高效表达重组人神经生长因子的cho细胞株及其构建方法

专利名称：高效表达重组人神经生长因子的cho细胞株及其构建方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，特别是可以稳定高效分泌表达具有生物活性的重组人神经生长因子(rhNGF)的CHO细胞株、其构建方法与应用。
背景技术：
随着医学的进步，各种颅脑外伤，急性脑血管意外、脊髓损伤，新生儿缺血性、缺氧性脑病，小儿脑瘫和阿尔茨海默病的存活率不断提高，但神经功能的缺损和患者不良预后使医学界面临难题。目前中枢神经损伤及周围神经损伤成为威胁人类健康的主要疾病。因此，加大脑神经保护类药物的开发、修复受损的中枢神经及周围神经已成为推动这一类药物市场快速发展的强大推动力。其中，神经生长因子(Nerve Growth Factor，NGF)成为近年来石if究的热点(Hefti F, Weiner WJ. Ann. Neurol, Nerve growth factor and Alzheimer' s disease. 1986,20 (3) :275-281. Scott SA, Crutcher KA. Nerve growth factor and Alzheimer' s disease. Rev Neurosci. 1994 ；5 (3) :179-211.)。神经生长因子是最早被发现，目前研究最为透彻的神经营养因子之一，也是至今为止发现的唯一不仅对中枢及外周神经的正常神经细胞有营养因子作用，而且具有调节神经损伤修复机能的生物活性分子。从小鼠颂下腺分离的神经生长因子是分子质量为 140KD、沉降系数为7S的复合物，由α、β、Y 3种肽链按α 2 β 2 γ 2的比例构成。其中，β 亚单位是7S NGF的活性区，整个NGF的生物活性全依赖β亚单位，也称为2. 5S NGF。研究表明，β亚单位是由两个完全相同的肽链组成，每个肽链含118个氨基酸残基，是由通过非共价键结合而构成二聚体(Shooter EM. Early days of the nerve growth factor proteins. Annu Rev Neurosci. 2001 ;24 :601-6 .)。形成 β 亚单位的两条肽链，其的保守结构主要包括两对反向平行的β链，β链构成了 NGF长而扁平的形状，其中包括6个半胱氨酸残基，组成3对二硫键，这些二硫键对维持NGF的生物活性十分重要，一旦破坏则活性全部丧失(ffhittemore SR, Seiger A. The expression, localization and functional significance of beta-nerve growth factor in the central nervous system. Brain Res. 1987 ；434 (4) :439-464.)。近年来，2.5S NGF的基因结构也已阐明，位于第一对染色体的近端短壁上，人、鸡、 牛、豚鼠的NGF cDNA相继被克隆。以小鼠NGF的cDNA为探针，已从人的DNA文库中克隆出人类NGF基因。从核苷酸碱基排列可推导氨基酸序列，发现人类和小鼠的NGF氨基酸序列的同源性有90%，而且小鼠NGF与人体NGF的结构也具有高度的相似性，生物效应也无明显的种间特异性。国内自上个世纪80年代起即开始了鼠NGF纯化和应用的研究(柳川，李晋萍，华仲慰，等.小鼠颂下腺2. 5S神经生长因子的纯化和活性鉴定.军事医学科学院院刊， 1987，11 28 33 ；沈心亮；潘晓东；白明纲，等，神经生长因子在治疗有机溶剂中毒性周围神经病中的新用途.中国专利CN99127304.4)，目前我国研制的注射用鼠神经生长因子在获得国家食品药品监督管理局(SFDA)颁发的一类生物制品新药证书。2003年武汉海特生物制药股份有限公司、厦门北大之路生物工程有限公司分别获得了 SFDA颁发的生产批文，分别以“金路捷”和“恩经复”上市。