专利名称：糖制备方法、乙醇制备方法、乳酸制备方法以及在这些制备方法中所使用的酶解糖化用原 ...的制作方法
技术领域：
本发明涉及利用生物质原料的糖制备方法、乙醇制备方法和乳酸制备方法以及在所述糖制备方法、乙醇制备方法和乳酸制备方法中所使用的酶解糖化用原料的制备方法。
背景技术：
近年来，作为解决全球气候变暖问题的一种对策，广泛试行着从含有木质生物质、 草本生物质等的纤维素的原料制备乙醇，并作为各种燃料或化学原料所利用。从生物质原料制备乙醇时，例如，可以将收集的生物质原料在糖化工艺中分解成糖类，然后在发酵工艺中采用酵母等微生物来转换成乙醇，由此制备乙醇。另一方面，基于降低环境负荷的观点，生物降解聚合物的利用正在增加，并且乳酸作为其一种原料在使用。该乳酸同样可以通过使上述的生物质原料糖化并进一步使其发酵而获得。在上述的糖化工艺中，以往使用浓硫酸较多。但是从降低环境负荷的观点来看，需要降低硫酸的使用量。因此，近年来，人们将采用酶的生物质原料的糖化作为代替基于浓硫酸的糖化的方法，进行着广泛的研究。对于采用酶的糖化来说，虽然从对环境的影响的观点考虑，是优选的方案，但是为了进行酶解糖化，需要预先对生物质原料进行前处理以利于酶发挥作用。目前已知有多种对生物质原料进行前处理的方法，但是其中通常使用的处理包括基于稀硫酸、加压热水等的蒸煮处理等(例如，参照下述专利文献1 4。)。然而，如上所述的那样，硫酸的使用并不是优选的方案，并且在通过对生物质原料进行这些前处理而将所得到的处理物供给到酶解糖化中时，为了得到所期望程度的酶解糖化效率，需要分多个步骤进行该前处理，并且需要在200°C以上的高温下进行。并且，虽然了解到通过物理方法将生物质原料粉碎成微细的状态而提高化学、生物化学反应特性，但是如果仅通过粉碎方法而希望得到充分的酶解糖化效率，则粉碎工艺所需的能量非常之多，可能会导致失去经济合理性。人们还了解到通过用氨或有机胺对生物质原料进行前处理而提高其化学、生物化学反应特性(例如，参照下述专利文献5。)。但是，即使是经过所述前处理的生物质，也不能说其酶解糖化效率充分。因此，目前的现状是，仍然希望开发出可以进一步提高酶解糖化效率的酶解糖化技术以及适用于所述酶解糖化中的生物质原料的前处理技术。现有技术文献专利文献专利文献1 日本特许公开2006-075007号公报专利文献2 日本特许公开2004-121055号公报专利文献3 日本特许公表2002-541355号公报专利文献4 日本特许公开2002-159954号公报专利文献5 欧洲特许公开第 7 号公报
发明内容
技术问题本发明以解决上述的现有技术中的诸多问题、达到以下目的作为课题。即，本发明的目的在于提供能够有效地进行酶解糖化，由此能够提高糖的生产效率、乙醇的生产效率以及乳酸的生产效率的糖制备方法、乙醇制备方法和乳酸制备方法以及在所述糖制备方法、乙醇制备方法和乳酸制备方法中所使用的有效的酶解糖化用原料的制备方法。技术方案本发明的发明人为了解决上述问题而进行了专心研究，结果得到了以下见解。即， 通过将含有天然纤维素的纤维素I的生物质原料采用含有氨和/或有机胺的处理剂进行处理，得到改性生物质原料，并对该改性生物质原料进一步进行粉碎之后，供给到酶解糖化中，据此可以有效地进行酶解糖化，从而可以显著提高糖的生产效率、乙醇的生产效率以及乳酸的生产效率。在此，本发明的发明人之前对以下的内容申请过专利(参照日本特许公开 2008-161125号公报)。即，将相比于天然纤维素的纤维素I具有更低的结晶密度的纤维素 (例如，纤维素III1)作为酶解糖化的对象物使用，由此可以有效地进行酶解糖化；并且，对含有纤维素I的生物质原料，采用氨尤其是超临界相氨进行处理，由此可以有效地得到含有纤维素III1的酶解糖化用纤维素。但是，目前人们还不知道，通过将生物质原料在采用含有氨和/或有机胺的处理剂进行处理之后进一步进行粉碎而供给到酶解糖化中，由此可以显著提高生物质原料的酶解糖化效率。这是本发明的发明人的新的见解。本发明是基于发明人的上述见解而完成的，将用于解决所述课题的技术方案如下。即，<1> 一种糖制备方法，其特征在于，包括以下工艺(a)通过对含有纤维素I的生物质原料，采用含有氨和/或有机胺的处理剂进行处理，得到改性生物质原料；(b)通过对所述改性生物质原料进行粉碎，得到酶解糖化用原料；(c)通过对所述酶解糖化用原料进行酶解糖化，得到糖。<2>如上述<1>所述的糖制备方法，其特征在于，在工艺(a)中所使用的处理剂为氨。<3>如上述<1>或<2>所述的糖制备方法，其特征在于，含有纤维素I的生物质原料为木质生物质。<4>如上述<1>至<3>中任意一项所述的糖制备方法，其特征在于，在工艺(b)中得到的酶解糖化用原料的、采用中值粒径表示的平均粒径为5 80 μ m。<5> 一种乙醇制备方法，其特征在于，对通过如上述<1>至<4>中任意一项所述的糖制备方法得到的糖进行发酵，得到乙醇。<6> 一种乳酸制备方法，其特征在于，对通过如上述<1>至<4>中任意一项所述的糖制备方法得到的糖进行发酵，得到乳酸。<7> 一种酶解糖化用原料的制备方法，其特征在于，包括以下工艺
