微阵列中的探针定位方法

专利名称：微阵列中的探针定位方法
技术领域：
本发明涉及使用微阵列检测探针多核苷酸与靶多核苷酸的杂交的方法。
背景技术：
人们正在进行不仅弄清各种生物的基因结构、还要以基因组规模阐明其基因功能的尝试，用于有效率地分析基因功能的技术开发也正在迅速推进。微阵列是在玻璃片等载体上使多数的多核苷酸排列固定在每个规定的区域的高密度的阵列，对确定基因的核苷酸序列、以及同时分析基因的表达、突变、多态性等非常有用。使用该微阵列的基因信息的分析对开发新药的研究、疾病的诊断或预防方法的开发等极为有用。在使用微阵列的检测中，首先使以放射性同位素或荧光色素标记的靶多核苷酸与高密度地排列在载体表面的探针多核苷酸杂交。此时，具有与探针多核苷酸互补的核苷酸序列的靶多核苷酸与探针多核苷酸进行互补性杂交，而未杂交的多核苷酸通过清洗而除去。在使用微阵列的杂交的检测中，有时会因每个微阵列的性能劣化或清洗不良等而发生误判。但是，判断是否存在该误判则委托给使用微阵列的使用者，这是非常含糊的。在这样的状况下，不可能利用组合有检测器和反应装置的自动装置处理多数的试样。专利文献1中记载着下述方法当点的亮度为检测器的检测下限以下或为检测上限以上时丢掉了产生的判定误差，所以使用改变探针DNA的浓度而点上的微阵列，只根据具有特定范围的亮度的点的结果进行判定。但是，在该方法中无法判定每个微阵列的性能劣化或清洗不良等。专利文献2中记载着下述方法使标记物质与探针阵列共价结合，根据该标记物质的位置迅速且正确地特定各探针的点的位置。但是，在该方法中，即使可以判定每个探针阵列的性能劣化或清洗不良等，但也无法判定杂交中是否存在不良情形等。现有技术文献专利文献专利文献1 日本专利第0880361号专利文献2 日本专利第4261661号

发明内容
本发明的课题在于提供除了判定每个微阵列的性能劣化或清洗不良等、还客观判定杂交不良的方法。本发明人等发现使用除了具有固定有探针多核苷酸的检测用点、还具有固定有基准多核苷酸的基准点的微阵列，使靶多核苷酸和与基准多核苷酸杂交的荧光标记的标记多核苷酸同时与上述微阵列接触以进行杂交反应，首先测定基准点的荧光，由此可以判定每个微阵列的可靠性以及杂交反应的可靠性，从而完成了本发明。SP，本发明包含以下发明。
(1)使用微阵列检测探针多核苷酸与靶多核苷酸的杂交的方法，该方法包括以下步骤1)使荧光标记的靶多核苷酸和与基准多核苷酸杂交的荧光标记的标记多核苷酸与微阵列接触的步骤，所述微阵列除了具有多个固定有探针多核苷酸的检测用点以外，还具有一处以上的固定有基准多核苷酸的基准点；2)通过清洗微阵列除去未反应的靶多核苷酸的步骤；3)测定基准点的荧光，当满足规定的值时，判断为可以测定的步骤；以及4)若判断为可以测定，则测定固定有探针多核苷酸的各检测用点的荧光的步骤。(2) (1)所述的方法，其中，标记多核苷酸的荧光标记与靶多核苷酸的荧光标记相同。(3)⑴或⑵所述的方法，其中，在微阵列中，检测用点和基准点被排列配置，存在至少两处基准点，以连接任意两处基准点的线为基准线，根据距基准点的距离和偏离基准线的角度测定检测用点的位置。(4) (3)所述的方法，其中，检测用点和基准点被配置成外周为四角形的格子状，基准点存在于四角形的不同的顶点处。(5)⑴或⑵所述的方法，其中，在微阵列中，检测用点和基准点被排列配置成外周为正方形或长方形的格子状，基准点存在于其对角线上的两个顶点处，检测通过各基准点上的两条直线垂直相交的交点，检测连接上述交点和各基准点的两条连线的长度，根据上述连线的长度和点数检测连线上的各检测用点位置。(6) (1) (5)中任一项所述的方法，其中，标记多核苷酸和与基准多核苷酸互补的多核苷酸具有95%以上的同源性。(7)试剂盒，用于检测探针多核苷酸与靶多核苷酸的杂交，该试剂盒包含微阵列，该微阵列除了具有多个固定有探针多核苷酸的检测用点以外，还具有一处以上的固定有基准多核苷酸的基准点；以及与基准多核苷酸杂交的荧光标记的标记多核苷酸。本说明书包含作为本申请的优先权基础的日本国专利申请2009-143390号的说明书和/或附图中记载的内容。