2006年SFDA又批准了舒泰神(北京)药业注射用神经生长因子生产，商品名为“苏肽生”，至此中国市场形成了三足鼎立的局面。然而，小鼠及其它来源的非人源NGF毕竟在一级结构和空间构象上不同于人的NGF分子，尽管其纯度可以达到98%以上，仍不能排除长期大量使用产生抗鼠NGF抗体和引起过敏反应的可能性。 人体产生抗鼠NGF抗体将导致其在体内半衰期缩短，影响到临床治疗效果和患者的用药安全。因此国内外许多研究机构都采用CHO细胞表达系统表达了重组人NGF，活性测定结果表明，与鼠源性NGF相比，重组人NGF具有良好的生物活性(姜静，于淑萍，姜桂香， 等.两步柱色谱法纯化CHO表达的重组人β神经生长因子(β-rhNGF).中国生物工程杂志.2008; (10) :84 89.；陈勇蒋琳杨军，等.人β-NGF真核表达载体的构建及其表达产物的生物活性.中国生物制品学杂志.2005 ；18(6) =457-460.)。但是，由于我国上游基因重组以及细胞株构建和筛选技术落后于欧美发达国家水平，国内构建的CHO工程细胞株不仅还在沿用添加牛血清的有血清培养基培养，而且贴壁CHO细胞也难以实现高密度培养，必须经过悬浮培养驯化才可以放大进行产业化生产。另一方面，重组蛋白的表达水平较美国低几倍甚至几十倍，远远达不到国外的20-30g/年的实验室规模的产量，更不用说实现低成本的大规模产业化了。例如，我国批准上市的国产CHO细胞表达产品仅有两种 EPO和乙肝疫苗。但尽管这两种产品的使用剂量只有微克级水平，其生产还处于非常原始和初级的状态，许多厂家甚至还是用转瓶培养生产(胡显文，陈惠鹏，汤仲明，等.生物制药的现状和未来(一)历史与现实市场.中国生物工程杂志.2004; (12) :95-101.；胡显文，陈惠鹏，汤仲明，等.生物制药的现状和未来(二)发展趋势与希望.中国生物工程杂志· 2005 ；25(1) :86-93.)。由于常规CHO细胞需要在有牛血清或类似成分存在的情况下贴壁生长，细胞培养基中的血清或蛋白质成分对重组蛋白在细胞中的表达以及后期的蛋白纯化过程有很大的影响。如果进行产业化，还需要首先进行无血清驯化，使细胞适应无血清培养基并在其中生长良好并持续分泌产生重组蛋白质以降低成本并方便下游纯化工艺的开发。细胞无血清驯化过程中往往造成基因工程细胞株不稳定，导致蛋白生产能力下降。当前哺乳动物细胞无血清、大规模、高密度、悬浮培养已经成为生物制药领域最重要的关键技术之一，并以其研究的深入和快速进展成为推动生物技术产业发展的强大动力。但是，已有的重组人NGF研究文献并未见相关报道，前人的文献中并没有提示我们通过何种方法才能得到一种既不用进行无血清驯化培养，又能很方便的进行亚克隆筛选获得高效表达重组人NGF细胞株的途径。

发明内容
本发明的目的是提供一种高效表达重组人神经生长因子的CHO DG44-NGF-118细胞株，该细胞株已在中国普通微生物菌种保藏管理中心(China General Microbiological Culture Collection Center, CGMCC)保藏，其保藏编号为CGMCC No. 4541 本发明的另一个目的是通过建立筛选获得具有稳定高效表达具有生物活性的重组人神经生长因子(rhNGF)的CHO DG44-NGF-118细胞株的方法，解决上述背景技术存在的不足，从而建立一种表达和生产具有复杂结构和生物活性的重组蛋白质的技术平台。所述的技术平台通过利用无血清悬浮培养技术和甲基纤维素半固体培养基亚克隆技术，可以省略已有技术的无血清驯化过程，不仅提高亚克隆成功率，而且还大大方便了重组蛋白质的下游纯化。其宿主细胞为经过无血清悬浮驯化的CHO DG44。所述CHO细胞株具有编码SEQ ID No2所示蛋白质的核苷酸序列。所述核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。