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(a)通过对含有纤维素I的生物质原料，采用含有氨和/或有机胺的处理剂进行处理，得到改性生物质原料；(b)通过对所述改性生物质原料进行粉碎，得到酶解糖化用原料。有益效果根据本发明，可以达到上述目的，解决诸多的现有问题，可以有效地进行酶解糖化，据此可以提供能够提高糖生产效率、乙醇生产效率以及乳酸生产效率的糖制备方法、乙醇制备方法和乳酸制备方法以及在所述糖制备方法、乙醇制备方法和乳酸制备方法中所使用的有用的酶解糖化用原料的制备方法。
图1为经过粗碎的桉树的X射线衍射图。图2为对经过粗碎的桉树进行粉碎的试样的X射线衍射图。图3为对经过粗碎的桉树进行氨处理的试样的X射线衍射图。图4为对经过粗碎的桉树进行粉碎且进一步进行氨处理的试样的X射线衍射图。图5为对经过粗碎的桉树进行氨处理且进一步进行粉碎处理的试样的X射线衍射图。图6为经过粗碎的沙柳的X射线衍射图。图7为对经过粗碎的沙柳进行粉碎的试样的X射线衍射图。图8为对经过粗碎的沙柳进行氨处理的试样的X射线衍射图。图9为对经过粗碎的沙柳进行粉碎且进一步进行氨处理的试样的X射线衍射图。图10为对经过粗碎的沙柳进行氨处理且进一步进行粉碎处理的试样的X射线衍射图。图11为经过粗碎的杉树的X射线衍射图。图12为对经过粗碎的杉树进行粉碎的试样的X射线衍射图。图13为对经过粗碎的杉树进行氨处理的试样的X射线衍射图。图14为对经过粗碎的杉树进行粉碎且进一步进行氨处理的试样的X射线衍射图。图15为对经过粗碎的杉树进行氨处理且进一步进行粉碎处理的试样的X射线衍射图。
具体实施例方式(糖制备方法)本发明的糖制备方法包括(a)通过用含有氨和/或有机胺的处理剂对包含有纤维素I的生物质原料进行处理而得到改性生物质原料的工艺；(b)通过粉碎所述改性生物质原料而得到酶解糖化用原料的工艺；(c)通过使所述酶解糖化用原料发生酶解糖化而得到糖的工艺。根据需要还包括其他工艺。< 工艺(a) >在所述工艺(a)中，通过用含有氨和/或有机胺的处理剂对包含有纤维素I的生物质原料进行处理，得到改性生物质原料。一包含有纤维素I的生物质原料一
作为所述包含有纤维素I的生物质原料，没有特别限制，可以根据目的适当选择。 例如，可以使用作为伴随农业或林业等生产活动的残渣而得到的“废弃物类生物质”、以得到能源等作为目的而通过专门栽培得到的“资源农作物类生物质”等。作为所述“废弃物类生物质”，例如，可以列举废弃建材、间伐木材、稻秸秆、麦秸秆、糠、蔗渣等。并且，作为所述“资源农作物类生物质”，例如，可以列举甘蔗、玉米等还作为食物栽培的糖质及淀粉类农作物；以纤维类的利用为目的而栽培的桉树(Eucalyptus)、白杨、金合欢属植物、柳树、 杉树(Cryptomeria japonica)、柳枝稷、狼尾草、蔗茅属植物、芒属植物、芒草(Miscanthus sinensis)等。并且，所述包含有纤维素I的生物质原料还可以分为将木材作为原料的“木质生物质”、将草本作为原料的“草本生物质”等。在本发明中，虽然均可以使用木质生物质以及草本生物质，但是从能够得到更为显著的本发明的效果的观点考虑，优选使用木质生物质。并且，作为所述包含有纤维素I的生物质原料，也可以是从如上所述的各种生物质通过提纯等得到的纤维素I其本身。对于所述包含有纤维素I的生物质原料而言，可以单独使用，也可以两种以上组合使用。另外，作为天然纤维素的纤维素I可分为纤维素Ia型和纤维素Ie型，但是包含在所述生物质原料中的纤维素I，可以是这些纤维素中的任意一种， 并且也可以是这两种。在采用所述含有氨和/或有机胺的处理剂进行的处理中，作为所述包含有纤维素 I的生物质原料，虽然可以直接使用所收集的原料，但是优选地通过切割、粉碎等工艺使其大小达到一定程度以下后使用。作为所述生物质原料的大小，没有特别限制，可以根据目的适当选择，但是，例如可通过的筛子的内径优选为5mm以下，进一步优选为3mm以下，更加优选为2mm以下。所述可通过的筛子的内径超过5mm时，会导致基于所述处理剂的处理不够充分。另一方面，所述大小在所述更加优选的范围内时，在可以缩短处理时间、可以减少所使用的处理剂的量等方面，是有利的。另外，以下，将对所述收集的生物质进行切割、粉碎的工艺称为“粗碎”。