图1显示微阵列中的探针DNA和基准DNA的点的配置的一种形态。图2显示用于微阵列的荧光检测的检测器的一种形态。图3显示在微阵列中实施杂交反应后测定荧光而得到的图像。图4是以红圈显示由2个基准点的坐标算出各检测用点的座标并配置的点的图。图5显示未添加PCR产物而仅使荧光标记寡DNA杂交时(检体不良的情形)的荧光图像。图6显示未添加模板DNA而进行PCR扩增，将2 μ L该反应液与1 μ L添加有荧光标记寡DNA的杂交缓冲液混合进行杂交时(检体不良的情形)的荧光图像。图7显示使用超纯水代替杂交缓冲液进行杂交时(杂交不良的情形)的荧光图像。图8显示距作为本底(background)值的计算例测定亮度的点中心的一定范围的位置。
具体实施例方式本发明涉及使用微阵列检测探针多核苷酸与靶多核苷酸的杂交的方法。在本发明中，多核苷酸中包含寡核苷酸，还包含含有DNA和RNA的核酸。DNA包含单链DNA和双链DNA。另外，核酸中还包含修饰了磷酸二酯位点的人工核酸；修饰了呋喃糖位点的糖基键或羟基的人工核酸；修饰了核酸碱基位点的人工核酸；以及利用了糖·磷酸骨架以外的结构的人工核酸等；更具体而言，核酸中包含用硫原子取代磷酸位点的氧原子的硫代磷酸酯型、二硫代磷酸酯型、二氨基磷酸酯型、甲基膦酸酯型或硫代甲基膦酸酯型的人工核酸；呋喃糖环上的取代基修饰型、糖环骨架增加1个碳的吡喃糖型、或多环式糖骨架型的人工核酸；嘧啶C-5位修饰碱基型、嘌呤C-7位修饰碱基型、或环扩张修饰碱基型的人工核酸等。在本发明中，探针多核苷酸具有该技术领域中通常使用的意义，是用于检测目标基因的多核苷酸，是指与目的基因所对应的多核苷酸或其片段特异性杂交的多核苷酸。作为探针多核苷酸，通常使用合成寡核苷酸、cDNA和基因组DNA、它们的片段、以及将它们改性而得到的多核苷酸(例如将单链改性成双链的多核苷酸)等。探针多核苷酸通常具有3 5000个碱基、优选10 1000个碱基。固定在微阵列上的探针多核苷酸的定位 (spotting)溶液的浓度通常为ΙμΜ 10 μ M的范围。在本发明中，靶多核苷酸具有该技术领域中通常使用的意义，是指作为检测对象的多核苷酸。有时还将靶称作目标。靶多核苷酸通常使用来自被检试样的多核苷酸以及以其为基础进行酶合成/扩增而得到的多核苷酸，具体而言，使用mRNA、cDNA、aRNA、它们的片段、以及将它们改性而得到的多核苷酸等。使杂交(hybridize)、杂交反应或杂交(hybrization)具有该技术领域中通常使用的意义，是指具有互补序列的多核苷酸同伴、例如单链DNA同伴、单链RNA同伴、或单链 DNA与单链RNA在适当的条件下形成双链。本发明中，杂交优选在严格的条件下实施。本发明中，使用荧光标记的靶多核苷酸。标记方法或标记的种类只要可以检测探针多核苷酸与靶多核苷酸的杂交即可，没有特别限定，在该技术领域中是公知的。例如，在合成或扩增靶多核苷酸时摄入使荧光标记共价结合的基质(主要是UTP)，从而可以得到荧光标记的靶多核苷酸。作为荧光标记，可以列举Cy3和Cy5等的CyDye、FITC、RITC、罗丹明、 德州红(Texas Red)、TET、TAMRA、FAM、HEX、ROX 等。本发明中，作为微阵列，使用除了具有多个固定有探针多核苷酸的检测用点以外、 还具有一处以上、优选至少2处、更优选2 4处、进一步优选2处的固定有基准多核苷酸的基准点的微阵列。基准多核苷酸通常具有3 5000个碱基、优选10 1000碱基。