上述的CHO细胞株的构建方法，包括以下步骤(1)人工合成如SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列，插入到pOptiVEC-polylinker的多克隆位点，得到重组质粒，(2)将质粒转入无血清悬浮驯化的CHO DG44的中，(3)逐步提高氨甲蝶呤浓度的方式加压筛选，得到混合克隆细胞，(4)采用甲基纤维素半固体培养基进行亚克隆挑选单克隆细胞株，采用ELISA法检测单克隆细胞株的表达量，筛选得到高效表达的重组人神经生长因子的CHO细胞株。其中核苷酸序列插入到pOptiVEC-polylinker的)(ba I和Not I酶切位点之间。所述重组质粒为p0ptiVEC/NGF-l 18，其制备方法包括如下步骤㈧人工合成如SEQID NO. 1所示的核苷酸序列，并连接到pcDNA3. 1载体上构建成功pcDNA3. 1/ NGF-118重组质粒，(B)分别用Xba I和Not I双酶切pcDNA3. 1/NGF-118重组质粒和 pOptiVEC-polylinker，然后回收酶切后的NGF基因片段和线性化的pOptiVEC载体进行连接，转化大肠杆菌感受态细胞，挑取单克隆扩大培养后提取质粒，用双酶切法和序列测定法鉴定阳性重组子，获得p0ptiVEC/NGF-118重组质粒。所述氨甲蝶呤浓度为400nM。所述步骤(3)加压筛选为在含氨甲喋呤浓度为IOnM选择培养基开始加压筛选，然后按照浓度分别为20nM，40nM, 60nM, 80nM, IOOnM, 200nM和400nM的梯度逐步提高选择培养基中氨甲喋呤的浓度。所述CHO细胞株在生产人神经生长因子蛋白质药物中的应用。为了实现本发明的上述目的，本申请提供了如下的实施方案1.通过UniProtKB数据库检索获得人神经生长因子(Nerve growth factor, NGF) NGF基因序列，对其进行优化设计，如SEQ ID NO. 1所示，将其插入到pOptiVEC-polylinker 的多克隆位点，形成p0ptiVEC/NGF-118重组质粒。2.将pOptiVEC/NGF重组质粒转入CHO DG44细胞中，逐渐提高MTX浓度进行加压筛选，逐步提高重组人神经生长因子表达水平。3.对加压筛选获得的表达重组人神经生长因子的混合克隆细胞，利用甲基纤维素半固体培养基进行亚克隆将获得高表达量的单克隆细胞。4.定量ELISA法测定单克隆化的稳定细胞株的生长曲线及rhNGF表达量变化趋势。5.用鸡胚背根神经节法(Dorsal root ganglion,DRG)定性检测重组人神经生长因子的生物活性。6.用大鼠PC12细胞体外诱导实验定性检测重组人神经生长因子的生物活性。本发明所建立的高效表达重组人神经生长因子的CHO细胞株，其中的5号单克隆细胞株培养上清中rhNGF的表达量最高，达到25. 5mg/L，命名为CHO DG44-NGF-118。本发明的CHO DG44-NGF-118细胞株，其宿主细胞是适应了无血清悬浮培养的已驯化CHO-DHFR 缺陷株宿主细胞CHO DG44，其与已有文献报道方法相比的优势在于现有文献中所使用的CHO-DHFR缺陷细胞株需要在有牛血清或类似成分存在的情况下贴壁生长，细胞培养基中的血清或蛋白质成分对重组蛋白在细胞中的表达以及后期的蛋白纯化过程有很大的影响。如果进行产业化，还需要首先进行无血清驯化，使细胞适应无血清培养基并在其中生长良好并持续分泌产生重组蛋白质以降低成本并方便下游纯化工艺的开发。细胞无血清驯化过程中往往造成基因工程细胞株不稳定，导致蛋白生产能力下降，而本发明使用已驯化好的适应无血清培养基的CHO-DHFR宿主细胞CHO DG44可以省略此步骤，有利于提高基因工程CHO细胞株的稳定性。此外，有血清培养中使用的动物血清或其它动物源性和/或人源性蛋白成分，不仅增加了生产成本，而且还增加了外源致病性微生物污染的机会，特别是克-雅氏病(即通常所说的疯牛病)病毒的污染。