通过预先进行所述粗碎，可以有效地进行采用含有氨和/或有机胺的处理剂的处理，并且对改性生物质原料进行粉碎时，可以有效地得到更加微细的、酶解糖化效率良好的微细粉末状的酶解糖化用原料。作为用于所述粗碎中的粉碎机，没有特别限制，可以根据目的适当选择，例如，可以使用维利氏磨粉机(Wiley mill)、切碎机(Cutter mill)、锤磨机 (hammer mill)、销棒粉碎机(pin mill)等。一采用含有氨和/或有机胺的处理剂进行的处理一对所述包含有纤维素I的生物质原料，采用氨作为处理剂进行处理时，作为该方法没有特别限制，可以根据目的适当选择。例如，可以通过以下方法进行。即，将所述包含有纤维素I的生物质原料和氨加入到压力容器内，设定压力以及温度，以使所述压力容器的内部达到期望的压力以及温度，并以期望的时间进行处理。所述氨可以是液相，也可以是气相，并且还可以是超临界相。通过基于氨的处理，生物质原料中的一部分纤维素I转化成酶解糖化效率更高的纤维素III1型变体，从提高这种变体转化效率的观点考虑，液态氨或超临界相氨较为适合。但是，可以根据目标糖化率、能耗等，选择各自适合的条件下的处理。基于氨的处理条件并不是被限定的，通常，作为优选的条件，温度为-35 140°C，压力为 O 12. 5MPa。对所述包含有纤维素I的生物质，采用有机胺作为处理剂进行处理时，作为所使用的有机胺，没有特别限制，可以根据目的适当选择。例如，优选使用乙二胺 (ethylenediamine)、一甲胺(monomethyl amine)、一乙胺(monoethyl amine)等，其中优选乙二胺。当采用这些有机胺对所述包含有纤维素I的生物质进行处理时，没有特别限制，处理温度、压力可以采用与上述的基于氨的处理相同的条件。在本发明中，基于从纤维素I转化成纤维素III1型变体的效率、处理后的处理剂的去除容易性等观点考虑，作为处理剂，优选采用氨。作为所述采用含有氨和/或有机胺的处理剂进行的处理的时间，没有特别限制， 可以根据所使用的所述包含有纤维素I的生物质原料的量、上述的处理压力、处理温度等， 在发生所期望程度的从纤维素I向纤维素III1型变体的转化的范围内，可以适当选择，但是优选为10分钟 10小时，更加优选为30分钟 8小时，尤其优选为30分钟 5小时。 当所述处理时间小于10分钟时，会导致不能发生期望程度的纤维素I向纤维素III1型变体的转化，而当超过10小时时，由于不会再进行从纤维素I到纤维素III1型变体的转化， 因此会使整体没有效率。另一方面，当所述处理时间在所述更加优选的范围内时，从可以有效地进行从纤维素I到纤维素III1型变体的转化的方面考虑，是有利的。在采用所述含有氨和/或有机胺的处理剂进行处理时，对于所述氨和/或有机胺的使用量没有特别限制，可以根据目的适当选择，但是，例如相对于Ig的所述包含有纤维素I的生物质原料，优选为IOmg 300g，更加优选为IOOmg 150g，尤其优选为Ig 50g。 所述氨和/或有机胺的使用量相对于Ig的所述包含有纤维素I的生物质原料小于IOmg时， 会使处理不够充分；而超过300g时，处理效率会变得较差。另一方面，当该使用量在所述尤其优选的范围内时，从可以缩短处理时间、可以减少所使用的处理剂的量的方面，是有利的。另外，在采用所述含有氨和/或有机胺的处理剂进行处理时，只要至少所述处理剂包含有氨和/或有机胺，则可以进一步组合使用其他的化合物。作为所述其他化合物，例如，可以列举二氧化碳、氮、乙烯、甲烷、乙烷、丙烷、丁烷、戊烷、正己烷、甲苯、苯、苯酚、二氧六环、二甲苯、丙酮、氯仿、四氯化碳、乙醇、甲醇、丙醇、丁醇等。在此，作为所述其他化合物，不推荐使用水。如果使用所述水，则得到的纤维素III1有可能会回复到纤维素I。一改性生物质原料一通过所述采用含有氨和/或有机胺的处理剂进行的处理，可以得到改性生物质原料。通过所述处理，可以使包含在所述生物质原料中的至少一部分纤维素I转化成结晶密度更低的纤维素III1型变体。纤维素III1由于其结晶密度低，所以从利于酶发挥作用的方面考虑，是有利的。而且，通过所述处理，包含在所述生物质原料中的大部分半纤维素被分解成寡糖水平，变得可溶于水。据此，通过对所述生物质原料进行所述处理，可以将包含在所述生物质原料中的纤维素I和半纤维素分别转化成纤维素III1和来自半纤维素的寡糖的、利于酶发挥作用的状态，由此能够提高酶解糖化效率。在此，通过所述处理而使至少一部分纤维素I转化成纤维素III1型变体的情况，可以通过例如X射线衍射、傅立叶变换红外光谱(FT-IR)、固体核磁共振(NMR)等方法来确认。并且，在本申请中的“改性生物质原料”是指采用含有氨和/或有机胺的处理剂对包含有纤维素I的生物质原料进行处理后的物质，但是优选地，是指包含在生物质原料中的一部分纤维素I转化成纤维素III1型变体的物质。