固定在基准点上的基准多核苷酸的定位溶液的浓度通常为IyM 10 μΜ的范围。本发明中，通过使荧光标记的靶多核苷酸和与基准多核苷酸杂交的荧光标记的标记多核苷酸与上述微阵列接触来实施杂交反应，再通过清洗除去未反应的靶多核苷酸，之后首先测定基准点的荧光。与基准多核苷酸杂交的荧光标记的标记多核苷酸通常是指在严格条件下与基准多核苷酸杂交的荧光标记的标记多核苷酸。严格条件是指形成特异性杂化物、而不形成非特异性杂化物的条件，可以列举严格性差的条件和严格性强的条件，但优选严格性强的条件。严格性差的条件是指在杂交后的清洗中例如在42°C、用5XSSC、0. 1% SDS进行清洗的条件，优选为在50°C、用5XSSC、 0. SDS进行清洗的条件。严格性强的条件是指在杂交后的清洗中例如在65°C、用 0. IX SSC和0. 1% SDS进行清洗的条件。在上述的严格条件下，由和与基准多核苷酸互补的多核苷酸具有高同源性(同源性为80%以上、优选90%以上、更优选95%以上、进一步优选98%以上)的核苷酸序列构成的多核苷酸可以与基准多核苷酸杂交。如上所述，标记多核苷酸设计成与基准多核苷酸杂交、并且具有荧光标记，所以即使靶多核苷酸不与探针杂交，在基准点中也应该检测到荧光。未检测到荧光或荧光值低是指基准多核苷酸从微阵列中丢失、即其他探针多核苷酸也同样丢失。或者是指杂交反应中存在不良情形。因此，通过测定基准点的荧光，并判定是否满足规定的值，可以判断微阵列是否劣化，换言之，可以判断微阵列的可靠性。并且，可以判定杂交反应的可靠性。对标记多核苷酸的荧光标记没有特别限定，优选使用与靶多核苷酸的荧光标记相同的荧光标记。通过使用相同的荧光标记，可以使用相同的检测器一次性测定两者的荧光标记，可以迅速且简便地实施测定。在本发明中使用的微阵列中，优选探针多核苷酸的点(检测用点)和基准点排列， 并优选配置成格子状。而且，优选至少存在两处基准点，以连接任意两处的基准点的线为基准线，根据距基准点的距离和偏离基准线的角度测定各检测用点的位置(点的中心)。更具体而言，由距基准点的距离和偏离基准线的角度(连接各检测用点和基准点的线与基准线所成的角度)、以及所期望的点间距等可以确定各点的中心位置。另外，将检测用点和基准点排列配置成外周为正方形或长方形的格子状，可以使基准点存在于其对角线上的相对的两处顶点处。此时，检测通过各基准点上的两条直线垂直相交的交点，并检测连接该交点和各自的两处基准点的两条连线。然后，算出连线的长度，通过用该距离除以预先确定的(四角形的外周上的点数-1)的数目，求出连线上的各点间隔，由该点间隔可以测定各点位置。例如，使用点为4行X4列的微阵列。此时连线上的点数为4点。若连线的长度为900 μ m，则900+(4-1) = 300，点间隔为300 μ m。可以使用此点间隔，从基准点起在连线上移动300 μ m时作为点的中心，并且从该中心起在连线上移动300 μ m时为下一个点的中心。构成基准线的两处基准点优选在微阵列上排列的点组中以远的位置存在。检测用点和基准点优选配置成外周为四角形的格子状(例如图1)、且基准点存在于四角形的不同的顶点。作为用于测定检测用点和基准点的荧光的检测器，例如使用荧光激光显微镜、连接冷却CCD照相机和计算机的荧光扫描装置，可以自动测定微阵列上的荧光强度。可以使用共焦点型或非焦点型的激光代替CCD照相机。由此，得到图像数据。根据所得的数据，可以鉴定与固定在微阵列上的探针多核苷酸具有互补性的靶多核苷酸，可以基于此制作基因表达分布图、或者确定多核苷酸的核苷酸序列。本发明中使用的微阵列是在载体上固定有探针多核苷酸和基准多核苷酸的微阵列。载体材料可以使用该技术领域公知的材料，没有特别限定。