，例如，在将试剂部内的试剂 送入反应部31后，可以使扩增反应开始。扩增反应的检测，例如可以在反应部31中直接进 行，此外，在具备检测部(未图示)时，例如可以将反应液从反应部31送入检测部，在上述 检测部进行检测。实施例接着，说明本发明的实施例，但是本发明不受下述实施例的限制。[实施例1]
将下述表2中所示的各种载体(la和lb)切成直径2mm的圆形，如图5中所示那 样将其安装在夹具装置上。图5是安装了载体的夹具装置的模式图。在该图中，(A)是安 装了载体的夹具装置的上面图，(B)是上述㈧的I - I方向截面图，(C)是表示液体相对于载体的通过方向的模 式图。夹具装置4具有流路23和载体10，在流路23的轴向中央附近配置载体10。具体而 言，在夹具装置4中，载体10配置在铝制的凹状部件6a的凹部，再在上述凹部嵌入铝制的 凸状部件6b的凸部，由此被固定在由凹状部件6a和凸状部件6b构成的铝块内。另外，虽 然未图示，但上述铝块以使底面(在该图(B)中下侧的面)露出的方式用塑料制部件固定。 将夹具装置4配置在热块上。在各图中，使上述露出的底面接触。各图中的箭头表示液体 的前进方向。如该图(C)的箭头所示，在本实施例中，液体从载体10的圆形表面导入，从另 一个表面排出。另一方面，混合50 μ L全血和50 μ L下述表1的处理试剂1-1，准备了 100 μ L处理 液。在上述处理液中，相对于50 μ L全血，蛋白酶的添加量为5. 4U，表面活性剂的添加比例 为0. 25体积％。然后，将100 μ L上述处理液从夹具装置4的流路23 —端的开口部通过加 压注入流路23内部，使之通过载体10，从流路23另一端的开口部排出。接着，同样操作注 入100 μ L下述表1的清洗液，使之通过载体10后排出。然后，由热块将夹具装置4内的载 体10以96°C加热5分钟后，同样操作注入100 μ L下述表1的分散介质，使上述分散介质通 过在载体10，并排出上述分散介质。以排出的上述分散介质作为核酸试样。[表1](处理试剂1-1)尿素1. 5mol/L蛋白酶K4μ g(108mU)/MlTris-HCl (pH8. 9) 20mmol/LNonidet (商标)P_40 0. 5%(清洗液和分散介质)Tris-HCl (pH8.6) lmmol/LEDTA0. lmmol/L[表2]
权利要求
1.一种从细胞回收核酸的核酸试样制造方法，其特征在于，包括下述(A) (E)工序(A)对于含有所述细胞的细胞试样，使核酸复合体从所述细胞中释放的工序；(B)使所述(A)工序后的含有所述细胞试样的处理液与载体接触的工序；(C)分离所述载体和所述处理液的工序；(D)对所述载体实施加热处理的工序；(E)在所述(D)工序之前或之后，向所述载体中添加分散介质的工序。
2.如权利要求1所述的制造方法，其特征在于所述(A)工序是混合含有蛋白酶和表面活性剂的处理试剂与所述细胞试样的工序， 在混合所述处理试剂和所述细胞试样而得到的处理液中，所述蛋白酶的浓度为0. 5mU/ μ L以上，表面活性剂的浓度为0. 1体积％以上。
3.如权利要求2所述的制造方法，其特征在于在所述处理液中，所述蛋白酶的浓度为0. 5 IOOOmU/μ L，所述表面活性剂的浓度为 0. 1 20体积％。
4.如权利要求2所述的制造方法，其特征在于在所述处理液中，所述蛋白酶相对于IXlO2 IXlO9个所述细胞的比例为0. 02mU以 上，所述表面活性剂相对于1 X IO2 1 X IO9个所述细胞的比例为1毫微微摩尔(1 X 10_15 摩尔)以上。
5.如权利要求2所述的制造方法，其特征在于在所述处理液中，所述蛋白酶相对于50 μ L所述细胞试样的比例为0. 02mU以上，所述 表面活性剂相对于50 μ L所述细胞试样的比例为1毫微微摩尔以上。
6.如权利要求2所述的制造方法，其特征在于所述蛋白酶是选自蛋白酶K、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、组织蛋白酶D和木瓜蛋白酶中 的至少一种蛋白酶。
7.如权利要求2所述的制造方法，其特征在于 所述表面活性剂是非离子型表面活性剂。