并且，在所述改性生物质原料中，纤维素在其分子结构之间可以有其他化合物。例如，对于改性生物质原料来说，如前所述，可以通过采用含有氨和/或有机胺的处理剂对包含有天然纤维素的纤维素I的生物质原料进行处理而获得，但是也可以是在该处理工艺中所生成的、纤维素和氨和/或有机胺的复合体(以下，称为“纤维素和氨等复合体”。)的状态。但是，对于所述纤维素和氨等复合体而言，存在诸如以下问题。即，难以调解酶解糖化时的PH值，并且具有受到水的作用而回复到纤维素I的性质。因此在酶解糖化时，优选使用从所述纤维素和氨等复合体去除氨和/或有机胺的状态的改性生物质原料。因此，在经过基于所述氨和/或有机胺的处理之后，优选地设置从所述纤维素和氨等复合体去除氨和/或有机胺的去除工艺。作为所述氨和/或有机胺的去除方法，没有特别限制，可以根据目的适当选择，例如，可以举出，在经过基于所述氨和/或有机胺的处理之后，对得到的包含有所述纤维素和氨等复合体的改性生物质原料，采用甲醇、乙醇、丙酮等溶剂来洗净的方法、减压干燥的方法、在处理剂的沸点以上的温度下进行干燥的方法等。 作为所述处理剂采用氨时，作为其去除方法而优选的是，不使用有机溶剂，而基于安全性良好的方面考虑，在氨的沸点以上的温度(例如，常温 50°C )，常压或减压条件下，进行干燥的方法。另外，所述改性生物质原料优选包含纤维素III1，其比例没有限制，但是所包含的纤维素III1越多，越能得到良好的酶解糖化效率，因此从这方面考虑，纤维素III1的含量多是优选的。并且，所述改性生物质原料除了所述纤维素III1以外，还可以包含例如纤维素 1(纤维素Ia型、纤维素I0型)或诸如半纤维素、木质素等其他成分。但是，从提高酶解糖化的效率的观点考虑，优选地不包含木质素，或者其含量较少。< 工艺(b) >在所述工艺(b)中，对通过所述工艺(a)得到的改性生物质原料进行粉碎，由此得到酶解糖化用原料。—粉碎一在所述工艺(b)中，对通过所述工艺(a)得到的改性生物质原料，进行粉碎。作为对所述改性生物质原料进行粉碎的方法，没有特别限制，可以根据目的适当选择，例如，可以采用平磨机、行星式球磨机、震动球磨机、玻珠研磨机、气流粉碎机等粉碎机进行粉碎。其中，作为所述粉碎机，从可以以较低能耗得到微细的、酶解糖化效率良好的微细粉末状的酶解糖化用原料方面考虑，优选平磨机。通过所述粉碎，可以将所述改性生物质原料作为本发明的酶解糖化用原料。通过粉碎所述改性生物质原料，能够进一步提高酶解糖化效率。作为进行所述粉碎的条件，没有特别限定，可以根据粉碎机的种类、生物质原料的种类、希望得到的粉碎物的平均粒径等，适当选择。并且，当作为粉碎机使用平磨机时，由于粉碎的生物质原料从平磨机排出，因此进一步进行粉碎时，需要回收所排出的粉碎物，然后重新向磨中供应，而且还可以重复多次这种粉碎处理。此时，进行粉碎的次数，没有特别限制，可以根据所用的粉碎机的种类、一次粉碎所需的时间、消耗的能量等，适当选择，并且从重复两次以上时可以得到更加微细的、酶解糖化效率良好的微细粉末状的酶解糖化用原料的方面考虑，进行两次以上是有利的。对于所述粉碎来说，虽然从重复多次可以得到更加微细的、酶解糖化效率良好的微细粉末状的酶解糖化用原料的方面考虑，是有利的，但是重复
8次数过多，也不能得到一定程度以上的微细粉末化和酶解糖化效率的提高，因此会导致整体效率降低，所以优选四次以下。一酶解糖化用原料一本发明的方法所涉及的“酶解糖化用原料”是指，对所述改性生物质原料进行粉碎处理的物质。通过对所述改性生物质原料进行粉碎，能够进一步提高酶解糖化效率。作为通过所述粉碎得到的所述酶解糖化用原料的粒子的大小，没有特别限制，并且由于根据所使用的生物质原料的种类，优选的大小不同，因此不能一概限定，但是作为其平均粒径，优选5 80 μ m，更优选5 50 μ m，尤其优选5 30 μ m。使所述酶解糖化用原料的平均粒径小于5 μ m时，由于粉碎所需的能量以及时间非常多，因此会丧失经济合理性，另一方面，如果超过80 μ m，则不能充分提高酶解糖化效率。另一方面，所述酶解糖化用原料的平均粒径在所述尤其优选的范围内时，从粉碎所需的能量以及时间与酶解糖化效率之间的平衡方面考虑，是有利的。另外，作为本发明的所述酶解糖化用原料的平均粒径，采用通过射线衍射散射法测定而得到的中值粒径。在此，中值粒径是指，具有该粒径以上的粒径的粒子与具有该粒径以下的粒径的粒子的累计体积相同的粒径。对于通过所述改性生物质的粉碎而得到的酶解糖化用原料来说，例如，可以直接供给到后述的工艺(c)的酶解糖化，也可以经过适当的其他工艺之后，供给到后述的工艺 (c)的酶解糖化。