本发明中使用的无血清/无蛋白合成培养基不含任何动物源性和蛋白性成分，驯化后的CHO-DHFR宿主细胞CHO DG44已经在其中得到良好适应，且细胞生长和产物表达水平与有血清培养基相当，其技术特点在于能支持细胞在大规模生物反应器中实现高密度培养，并有利于泡沫控制。菌株分类CH0细胞株，其保藏编号为CGMCC No. 4541保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏日期2011年1月5日保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院，中国科学院微生物研究所


图1 :A09025-1质粒酶切鉴定图谱图2 :p0ptiVEC/NGF-118质粒酶切鉴定图谱M :DM1000DNA 分子量标准；1. Xba I 和 Not I 双酶切 pOptiVEC/NGF-118 质粒； 2. pOptiVEC/NGF-118 质粒图3 =ELISA检测所挑取的M个单克隆细胞培养上清图4 定量ELISA检测6孔板中扩增的3个单克隆细胞培养上清图5 =Western blotting法检测6孔板中扩增的3个单克隆细胞培养上清M 低分子量蛋白质分子量标准；1，2，3，4泳道分别为小鼠NGF对照品，5号，8号和20号单克隆细胞株培养上清。图6 =CHO DG44-NGF-118细胞株的生长曲线及重组NGF滴度变化趋势图7 鸡胚背根神经节法(DRG)定性检测重组人神经生长因子的生物活性A，B 鸡胚背根神经节(DRG)诱导0小时；鸡胚背根神经节(DRG)诱导48小时后。 其中，A，C为小鼠NGF(25ng/ml)诱导组；B, D为重组人NGF(25ng/ml)诱导组。图8 大鼠PC12细胞诱导分化实验检测重组人神经生长因子的生物活性。A，B, C :PC-12细胞诱导培养0小时；D, E，F :PC_12细胞诱导培养72小时；G, H，I PC-12细胞诱导培养144小时。其中，A，D，G为阴性对照组，B, E，H为小鼠NGF(1 μ g/ml) 诱导组；C, F，I为重组人NGF(1 μ g/ml)诱导组。
具体实施方法本发明更详细的实验方法可参见实施例。本实施例是用于解释，而不是以任何形式和方法限制本发明。本发明实施例中所使用的细胞株、菌株、质粒和试剂均为市售产品。实施例一 p0ptiVEC/NGF-118重组质粒的构建1.NGF基因的获得查询UniProtKB数据库中人NGF蛋白质(P01138)和基因的序列，对NGF基因进行优化设计，优化后的NGF基因核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示，委托金唯智生物技术有限公司进行全基因合成并连接到pcDNA3. 1载体(Invitrogen公司)上，构建成功pcDNA3. 1/ NGF-118重组质粒，编号为A09025-1，酶切鉴定图谱如图1所示。2. pOptiVEC/NGF-118 重组质粒的获得按照常规分子克隆技术操作，将pcDNA3. 1/NGF-118重组质粒和 pOptiVEC-polylinker 载体(Invitrogen 公司)分别用 Xba I 和 Not I (大连 Takara 公司)双酶切，然后使用胶回收试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司)回收酶切后的 NGF-118基因片段和线性化的pOptiVEC载体进行连接，链接产物转化大肠杆菌感受态细胞TranslO (北京全式金生物技术有限公司)，挑取单克隆扩大培养后利用质粒小提试剂盒 (北京康为世纪生物科技有限公司)提取质粒，通过)(ba I和Not I双酶切以及插入序列测定鉴定阳性重组子，获得pOptiVEC/NGF-118重组质粒，双酶切鉴定结果如图2所示。