8.如权利要求7所述的制造方法，其特征在于所述非离子型表面活性剂是选自聚氧乙烯对异辛基酚、聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂 酸酯、聚氧乙烯壬基酚醚和壬基酚多硫代乙氧基化物中的至少一种表面活性剂。
9.如权利要求2所述的制造方法，其特征在于所述处理试剂还含有螯合剂和蛋白质改性剂中的至少一种。
10.如权利要求1所述的制造方法，其特征在于 所述细胞是真核细胞，所述(A)工序是混合不添加表面活性剂且含有蛋白酶的处理试剂与冷冻解冻后或冷 藏保存后的所述细胞试样的工序。
11.如权利要求1所述的制造方法，其特征在于所述细胞是选自血中细胞、唾液中细胞、口腔粘膜细胞、体细胞、生殖细胞和肿瘤细胞 中的至少一种。
12.如权利要求1所述的制造方法，其特征在于 所述细胞是培养细胞。
13.如权利要求1所述的制造方法，其特征在于所述细胞试样是选自血液、唾液、口腔粘膜、指甲和毛发中的至少一种。
14.如权利要求1所述的制造方法，其特征在于 所述细胞试样是细胞的培养物。
15.如权利要求1所述的制造方法，其特征在于 所述细胞试样是未稀释的细胞试样。
16.如权利要求1所述的制造方法，其特征在于 所述细胞是原核细胞，所述(A)工序是将含有所述原核细胞的细胞试样冷冻解冻或冷藏保存的工序。
17.如权利要求16所述的制造方法，其特征在于所述(A)工序是混合不添加蛋白酶且含有表面活性剂的处理试剂或不添加表面活性 剂且含有蛋白酶的处理试剂与冷冻解冻后或冷藏保存后的所述细胞试样的工序。
18.如权利要求1所述的制造方法，其特征在于所述载体是选自无纺布、纺织布和多孔质体中的至少一种。
19.如权利要求1所述的制造方法，其特征在于 所述载体是多孔质体，其平均孔径为10 1000 μ m。
20.如权利要求1所述的制造方法，其特征在于 所述载体是无纺布，其克重为20 150g/m3。
21.如权利要求1所述的制造方法，其特征在于 所述载体是纺织布，其网眼尺寸为10 1000 μ m。
22.如权利要求1所述的制造方法，其特征在于所述载体的形状是选自滤器状、片状、块状和珠状中的至少一种。
23.如权利要求1所述的制造方法，其特征在于 所述载体是珠，体积填充率为0.1 10%的范围。
24.如权利要求1所述的制造方法，其特征在于 所述载体是聚合物制载体和金属制载体中的至少一种。
25.如权利要求M所述的制造方法，其特征在于所述聚合物是选自聚丙烯、聚乙烯、聚酯、聚酰胺、聚氨酯、聚醚、聚苯乙烯、聚氯乙烯和 聚四氟乙烯中的至少一种聚合物。
26.如权利要求M所述的制造方法，其特征在于 所述金属是选自不锈钢、钛和铝中的至少一种。
27.如权利要求1所述的制造方法，其特征在于 所述(D)工序中的加热温度为50 130°C。
28.如权利要求1所述的制造方法，其特征在于 所述⑶工序中的加热时间为1 30分钟。
29.如权利要求1所述的制造方法，其特征在于 所述核酸是DNA和RNA中的至少一种。
30.如权利要求四所述的制造方法，其特征在于 所述DNA是基因组DNA和线粒体DNA中的至少一种。
31. 一种通过核酸扩增方法制造目的序列的核酸扩增产物的方法，其特征在于，包括下 述(a)和(b)工序(a)通过权利要求1所述的核酸试样制造方法，从含有细胞的细胞试样回收核酸试样 的工序；(b)以所述(a)工序中回收的所述核酸试样中的核酸为模板，通过核酸扩增方法制造 所述模板中的目的序列的核酸扩增产物的工序。
全文摘要
本发明提供一种不需要大量使用危险性高的离液盐等、不受特殊载体的限制、安全性优异、简便的核酸试样制造方法，以及使用该方法的核酸扩增产物的制造方法。对于含有细胞的细胞试样，使核酸复合体从上述细胞中释放，使该处理液与载体接触，由此使上述核酸复合体保持在上述载体上。然后，在分散介质的存在下，对上述载体实施加热处理，由此使基因组和线粒体等的DNA和RNA在上述分散介质中释放。由此，能够回收核酸试样。
文档编号C12Q1/68GK102105587SQ201080002199
公开日2011年6月22日 申请日期2010年1月15日 优先权日2009年1月16日
发明者小塚昌弘 申请人:爱科来株式会社