可以列举例如钼、钼黑、 金、钯、铑、银、汞、钨、以及它们的化合物等贵金属；石墨、碳纤维所代表的碳等导电体材料； 单晶硅、非晶硅、碳化硅、氧化硅、氮化硅等所代表的硅材料；SOI (绝缘衬底上的硅)等所代表的上述硅材料的复合材料；玻璃、石英玻璃、氧化铝、蓝宝石、陶瓷、镁橄榄石、感光性玻璃等无机材料；聚乙烯、乙烯、聚丙烯、环状聚烯烃、聚异丁烯、聚对苯二甲酸乙二酯、不饱和聚酯、含氟树脂、聚氯乙烯、聚偏二氯乙烯、聚乙酸乙烯酯、聚乙烯醇、聚乙烯缩醛、丙烯酸树月旨、聚丙烯腈、聚苯乙烯、缩醛树脂、聚碳酸酯、聚酰胺、酚醛树脂、脲醛树脂、环氧树脂、三聚氰胺树脂、苯乙烯/丙烯腈共聚物、丙烯腈/ 丁二烯苯乙烯共聚物、聚苯醚和聚砜等的有机材料等。对载体的形状也没有特别限定，但优选为平板状。作为载体，优选使用表面具有碳层和化学修饰基团的载体。表面具有碳层和化学修饰基团的载体包括在基板表面具有碳层和化学修饰基团的载体、以及在由碳层形成的基板的表面具有化学修饰基团的载体。基板的材料可以使用该技术领域公知的材料，没有特别限定，可以使用与作为上述载体材料而列举的材料相同的材料。优选使用具有微细的平板状结构的载体。形状不限于长方形、正方形和圆形等，通常使用1 75mm的四方形载体，优选1 IOmm的四方形载体，更优选使用3 5mm的四方形载体。由于微细的平板状结构的载体容易制造，所以优选使用由硅材料或树脂材料形成的基板，特别是更优选在由单晶硅形成的基板的表面具有碳层和化学修饰基团的载体。单晶硅还包括晶轴的方向一部分一部分地(部分部分T )极微小地发生变化的单晶硅(有时也称作镶嵌晶体)、包含原子尺度的散乱(晶格缺陷)的单晶硅。对形成于基板上的碳层没有特别限定，但优选使用合成金刚石、高压合成金刚石、 天然金刚石、软金刚石(例如类金刚石碳)、无定形碳、碳系物质(例如石墨、富勒烯、碳纳米管)中的任一种、它们的混合物、或将它们层合而得到的碳层。还可以使用碳化铪、碳化铌、碳化硅、碳化钽、碳化钍、碳化钛、碳化铀、碳化钨、碳化锆、碳化钼、碳化铬、碳化钒等碳化物。这里，软金刚石是所谓的类金刚石碳(DLC=Diamond Like Carbon)等金刚石与碳的混合体、即不完全金刚石结构体的总称，对其混合比例没有特别限定。碳层的形成可以按照公知的方法进行。例如，微波等离子体CVD(化学气相沉积) 法、ECRCVD (电子回旋共振_化学气相沉积)法、ICP (电感耦合等离子体)法、直流溅镀法、 ECR(电子回旋共振)溅镀法、离子化蒸镀法、电弧式蒸镀法、激光蒸镀法、EB (电子束)蒸镀法、电阻加热蒸镀法等。在基板表面形成碳层时，碳层的厚度通常为单分子层 100 μ m左右，若太薄，则底层基板的表面有可能局部暴露；反之，若变厚，则生产率变差，所以优选2nm Ιμπι，更优选为5nm 500nmo通过向形成有碳层的基板的表面导入化学修饰基团，可以将寡核苷酸探针牢固地固定在载体上。对导入的化学修饰基团没有特别限定，本领域技术人员可以适当选择，例如
有氨基、羧基、环氧基、甲酰基、羟基和活性酯基。关于氨基的导入，例如可以通过在氨气中对碳层进行紫外线照射或进行等离子体处理来实施。或者，通过在氯气中对碳层照射紫外线以将其氯化，再进一步在氨气中进行紫外线照射来实施。或者，还可以通过使甲二胺、乙二胺等多元胺类气体与氯化的碳层反应来实施。关于羧基的导入，例如，如上所述通过使适当的化合物与氨基化的碳层反应即可实施。