实施例二 获得表达重组人NGF的CHO DG44细胞株CHO DG44细胞是dhfr缺陷的中国仓鼠卵巢细胞系，购自公司。CHO DG44细胞转染前按说明书常规传代，以3X IO5细胞/ml密度接种于含有30ml⑶DG44 培养液的125ml无菌三角瓶中，使次日细胞密度能达到5X IO5活细胞/ml，转染步骤按 hvitrogen公司的FreeMyle MAX转染试剂说明书进行。将15 μ 1 FreeStyle MAX转染试剂和9μ gp0ptiVEC/NGF-118重组质粒DNA加入到1. 2ml OptiCHO SFM无血清培养基中， 轻柔混勻，室温孵育lOmin。将1. 2ml质粒-转染试剂混合液缓慢且均勻的滴入到细胞培养瓶中，置0)2培养箱振荡培养。转染Mh后，更换为含有氨甲喋呤浓度为IOnM的CD OptiCHO 培养基进行加压筛选，待细胞活力和密度恢复后，分别按照20nM，40ηΜ, 60ηΜ, 80ηΜ, IOOnM, 200ηΜ和400ηΜ的浓度梯度逐步提高选择培养基中氨甲喋呤的浓度进行加压扩增，扩大培养进行后续实验。当MTX浓度提高到400ηΜ时，按3Χ 105/ml的密度接种到125ml培养瓶中，培养3天后取混合细胞株的培养上清进行定量ELISA检测，结果表明重组人神经生长因子表达滴度为3160. 5ng/ml。为了获得高表达的单克隆细胞，按照实施例三所述的方法对混合克隆细胞进行了克隆化，以期获得高表达的单克隆细胞株。实施例三甲基纤维素半固体培养基亚克隆挑选单克隆细胞株采用CloneMatrix半固体培养基(购自Genetix公司)进行克隆化，按照产品使用说明书进行操作。简而言之，将混合克隆细胞按IX 107ml的密度接种到100ml含400nM 的MTX的CloneMatrix培养基中，在37°C、5% CO2的条件下进行培养。培养14天后，挑取独立分散、生长良好的单克隆细胞，转入96孔板培养，3天后取培养上清进行ELISA检测。 根据ELISA检测结果，选取OD值比较高的单克隆孔细胞，转入M孔板扩大培养，5天后进行 ELISA检测，结果如图3所示。根据ELISA结果，选取OD值比较高的6个单克隆孔5,8,16，20，22和M转入6孔板扩大培养，待细胞密度合适时冻存细胞。分别收取各单克隆孔的细胞培养上清，使用ELISA试剂盒(R&D公司，DY256)检测其rhNGF含量，按试剂盒说明书操作。由于在扩大培养过程中单克隆孔16，22和M未得到有效扩增，只有3个单克隆细胞5， 8和20得到扩增并进行了定量ELISA检测，结果如图4所示。5号单克隆细胞株培养上清中rhNGF的表达量最高，达到1618ng/ml，命名为CHO DG44-NGF-118。取3个单克隆细胞株的培养上清进行Tricine-SDS-PAGE电泳，分离胶浓度为10%，转膜后利用兔抗鼠NGF多克隆抗体(SIGMA公司，N6655)进行^festern blotting检测，结果如图5所示，在分子量13KD 左右有一条特异性条带，与预期分子量一致。
实施例四稳定细胞株的生长曲线及rhNGF滴度变化趋势
为检测CHO DG44-NGF-118细胞株的细胞密度和rhNGF滴度之间的关系，将 CH0DG44-NGF-118细胞株按1. 7X 105/ml的密度接种到不含MTX的OptiCHO Medium培养基中，在37°C、5% CO2和130rpm的条件下于500ml锥形瓶中进行振荡培养，每24h取样检测细胞密度及rhNGF的表达量。连续监测9天后，根据测定结果以培养天数为横坐标，细胞密度为左纵坐标，NGF表达滴度为右纵坐标绘制CHO DG44-NGF-118细胞株连续培养的细胞密度及rhNGF滴度变化趋势图，如图6所示。结果表明，细胞接种后如随着培养时间的延长细胞密度逐渐增加，在第6天达到最大值64 X 106/ml，而rhNGF的滴度则继续增加，至第9 天时rhNGF滴度达到最高值25. 