作为所述其他工艺，没有特别限制，可以根据目的适当选择，例如，可以举出将通过所述粉碎得到的微细粉末状的酶解糖化用原料的PH值调节成适合后述的酶解糖化的PH值调节工艺等。< 工艺(c) >在所述工艺(C)中，对通过所述工艺(b)得到的酶解糖化用原料进行酶解糖化，由此得到糖。一酶解糖化一进行所述酶解糖化的方法，没有特别限制，例如，可以在以下示出的条件下进行。作为用于所述酶解糖化的酶，没有特别限制，可以根据目的适当选择，例如，可以举出纤维素酶、纤维二糖酶(β_葡萄糖苷酶)等。作为所述酶解糖化时的所述酶的使用量，没有特别限制，可以根据目的适当选择，但是例如，相对于Ig的所述酶解糖化用原料，优选0. 001 lOOmg，更为优选0.01 10mg，尤其优选0. 1 lmg。如果所述酶的使用量相对于Ig的所述酶解糖化用原料，小于 0. OOlmg,则会使酶解糖化不充分，如果超过lOOmg，则会阻碍糖化。另一方面，所述酶的使用量在所述尤其优选的范围内时，从相对于酶添加量而得到的糖的量多的方面考虑，是有利的。作为所述酶解糖化时的温度，没有特别限制，可以根据目的适当选择，但是例如， 优选10 70°C，更为优选20 60°C，尤其优选30 50°C。如果所述温度小于10°C，则会使酶解糖化不充分。如果所述温度高于70°C，可能使酶失去活性。另一方面，如果所述温度在所述尤其优选的范围内，则从相对于酶添加量而得到的糖的量多的方面考虑，是有利的。作为所述酶解糖化时的pH值，没有特别限制，可以根据目的适当选择，但是例如， 优选3. 0 8. 0，更为优选3. 5 7. 0，尤其优选4. 0 6. 0。如果所述pH值小于3. 0或者大于8. 0，则可能导致酶失去活性。另一方面，如果所述pH值在所述尤其优选的范围内，则从相对于酶添加量而得到的糖的量多的方面考虑，是有利的。一糖一通过所述酶解糖化，例如，可以得到含有葡萄糖的糖液，葡萄糖是来源于在所述工艺(b)中得到的酶解糖化用原料中所包含的纤维素III1的糖。并且，除此之外，通过所述酶解糖化而得到的糖液，例如，还可以包含有来源于所述纤维素I的葡萄糖，也可以包含有来源于半纤维素的糖。作为来源于半纤维素的糖，例如可以举出，诸如木糖、阿拉伯糖等五碳糖、诸如葡萄糖、半乳糖、甘露糖等六碳糖。对于所述糖液来说，例如，可以直接供给到后述的本发明的乙醇的制备方法和乳糖的制备方法，还可以经过如下其他工艺之后提供到后述的本发明的乙醇的制备方法和乳糖的制备方法。作为所述其他工艺，没有特别限制，可以根据目的适当选择，例如可以举出， 将所述糖液的PH值调节成适合后述的各发酵工艺的pH值调节工艺等。(乙醇制备方法)本发明的乙醇制备方法包括对通过上述的本发明的糖制备方法得到的糖进行发酵而得到乙醇的工艺(发酵工艺)，根据需要还包括其他工艺。<发酵工艺(乙醇发酵工艺)>在所述乙醇的制备方法中，作为对所述糖进行发酵的方法，没有特别限制，可以根据目的适当选择，但是例如，尤其优选在包含所述糖的溶液中加入酵母等醇发酵微生物，进行乙醇发酵的方法。作为所述酵母，没有特别限制，可以根据目的适当选择，例如， 可以举出酵母菌属(Saccharomyces)酵母等。并且，所述酵母可以是野生型酵母，也可以是通过基因重组得到的酵母。作为所述乙醇发酵微生物的具体例子，可以采用酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)、脆壁克鲁维酵(Kluyveromyces fragilis)、乳酸克鲁维酵母(K. Iactis)、马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)、毕赤酵母(Pichia stipitis)、巴斯德毕赤酵母(P. pastoris)、管囊酵母(Pachysolen tannophilus)、光滑假丝酵母(Candida Glabrata)等酵母或者这些酵母的基因重组酵母；运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)、 棕榈发酵细菌(Zymobacter palmae)、热纤梭菌(Clostridium thermocellum)、梭状杆菌 (C. Ijungdahlii)等细菌或者这些细菌的基因重组细菌。进行所述发酵时，对于所述酵母的使用量、发酵温度、pH值、发酵时间等，没有特别限制，例如可以根据供给到乙醇发酵中的糖的量、所使用的酵母的种类等，适当选择。<其他工艺>作为所述其他工艺，没有特别限制，可以根据目的适当选择，例如可以举出，对通过所述发酵工艺得到的乙醇进行分离提纯的工艺等。