作为用于导入羧基的化合物，可以列举如式X-Ri-COOiK式中，X表示卤原子，R1 表示碳原子数为10 12的二价烃基)所示的卤代羧酸、例如氯乙酸、氟乙酸、溴乙酸、碘乙酸、2-氯丙酸、3-氯丙酸、3-氯丙烯酸、4-氯苯甲酸；式H00C-R2-C00H(式中，R2表示单键或碳原子数为1 12的二价烃基)所示的二元羧酸、例如草酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、邻苯二甲酸；聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、偏苯三酸、丁烷四甲酸等多元羧酸；式 R3-CO-R4-COOH(式中，R3表示氢原子或碳原子数为1 12的二价烃基，R4表示碳原子数为 1 12的二价烃基)所示的酮酸或醛酸；式X-0C-R5-C00H(式中，X表示卤原子，R5表示单键或碳原子数为1 12的二价烃基。)所示的二元羧酸的单卤化物、例如琥珀酸单氯化物、 丙二酸单氯化物；富马酸酐、琥珀酸酐、草酸酐、马来酸酐、丁烷四甲酸酐等酸酐。关于环氧基的导入，例如，如上所述通过使适当的多价环氧化合物与氨基化的碳层反应即可实施。或者，通过使有机过酸与碳层所含有的碳=碳双键反应即可得到。作为有机过酸，可以列举过乙酸、过苯甲酸、二过氧邻苯二甲酸、过甲酸、三氟过乙酸等。关于甲酰基的导入，例如，如上所述通过使戊二醛与氨基化的碳层反应即可实施。关于羟基的导入，例如，如上所述通过使水与氯化的碳层反应即可实施。活性酯基是指在酯基的醇侧具有酸性度高的亲电子性基团(電子求引性基)以激活亲核反应的酯群、即反应活性高的酯基。是指在酯基的醇侧具有亲电子性基团，较烷基酯更活化的酯基。活性酯基对氨基、硫醇基、羟基等基团具有反应性。进一步具体而言，苯酚酯类、苯硫酚酯类、N-羟胺酯类、氰基甲基酯、杂环羟基化合物的酯类等作为具有远高于烷基酯等的活性的活性酯基而已知。更具体而言，作为活性酯基，可以列举如对硝基苯基、 N-羟基琥珀酰亚氨基、琥珀酰亚氨基、邻苯二甲酰亚氨基、5-降冰片烯-2，3-二羧基亚氨基等，特别优选使用N-羟基琥珀酰亚氨基。关于活性酯基的导入，例如，如上所述使用氰胺或碳化二亚胺(例如1-[3_( 二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳化二亚胺)等脱水缩合剂和N-羟基琥珀酰亚胺等化合物将导入的羧基转换成活性酯即可实施。通过该处理，可以形成经由酰胺键在烃基的末端结合有 N-羟基琥珀酰亚氨基等活性酯基的基团(日本特开2001-139532)。将探针多核苷酸和基准多核苷酸分别溶解于定位用缓冲液中，制备定位用溶液， 之后将其分别注入96孔或384孔塑料板上，利用测位仪装置等在载体上定位分别注入的溶液，从而可以制造微阵列。或者，可以将定位溶液使用微量移液器以手动的方式进行定位。定位后，为了进行探针多核苷酸和基准多核苷酸与载体结合的反应，优选进行培育。通常在-20 100°C、优选0 90°C的温度下通常进行0. 5 16小时、优选1 2小时的培育。培育优选在高湿度的环境下、例如湿度为50 90%的条件下进行。优选在培育后接着用清洗液(例如50mM TBS/0. 05% Tween20,2XSSC/0. 2% SDS溶液、超纯水等)进行清洗，以除去未与载体结合的DNA。在本发明的一个实施方案中，优选在通过清洗微阵列除去未反应的靶多核苷酸的步骤之后、而在实际的测定即固定有探针多核苷酸的各检测用点的荧光测定之前进一步实施以下步骤。下述步骤可以在基准点的荧光测定之前实施，也可以在其后实施。对于多个点，分别测定距点中心一定距离的位置的亮度，得到多个本底值的步骤； 算出代表所得的多个本底值的本底代表值的步骤；以及对于所有的点或测定了本底值的所有的点，分别算出本底值与本底代表值之差，当存在具有规定的值以上的差的点时，判断为无法测定的步骤。这里，点包括检测用点和基准点两者。作为得到本底值的多个点，在排列配置在微阵列中的点中，优选至少对形成外周的所有点测定本底值。另外，虽然不必对所有的点测定本底值，但可以对所有的点测定本底值。