5mg/L。这提示无血清悬浮培养有利于高密度培养，在细胞密度达到最高后因营养成分的消耗和代谢废物的累积导致细胞开始死亡，细胞密度下降但 rhNGF表达却还在继续增加。如果在生物反应器中采用流加培养并对溶氧、PH值、糖度和代谢产物进行调控，还可以获得更大细胞培养密度和更高的rhNGF表达水平。实施例五背根神经节法(DRG)定性检测重组人神经生长因子的生物活性为检测CHO DG44-NGF-118细胞株所表达的rhNGF生物活性，取含有rhNGF的培养上清经超滤浓缩后以定量ELISA法进行浓度标定，然后以市售注射用小鼠NGF (舒泰神药业有限公司)为标准参考品品，按照经典的鸡胚DRG诱导方法进行该实验，具体操作方法如下1.分离鸡胚背根神经节将毛玻璃放置超净台水平面上，取鸡胚，轻轻去除气腔面的部分鸡蛋壳，观察到遍布新鲜毛细血管的内膜，破开后取出鸡胚，断颈后将鸡四肢粘附在毛玻璃上，用小镊子解剖，去除内脏，小心暴露脊柱，将之放置体视显微镜底下，观察的同时，用微解剖镊子取出背根神经节，放至用多聚赖氨酸(Poly-L-Lysine，PLL)包被过的M 孔板中，每孔2 3个神经节，添加Iml的DMEM基础培养基，放置37°C、5% C02的培养箱中培养Ih。2. NGF诱导鸡胚背根神经节将培养神经节的DMEM培养基更换为DMEM含药培养基(不同浓度的NGF)，分为待测NGF样品和标准品两组，其中待测NGF样品和标准品用DMEM 培养基做2倍倍比稀释，每个样品做5 6个稀释度(应稀释至出现阴性结果)，培养4 后在倒置显微镜下观察神经节的状态。如图7所示，与小鼠NGF—样，我们所表达的rhNGF 具有良好的生物活性，可以诱导鸡胚背根神经节生长，倒置显微镜下可观察到致密而细长的大量神经纤维自背根神经节中呈放射状向四周生长。实施例六大鼠PC12细胞诱导法定性检测重组人神经生长因子的生物活性NGF可以诱导大鼠嗜铬神经细胞瘤PC12分化并产生大量放射状神经纤维轴突向四周辐射生长并相互联接。因此，我们以市售注射用小鼠NGF(舒泰神药业有限公司)为标准品，采用PC12细胞诱导法来检测rhNGF的生物活性，具体操作方法如下1.标准品溶液的制备取小鼠NGF标准品(30 μ g/瓶，生物学活性彡15000AU)按说明书复溶后，用基础培养液稀释至15μ g/ml。在5ml离心管中配置标准品溶液，预稀释浓度为2 μ g/ml，然后进行2倍系列稀释，共5个稀释度，将标准品溶液转移至M孔板(预先用多聚赖氨酸包被)，每个浓度对应1个孔，每孔500 μ 1。2.待检测样品溶液的制备将待检测样品用基础培养液稀释至2 μ g/ml，然后进行2倍系列稀释，共5个稀释度，将标准品溶液转移至M孔板(预先用PLL包被)，每个浓度对应1个孔，每孔500 μ 1，以上操作在无菌条件下进行。以上操作在无菌条件下进行。另选择2个孔加入阴性对照溶液500 μ 1 (不含药物的培养基)，以上操作在无菌条件下进行。3.活性测定法PC12细胞用完全培养基于37°C、5%二氧化碳培养，控制细胞浓度为每Iml含1.0X IO5 5X IO5个细胞。传代后M 36小时后，用于生物学活性测定。将实验所用溶液预温到37°C。取足量PC12细胞培养物，离心收集PC12细胞，重悬于基础培养基配成每Iml含2 X IO4个细胞的细胞悬液，接种于M孔细胞培养板中含有NGF标准品或样品的孔，每孔500μ 1。置于37°C，5%二氧化碳培养，每隔3天更换新鲜的培养基液，维持相同的药物浓度。在倒置显微镜下观察细胞生长的状态并照相。如图8所示，未诱导的PC12 细胞数量有所增加，但是未见神经纤维生长，而与小鼠NGF —样，本发明所述的rhNGF具有良好的生物活性，可以诱导PC12细胞分化及神经纤维的生长，倒置显微镜下可观察到细长呈分支装的神经纤维自PC12细胞呈放射状向四周生长并相互联接。以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制。虽然本发明已以较佳实施例公开如上，然而并非任何方式限定本发明。任何本领域熟练技术人员，在本发明的技术方案范围内，凡利用上述公开的技术内容做出少许改动或修饰，应视为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