作为所述分离提纯的方法，没有特别限制，可以根据目的适当选择，例如可以举出蒸馏等。通过所述乙醇制备方法得到的乙醇，例如可以作为燃料用乙醇、工业用乙醇等适用。由于所述乙醇可以从生物质原料获得，因此只要可以生产成为所述生物质原料的植物， 就能够进行再生产。并且，由于所述植物在栽培过程中吸收大气中的二氧化碳，所以即使燃烧所述乙醇而产生二氧化碳，大气中的二氧化碳浓度也不会增加。因此，所述乙醇可以称作为用于防止全球气候变暖的优选能源。尤其，近几年可以期待这种乙醇与汽油混合而作为环保的汽车燃料使用。对通过本发明的糖制备方法得到的糖，代替产生所述乙醇的酵母等而分别使用用于生产目的醇类的微生物进行发酵，由此可以得到乙醇以外的醇类。例如，可以通过使用丙酮-丁醇菌进行发酵，制备出丁醇。(乳酸制备方法)本发明的乳酸制备方法包括对通过上述的本发明的糖制备方法得到的糖进行发酵而得到乳酸的工艺(发酵工艺)，根据需要还包括其他工艺。<发酵工艺(乳酸发酵工艺)>在所述乳酸制备方法中，作为发酵所述糖的方法，没有特别限制，可以根据目的适当选择，但是例如，尤其优选在包含所述糖的溶液中加入乳酸菌等乳酸发酵微生物， 进行乳酸发酵的方法。作为所述乳酸菌，没有特别限制，可以根据目的适当选择，例如 Lactobacillus manihotivorans、植物乳杆菌(Lactobacillus ρIantarum)、嗜热链球菌 (Streptococcus thermophilus)、保力口利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)等。在此， 所述乳酸菌可以是野生型乳酸菌，也可以是基因重组的乳酸菌。进行所述发酵时，对于所述乳酸菌的使用量、发酵温度、pH值、发酵时间等，没有特别限制，例如可以根据供给到乙醇发酵中的糖的量、所使用的乳酸菌的种类等，适当选择。〈其他工艺〉作为所述其他工艺，没有特别限制，可以根据目的适当选择，例如可以举出，对通过所述发酵工艺得到的乳酸进行分离提纯的工艺等。作为所述分离提纯的方法，没有特别限制，可以根据目的适当选择。由所述乳酸制备方法得到的乳酸，可以适用于基于化学聚合的聚乳糖制备中。目前，期待从包含不可供给到食物中的纤维素的生物质原料生产通常从玉米等的淀粉制备的乳酸，如果通过所述乳酸制备方法，则可以实现能够从包含这种纤维素的生物质原料有效制备聚乳酸。对通过本发明的糖制备方法得到的糖，代替所述乳酸菌等而分别使用用于生产目的有机酸的微生物进行发酵，由此可以得到乳酸以外的有机酸，例如，还可以制备柠檬酸、 琥珀酸、苹果酸、草酸等。(酶解糖化用原料的制备方法)本发明的酶解糖化用原料的制备方法包括(a)通过用含有氨和/或有机胺的处理剂对包含有纤维素I的生物质原料进行处理而得到改性生物质原料的工艺；(b)通过粉碎所述改性生物质原料而得到酶解糖化用原料的工艺。根据需要还包括其他工艺。作为所述酶解糖化用原料的制备方法中的所述(a)工艺以及所述(b)工艺，与上述的本发明的糖制备方法中的各项中所记载的相同。一般认为通过粉碎包含纤维素的生物质原料而提高化学以及生物学反应特性。并且，本发明的发明人还已公开了以下内容通过对包含有纤维素I的生物质原料，采用氨等进行处理，使纤维素I转化成纤维素III1型变体，提高酶解糖化效率。在本发明的糖制备方法中，通过比较以下三种情形，能够以特别优越的效率进行酶解糖化只对生物质原料进行采用含有氨和/或有机胺的处理剂的处理之后，进行酶解糖化；只对生物质原料进行粉碎处理之后，进行酶解糖化；进一步地，首先对生物质原料进行粉碎之后，采用含有氨和/或有机胺的处理剂进行处理，进行酶解糖化。虽然该作用机理还没有被确定，但是本发明的发明者们推定为如下。
S卩，在本发明所涉及的糖制备方法中，通过工艺(b)得到的本发明的酶解糖化用原料与通过工艺(a)得到的改性生物质原料相比已明确其X射线衍射图具有显著变化。即， 认为通过对改性生物质原料进行粉碎，纤维素的结构可能发生了某种变化。另一方面，利用与本发明的方法所涉及的工艺(b)相同的操作首先对生物质原料进行粉碎，然后采用含有氨和/或有机胺的处理剂进行处理，此时与不进行粉碎而采用含有氨和/或有机胺的处理剂进行处理时相比，没有发现X射线衍射图发生显著差异。由此，还认为当对改性生物质原料进行粉碎时发生的X射线衍射图的变化所反映出的结构变化，可能与本发明所涉及的酶解糖化用原料具有高酶解糖化效率有关。实施例以下，对本发明的实施例进行说明，但是本发明不受这些实施例的任何限定。(实施例1)一生物质原料一作为含有纤维素I的生物质原料，使用桉树。一粗粉碎处理一采用维利氏磨粉机将准备好的桉树以目标平均粒径为200 μ m进行粉碎。一氨处理一通过以下操作，将上述粉碎的桉树供给到采用超临界相氨的处理中。