关于将测定本底值的多个点，例如在检测用点和基准点被配置成外周为四角形的格子状时，通常为至少四角形的2个顶点、优选为至少四角形的4个顶点、更优选最外周的所有点。更具体而言，当为16行X 16列的点时，是指最外周的60点；或者，当为16行X 16列的点时，是指所有的点即256点。分别测定距点中心一定范围的位置的亮度，将其作为本底值时，距中心一定的范围根据点的大小和点间隔等适当设定。例如，如图8所示，可以是距点中心一定距离以上、以点间隔长作为一个边而以点的中心位置为中心的四角形的范围内。例如，距点中心 70 μ m以上、而一个边为1000 μ m的四角形的范围内，优选距点中心70 μ m以上、而一个边为 380 μ m的四角形的范围内。另外，可以以对一定范围的位置的所有或一部分点测定亮度而得到的平均值作为本底值，也可以测定一定范围的位置的仅一个点的亮度，以其作为本底值。对点的中心的定位方法没有特别限定，例如可以检测各点中具有规定的荧光强度 (例如3000以上)的部分，作为该部分的中心。或者，可以根据以连接两处基准点的中心的线为基准线，由距基准点的距离和偏离基准线的角度、以及点间距等确定各点的中心位置。本底代表值只要是代表测定的多个本底值的值即可，没有特别限定，但优选为多个本底值的平均值或中间值。对于所有的点或测定了本底值的所有的点，分别算出本底值与本底代表值之差， 当存在具有规定值以上的差的点时，可以判定点周围的本底值中分散大，因此该微阵列清洗不良，缺乏可靠性，由此可以判断为无法测定。这里，规定值根据条件等而不同，例如，当图像的显示为16位(bit)谐调时，可以设定为1000以上。当图像的显示为例如8位谐调时，可以设定小于50的值。在本发明的另一实施方案中，优选在通过清洗微阵列除去未反应的靶多核苷酸的步骤之后、而在实际的测定即固定有探针多核苷酸的各检测用点的荧光测定之前进一步实施以下步骤。下述步骤可以在基准点的荧光测定之前实施，也可以在其后实施。对于多个点，分别测定距点中心一定距离的位置的亮度，得到多个本底值的步骤； 算出多个本底值的平均值或中间值作为本底代表值的步骤；以及当本底代表值为规定值以上时，判断为无法测定的步骤。这里，点包括检测用点和基准点两者。作为得到本底值的多个点，在排列配置在微阵列中的点中，优选至少对形成外周的所有点测定本底值。另外，虽然不必对所有的点测定本底值，但可以对所有的点测定本底值。关于将测定本底值的多个点，例如，当检测用点和基准点被配置成外周为四角形的格子状时，通常至少为四角形的2个顶点、优选至少为四角形的4个顶点、更优选为最外周的所有点。更具体而言，当为16行X 16列的点时，是指最外周的60点；或者，当为16行X 16列的点时，是指所有的点即256点。关于距点的中心一定距离、以及中心的确定方法如上所述。当作为多个本底值的平均值或中间值的本底代表值为规定值以上时，可以判定点周围的本底值整体都大，因此该微阵列清洗不良、缺乏可靠性，由此可以判断为无法测定。 这里，规定值根据条件等而不同，例如当为16位时，可以设定为1000以上。本发明还涉及用于检测上述的探针多核苷酸与靶多核苷酸的杂交的试剂盒。本发明的试剂盒包含微阵列，其除了具有多个固定有探针多核苷酸的检测用点以外，还具有一处以上的固定有基准多核苷酸的基准点；以及与基准多核苷酸杂交的荧光标记的标记多核苷酸。关于探针多核苷酸、靶多核苷酸、基准多核苷酸、微阵列、以及标记多核苷酸等如上所述。本发明的试剂盒可以进一步包含杂交缓冲液、清洗缓冲液、微量板、尼龙膜等。以下，利用实施例来更详细地说明本发明，但本发明的技术范围并不限于下述实施例。实施例1载体的制备采用离子化蒸镀法，在下述条件下在边长为3mm的硅基板上制备两层的DLC层的膜。表 1
第1层第2层
原料气体CH44.7547.5 (sscm)
H20.252.5 (sscm)