权利要求
1.高效表达重组人神经生长因子的CHODG44-NGF-118细胞株，其保藏编号为CGMCC No.佔41。
2.根据权利要求1所述的CHODG44-NGF-118细胞株，其宿主细胞为经过无血清悬浮驯化的 CHO DG44。
3.根据权利要求1所述的CHO细胞株，所述CHO细胞株具有编码SEQID No. 2所示蛋白质的核苷酸序列。
4.根据权利要求3所述的CHO细胞株，所述核苷酸序列如SEQID No. 1所示。
5.权利要求1-4任一所述的CHO细胞株的构建方法，包括以下步骤(1)人工合成如SEQID No. 1所示的核苷酸序列，插入到pOptiVEC-polylinker的多克隆位点，得到重组质粒，(2)将质粒转入无血清悬浮驯化的CHODG44的中，(3)逐步提高氨甲蝶呤浓度的方式加压筛选，得到混合克隆细胞，(4)采用甲基纤维素半固体培养基进行亚克隆挑选单克隆细胞株，采用ELISA法检测单克隆细胞株的表达量，筛选得到高效表达的重组人神经生长因子的CHO细胞株。
6.根据权利要求5所述的构建方法，其中核苷酸序列插入到pOptiVEC-polylinker的 Xba I和Not I酶切位点之间。
7.根据权利要求6所述的构建方法，所述重组质粒为p0ptiVEC/NGF-118，其制备方法包括如下步骤(A)人工合成如SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列，并连接到pcDNA3. 1载体上构建成功pcDNA3. 1/NGF-118重组质粒，(B)分别用Xba I和Not I双酶切pcDNA3. 1/ NGF-118重组质粒和pOptiVEC-polylinker，然后回收酶切后的NGF基因片段和线性化的 pOptiVEC载体进行连接，转化大肠杆菌感受态细胞，挑取单克隆扩大培养后提取质粒，用双酶切法和序列测定法鉴定阳性重组子，获得p0ptiVEC/NGF-118重组质粒。
8.根据权利要求5所述的构建方法，所述氨甲蝶呤的最终浓度为400nM。
9.根据权利要求8所述的构建方法，所述步骤(3)加压筛选为在含氨甲喋呤浓度为 IOnM选择培养基开始加压筛选，然后按照浓度分别为20nM，40nM, 60nM, 80nM, IOOnM, 200nM 和400nM的梯度逐步提高选择培养基中氨甲喋呤的浓度。
10.权利要求1-4任一所述CHO细胞株在生产人神经生长因子蛋白质药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及“高效表达重组人神经生长因子的CHO细胞株及其构建方法”，属于生物技术领域。该细胞株的保藏编号为CGMCC No.4541，能稳定表达具有生物活性的重组人神经生长因子(rhNGF)。本发明还公开了构建该CHO细胞株的方法，通过细胞转染、基因扩增和对扩增后细胞系进行亚克隆筛选，获得了适合无血清悬浮培养的高效表达单克隆细胞株。本发明同时也公开了该CHO细胞株分泌表达的重组人神经生长因子序列，分泌的重组人神经生长因子具有良好的生物活性，在体外可以维持PC12增殖，诱导PC12细胞分化以及刺激鸡胚背根神经节神经纤维生长，为大规模产业化制备重组人神经生长因子奠定了良好基础。
文档编号C12N5/10GK102586190SQ201110004328
公开日2012年7月18日 申请日期2011年1月11日 优先权日2011年1月11日
发明者乐伟, 刘荷中, 史权威, 彭璐佳, 葛艳华 申请人:北京华安科创生物技术有限公司