将在60°C的烘箱中干燥M小时后的粗碎桉树的试样4g，放入到容量为120ml的移动式反应器(水。一夕·； T >7夕一)TVS-N2型(TAIATSU公司制造，以下称为“容器，，。) 中，进行密闭，在冷却装置中将容器冷却至_13°C，同时在0. 5MPa下通入氨气30分钟。然后，将PC-V型加热器(TAIATSU公司制造)安装到容器中，在140°C下，进行1小时的加热、 加压处理。确认出此时容器内的压力达到使氨成为超临界相的IlMPa以上。经过处理之后， 通过使容器内的压力达到大气压，去除氨气，并使温度冷却至室温，回收容器内的固形物试样。将该试样在不密封的状态下放置过夜，使氨气体充分散发出去。一粉碎处理一使用陶瓷平磨机，即家用磨式茶叶粉末器“i ^ r i緑茶EU6820”(商品名，松下公司制造)，将刻度设定为“细小”的状态下，对经过上述氨处理的试样2g，以1次为10分钟反复进行3次粉碎。一X射线衍射分析一将经过上述粉碎的试样lOOmg，在200kg/cm2的压力下，加压成型，供给到X射线衍射分析中。χ射线衍射是采用筒型X射线发生装置RINT2200(商品名，Rigaku公司制造)， 并利用衍射法进行。利用通过电压38kV、电流50mA的单色仪而被单色化的CuK α线(波长为0.巧41811111)，在操作范围为2 0 =5 30°、步宽角度为0.1°、计数时间为20秒的条件下，采用阶梯扫描法进行测定。并且，也对于粗碎后的试样、氨处理后的试样，采用同样的操作，进行了 X射线衍射分析。将粗粉碎后的试样的衍射图、氨处理后的试样的衍射图、氨处理和粉碎处理后的试样的衍射图分别示出在图1、图3、图5中。一酶解糖化反应一对于通过上述操作经过氨处理以及粉碎处理的试样，通过以下操作，进行酶解糖化反应。
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在容量为1.5ml的微型管” 口千工一 f)中，放入通过精密称量而称取的IOmg试样，配制试样浓度为1 % (wt/vol)、作为酶的CelluClast@1.5L以及 Novozyme@188(均为商品名，Novozyme公司制备)的各浓度为0. 01% (wt/vol)(即酶总浓度为0.02% (wt/vol) )、pH值为4.5(醋酸缓冲液)的酶解糖化反应液。将该反应液在37°C 的恒温室内，利用旋转式摇床(15转/分钟)，翻转振荡M小时，进行酶解糖化反应。禾Ij用葡萄糖CII测试Wako ( 7 — ;^ CII〒^卜17 -—，商品名，和光纯药公司制造)，测定反应后通过离心分离而得到的上清液中的葡萄糖浓度，计算葡萄糖回收率，将结果示出在表1 中。在此，葡萄糖回收率根据下述数学式来定义。葡萄糖回收率(％ )=[酶解糖化反应液中的葡萄糖量/(酶解糖化原料的量X 总葡萄糖化率/100)] X 100总葡萄糖化率(％ )(使生物质原料通过其他化学反应而完全水解时得到的葡萄糖量/生物质原料的量)X100 (相当于生物质原料为基准的理论回收率)在此，所使用的桉树的总葡萄糖化率为43. 3%。(比较例1-1未处理过的试样的酶解糖化)对在实施例1中所使用的经过粗碎的桉树，不进行氨处理以及粉碎处理，直接通过与实施例1的酶解糖化反应操作相同的操作，进行酶解糖化反应。结果示出在表1中。(比较例1-2不经过氨处理，而进行粉碎处理的试样的酶解糖化)一粉碎处理一对在实施例1中所使用的经过粗碎的桉树，不进行氨处理，而通过与实施例1中对氨处理之后的试样进行粉碎的操作相同的操作，进行粉碎。一X射线衍射分析一通过与实施例1相同的操作，进行上述经过粉碎的试样的X射线衍射分析。将衍射图示出在图2中。一酶解糖化反应一对上述经过粉碎的试样，通过与实施例1的酶解糖化反应操作相同的操作，进行酶解糖化反应。与实施例1相同地计算出葡萄糖回收率，将结果示出在表1中。(比较例1-3经过氨处理的试样的酶解糖化)对在实施例1中得到的、对粗碎的桉树进行了氨处理而得到的试样，不进行后续的粉碎处理，而通过与实施例1的酶解糖化反应操作相同的操作进行酶解糖化反应。与实施例1相同地计算出葡萄糖回收率，将结果示出在表1中。(比较例1-4在经过粉碎处理之后，进行氨处理的试样的酶解糖化)一粉碎处理一对在实施例1中所使用的经过粗碎的桉树，通过与实施例1中对氨处理之后的试样进行粉碎的操作相同的操作，进行粉碎。对上述经过粉碎的试样，通过与实施例1中的氨处理操作相同的操作，进行氨处理。一X射线衍射分析一通过与实施例1相同的操作，进行上述在经过粉碎处理之后进行氨处理的试样的X射线衍射分析。将衍射图示出在图4中。