工作压力3.08.0 (Pa)
基板偏压直流电压500500 (V)
高频输出100- (W)
阳极电压5050 (V)
灯丝电压 7 (V)
电流2222 (A)在下述条件下，使用氨等离子体，向所得的表面具有DLC层的硅基板上导入氨基。表2
原料气体 NH330 (sscm)
工作压力8.0 (sscm)
基板偏压直流电压500 (Pa)
高频输出— (W)
阳极电压50 (V)
灯丝电压 (V)
电流22 (A)在含有140mM的琥珀酸酐和0. IM的硼酸钠的1_甲基_2_吡咯烷酮溶液中浸渍 30分钟，导入羧基。之后在含有0. IM的磷酸钾缓冲液、0. IM的1-[3-( 二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳化二亚胺、20mM的N-羟基琥珀酰亚胺的溶液中浸渍30分钟进行活化，得到在硅基板表面具有DLC层和作为化学修饰基团的N-羟基琥珀酰亚氨基的载体。实施例2微阵列的制作将基准DNA (基准多核苷酸)和探针DNA (探针多核苷酸)分别溶解于Sol. 6中，按照图1那样的配置在实施例1制作的载体上点点(spot)儿(日立卜制SPBI0)。 即，在基准点上点基准DNA、在检测用点上点探针DNA。图1中，以基准点形式显示的点以外的点为检测用点。需要说明的是，以不同的浓度点探针DNA。点间距为280μπι。基准DNA 和探针DNA的序列如下。基准DNA:5，-ACTG GCCGTCGTTTTACAACGT-3，(SEQ ID NO 1)
探针DNA :5，-TTGTCCGCGCCG G GCTTCGCTC-3，(SEQ ID NO 2)在80°C下实施1小时焙烤后，在2XSSC/0. 2% SDS中、室温下边搅拌边清洗15分钟，制作点有探针DNA和基准DNA的微阵列。实施例3与靶DNA的杂交(1)以λ噬菌体的基因组DNA为模板，使用下述引物组通过PCR扩增与上述探针 DNA杂交的区。引物 1 :5，-ACAG G GAATGCCCGTTCTGC-3，(SEQ ID NO 3)引物 2 :5，-AATAACCGACACG G GCAGAC-3，(SEQ ID NO 4)标记使用CyDye (Cy5)来进行。PCR溶液的组成如下。表3
引物 1 (IOyUM)1//L
引物 2 (IOpM)ImL
PCR缓冲液2厂L
dNTP ( dCTP 为 1/10 浓度)2 μ\,
Cy5-dCTP0.5 pL
模板DNA1 ML
Ex Taq0.1 /<L
H2O13 ^L
总计 20.6(2)向杂交缓冲液(3XSSC/0. 3% SDS)中添加以Cy5进行荧光标记的寡DNA(标记多核苷酸)。该寡DNA为基准DNA的互补链。寡DNA:5，-ACGTTGTAAAACGACG GCCAGT-3，(SEQ ID NO 5)(3)将IyL添加有该荧光标记寡DNA的杂交缓冲液与2 μ L(I)中得到的PCR产物混合，之后滴加到实施例2制作的微阵列中，在55°C下进行1小时的杂交。用2XSSC/0. 2% SDS、接着用2 X SSC清洗。(4)荧光测定使用图2所示的检测器来实施。利用激光对微阵列整面照射激发光。 使用荧光滤波器切割具有目标波长以外的波长的光。图3显示杂交后测定荧光的图像。图4是以红圈显示由2个基准点的坐标算出各检测用点的坐标并配置的图。点的平均荧光强度为59473。该结果显示即使使PCR产物和荧光标记寡DNA同时杂交，对双方也均无影响。(3)中未加入PCR产物而仅使荧光标记寡DNA杂交时的荧光图像见图5。只在基准点得到足够的荧光强度。另外，在其他点处也没有见到非特异性荧光。由此认为荧光标记寡DNA对检测结果没有影响。(1)中未添加模板DNA ( λ噬菌体的基因组DNA)而进行PCR扩增，之后将2 μ L该反应液与1 μ L添加有荧光标记寡DNA的杂交缓冲液混合进行杂交时的荧光图像见图6。只在基准点观察到荧光，在检测用点未观察到荧光。(2)中使用超纯水代替杂交缓冲液(3XSSC/0. 3% SDS)进行杂交时的荧光图像见图7。包括基准点在内在所有点均未观察到荧光。由此可知若在适当的条件下进行杂交， 则观察不到基准点的荧光，因此根据基准点是否存在荧光，可以判定杂交的不良。
比较图6和图7时，在检测用点均未观察到荧光，而图6只在基准点观察到荧光。 在实际的试验中，当在检测用点未观察到荧光时，通常难以判定是检体、PCR扩增的情况不佳还是杂交的情况不佳。但是，根据本发明的方法，当只在基准点观察到荧光时，至少可以判定微阵列的品质和杂交是良好的，可以推测检体或PCR中存在不佳情形的可能性。产业实用性根据本发明，可以判定每个微阵列的可靠性，可以使用具可靠性的微阵列实施测定。并且，可以判定杂交反应的可靠性。因此，可以控制误判。另外，通过与自动反应装置等组合，可以具高可靠性地自动实施微阵列的测定。本说明书中引用的所有出版物、专利和专利申请直接作为参考而纳入本说明书中。
权利要求
1.使用微阵列检测探针多核苷酸与靶多核苷酸的杂交的方法，该方法包括以下步骤1)使荧光标记的靶多核苷酸和与基准多核苷酸杂交的荧光标记的标记多核苷酸与微阵列接触的步骤，所述微阵列除了具有多个固定有探针多核苷酸的检测用点以外，还具有一处以上的固定有基准多核苷酸的基准点；2)通过清洗微阵列除去未反应的靶多核苷酸的步骤；3)测定基准点的荧光，当满足规定的值时，判断为可以测定的步骤；以及4)若判断为可以测定，则测定固定有探针多核苷酸的各检测用点的荧光的步骤。
2.权利要求1所述的方法，其中，标记多核苷酸的荧光标记与靶多核苷酸的荧光标记相同。
3.权利要求1所述的方法，其中，在微阵列中，检测用点和基准点被排列配置，存在至少两处基准点，以连接任意两处基准点的线为基准线，根据距基准点的距离和偏离基准线的角度测定检测用点的位置。
4.权利要求3所述的方法，其中，检测用点和基准点被配置成外周为四角形的格子状， 基准点存在于四角形的不同的顶点处。
5.权利要求1所述的方法，其中，在微阵列中，检测用点和基准点被排列配置成外周为正方形或长方形的格子状，基准点存在于其对角线上的两个顶点处，检测通过各基准点上的两条直线垂直相交的交点，检测连接上述交点和各基准点的两条连线的长度，根据上述连线的长度和点数测定连线上的各检测用点位置。
6.权利要求1所述的方法，其中，标记多核苷酸和与基准多核苷酸互补的多核苷酸具有95%以上的同源性。
7.试剂盒，用于检测探针多核苷酸与靶多核苷酸的杂交，该试剂盒包含微阵列，该微阵列除了具有多个固定有探针多核苷酸的检测用点以外，还具有一处以上的固定有基准多核苷酸的基准点；以及与基准多核苷酸杂交的荧光标记的标记多核苷酸。
全文摘要
本发明提供除了判定每个微阵列的性能劣化或清洗不良等、还客观判定杂交不良的方法。使用微阵列检测探针多核苷酸与靶多核苷酸的杂交的方法，该方法包括以下步骤1)使荧光标记的靶多核苷酸和与基准多核苷酸杂交的荧光标记的标记多核苷酸与微阵列接触的步骤，所述微阵列除了具有多个固定有探针多核苷酸的检测用点以外，还具有一处以上的固定有基准多核苷酸的基准点；2)通过清洗微阵列除去未反应的靶多核苷酸的步骤；3)测定基准点的荧光，当满足规定的值时，判断为可以测定的步骤；以及4)若判断为可以测定，则测定固定有探针多核苷酸的各检测用点的荧光的步骤。
文档编号C12Q1/68GK102459641SQ20108002762
公开日2012年5月16日 申请日期2010年6月10日 优先权日2009年6月16日
发明者丹花通文, 山野博文, 平山幸一 申请人:东洋钢钣株式会社