一酶解糖化反应一对在经过粉碎处理之后进行氨处理的试样，通过与实施例1的酶解糖化反应操作相同的操作，进行酶解糖化反应。与实施例1相同地计算出葡萄糖回收率，将结果示出在表 1中。(实施例2)使用沙柳来代替实施例1中所使用的桉树之外，通过与实施例1相同的操作，依次进行粗碎、氨处理、粉碎、酶解糖化反应。将结果示出在表1中。并且，对各阶段的试样，通过与实施例1相同的操作，进行X射线衍射分析。各阶段的试样的X射线衍射图与实施例1 中相对应的各桉树试样大体相同。将粗粉碎后的试样的衍射图、氨处理后的试样的衍射图、 氨处理和粉碎处理后的试样的衍射图分别示出在图6、图8、图10中。在此，所使用的沙柳的总葡萄糖化率为45. 1%，粗碎的沙柳的平均粒径为 252 μ m0(比较例2-1 2-4)分别使用实施例中2所使用的粗碎的沙柳来代替比较例1-1 1-4中作为最初原料而使用的粗碎的桉树之外，分别与相应的比较例1-1 1-4的操作相同的操作，进行前处理，对得到的各个试样，分别通过与实施例2相同的操作，进行酶解糖化反应。针对各比较例，计算出葡萄糖回收率，将结果示出在表1中。并且，在比较例2-2 2-4中，对经过前处理后的各试样，进行X射线衍射分析。各试样的X射线衍射图分别与相应的比较例1-2 1-4中的各桉树试样大体相同。将粗粉碎后的试样的衍射图、在粉碎处理后进行氨处理的试样的衍射图分别示出在图7、图9中。(实施例3)使用杉树来代替实施例1中所使用的桉树之外，通过与实施例1相同的操作，依次进行粗碎、氨处理、粉碎、酶解糖化反应。将结果示出在表1中。并且，对各阶段的试样，通过与实施例1相同的操作，进行X射线衍射分析。各阶段的试样的X射线衍射图与实施例1 中相对应的各桉树试样大体相同。将粗粉碎后的试样的衍射图、氨处理后的试样的衍射图、 氨处理和粉碎处理后的试样的衍射图分别示出在图11、图13、图15中。在此，所使用的杉树的总葡萄糖化率为42.7%，粗碎后的杉树的平均粒径为 207 μ m0(比较例 3-1 3-4)分别使用实施例中3所使用的粗碎的杉树来代替比较例1-1 1-4中作为最初原料而使用的粗碎的桉树之外，分别与相应的比较例1-1 1-4的操作相同的操作，进行前处理，对得到的各个试样，分别通过与实施例3相同的操作，进行酶解糖化反应。针对各比较例，计算出葡萄糖回收率，将结果示出在表1中。并且，在比较例3-2 3-4中，对经过前处理后的各试样，进行X射线衍射分析。各试样的X射线衍射图分别与相应的比较例1-2 1-4中的各桉树试样大体相同。将粉碎处理后的试样的衍射图、在粉碎处理后进行氨处理的试样的衍射图分别示出在图12、图14中。[表1]
权利要求
1.一种糖制备方法，其特征在于，包括以下工艺(a)通过对含有纤维素I的生物质原料，采用含有氨和/或有机胺的处理剂进行处理， 得到改性生物质原料；(b)通过对所述改性生物质原料进行粉碎，得到酶解糖化用原料；(c)通过对所述酶解糖化用原料进行酶解糖化，得到糖。
2.如权利要求1所述的糖制备方法，其特征在于，在工艺(a)中所使用的处理剂为氨。
3.如权利要求1或2所述的糖制备方法，其特征在于，含有纤维素I的生物质原料为木质生物质。
4.如权利要求1至3中任意一项所述的糖制备方法，其特征在于，在工艺(b)中得到的酶解糖化用原料的、采用中值粒径表示的平均粒径为5 80 μ m。
5.一种乙醇制备方法，其特征在于，对通过如权利要求1至4中任意一项所述的糖制备方法得到的糖进行发酵，得到乙醇。
6.一种乳酸制备方法，其特征在于，对通过如权利要求1至4中任意一项所述的糖制备方法得到的糖进行发酵，得到乳酸。
7.一种酶解糖化用原料的制备方法，其特征在于，包括以下工艺(a)通过对含有纤维素I的生物质原料，采用含有氨和/或有机胺的处理剂进行处理， 得到改性生物质原料；(b)通过对所述改性生物质原料进行粉碎，得到酶解糖化用原料。
全文摘要
本发明提供可以有效进行酶解糖化并且能够提高糖的生产效率、乙醇的生产效率以及乳酸的生产效率的糖制备方法、乙醇制备方法和乳酸制备方法以及在所述糖制备方法、乙醇制备方法和乳酸制备方法中所使用的有用的酶解糖化用原料的制备方法。糖制备方法的特征在于，包括以下工艺(a)通过对含有纤维素I的生物质原料，采用含有氨和/或有机胺的处理剂进行处理，得到改性生物质原料；(b)通过对所述改性生物质原料进行粉碎，得到酶解糖化用原料；(c)通过对所述酶解糖化用原料进行酶解糖化，得到糖。
文档编号C12P7/56GK102333882SQ20108000962
公开日2012年1月25日 申请日期2010年2月25日 优先权日2009年2月27日
发明者上村毅, 五十岚圭日子, 和田昌久, 鲛岛正浩 申请人:Jx吉坤日矿日石能源株式会社, 国立大学法人东京大学