专利名称：利用苹果酸钠提高次黄嘌呤核苷产率的方法
技术领域：
本发明属于一种食品和医疗产品重要的中间体次黄嘌呤核苷的生产方法。
背景技术：
次黄嘌呤核苷又名次黄嘌呤肌苷，英文名称hosine，简称IR。次黄嘌呤核苷为白色结晶性粉末或类白色结晶性粉末，无臭；味微苦；在水中略溶，在氯仿、乙醇中不溶，在稀盐酸或氢氧化钠等碱溶液中易溶。分子式=CltlH12N4O5,分子量』68· 23。次黄嘌呤核苷的用途十分广泛，是食品和医药产品的重要中间体。在医药工业领域，肌苷可以直接透过细胞膜进入细胞内参与人体代谢，促进体内能量代谢和蛋白质合成， 提高丙酮酸氧化酶活力，使低能、缺氧状态细胞的腺三磷水平提高。在医疗上广泛用于治疗心脏病、肝病及由放射线和抗癌药物所引起的白血球减少症、血小板减少症、视神经萎缩、 中心性视网膜炎、并能预防和解除由血防药物引起的对心脏或肝脏的副作用；另外还是作为合成利巴韦林、阿昔洛韦等核苷类抗病毒药物的重要中间体；在食品工业领域，次黄嘌呤核苷是作为呈味核苷酸肌苷酸二钠的主要原料，与鸟苷酸二钠混合简称I+G，添加到味精中即是第二代、第三代味精，具有十分广阔的市场。目前，I+G需求量以每年10%-20%的速度增加。次黄嘌呤核苷的生产方法有化学合成法、菌体自溶法、发酵法。由于化学合成法需要大量有机溶剂，存在原料来源及环境污染等问题在生产中极少使用；菌体自溶法由于其效率太低目前也基本不用；发酵法生产次黄嘌呤核苷由于其产率高、周期短、控制容易等优点，目前已经成为工业化生产次黄嘌呤核苷的重要方法。以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)为发酵菌种制备核苷具有产量高、产物中副产物少、便于产物分离提取等优点， 因而，枯草芽孢杆菌成为核苷发酵工业最重要的生产菌。20世纪30年代日本就大规模开展了发酵法生产次黄嘌呤核苷研究，主要侧重于传统的诱变育种技术改变菌种特性，提高次黄嘌呤核苷产量，最高达30g/L，而且近几年对次黄嘌呤核苷发酵研究较少。而我国对肌苷系列的化合物的研究始于70年代，随着核苷市场需求激增，越来越多的科研机构对次黄嘌呤核苷发酵进行了全面深入的研究。据调查显示，目前国内次黄嘌呤核苷发酵水平与世界先进水平有较大差距。主要原因是育种技术落后，菌种产苷水平不高；发酵周期长、转化率及提取综合收率低。因此，开发高产肌苷生产菌和优化控制发酵条件是十分必要的。
发明内容
针对上述同类技术的不足，本发明的目的是利用苹果酸钠提高枯草芽孢杆菌发酵生产次黄嘌呤核苷产率的方法。本发明的具体生产方法是1、摇瓶液体菌种培养①选用枯草芽孢菌Bacillus subtilis⑶IR-1005为保藏菌种；②将葡萄糖、磷酸氢二钾、硫酸镁、苹果酸钠、酵母粉、琼脂、水按比例配制成初级菌种培养基并装入茄瓶；③在初级菌种培养基中接入步骤①所述的保藏菌种，静置培养后获得初级菌种；④将初级菌种接入摇瓶培养基中，并在往复式摇床上培养，获得摇瓶液体菌种。2、高产率次黄嘌呤核苷发酵液制取①将葡萄糖、磷酸氢二钾、硫酸镁、苹果酸钠、酵母粉水按比例配制成二级菌种培养基，蒸汽灭菌后泵入二级种子罐，降温后接入上述摇瓶液体菌种，并将经压缩、过滤的无菌空气输入二级种子罐，培养后获得二级菌种；②将葡萄糖、磷酸氢二钾、硫酸镁、苹果酸钠、酵母粉、水按比例配制成发酵培养基，蒸汽灭菌后泵入发酵罐，然后接入二级菌种，并将蒸汽灭菌、降温后的葡萄糖与苹果酸钠液，在无菌、保压空气的情况下进行流加培养后，获得高产率次黄嘌呤核苷发酵液。所述制初级菌种培养基的原料重量百分比为葡萄糖磷酸氢二钾硫酸镁苹果酸钠酵母粉琼脂水=士0. 5% 0. 2% 士0. 2% 0. 士0. 0.2% 士 0.2% 2% 士 2% 2% 士 2% 94. 5% 士 5%。所配摇瓶菌种培养基的原料重量百分比为葡萄糖磷酸氢二钾硫酸镁 苹果酸钠酵母粉水=3% 士0.5% 0.2% 士0.2% 0. 1 % 士0. 1 % 0.2% 士 0.2% 1. 5% 士 1.5% 95% 士 2.5%。所述二级菌种培养基的原料重量百分比为葡萄糖磷酸氢二钾硫酸镁苹果酸钠酵母粉水=5% 士 0. 2% 士0. 2% 0. 1% 士0. 1% 0. 2% 士0. 2% 1. 5% 士 1. 5% 93. 5% 士2. 5%。所述发酵培养基的原料重量百分比为葡萄糖磷酸氢二钾硫酸镁苹果酸钠酵母粉水=15% 士3% 0. 2% 士0. 2% 0. 士0. 0. 士0. 0. 8% 士0. 8% 83. 8% 士4. 2%。以50 70g/dL葡萄糖液与重量百分比0. 1 0. 2%苹果酸钠的量对发酵液进行连续流加。本发明的优点是①保藏菌种GDIR-1005遗传稳定，菌种同步生产率高，产苷水平高；②采用发酵培养基添加苹果酸钠技术，提高枯草芽孢杆菌生物合成次黄嘌呤核苷的产率达到58. 2g/L，③采用连续流加葡萄糖和苹果酸钠的技术，提高次黄嘌呤核苷对葡萄糖的转化率达到43.6%。
具体实施例方式本发明的具体生产方法是1、摇瓶液体菌种培养①选用枯草芽孢菌⑶IR-1005为保藏菌种；②将葡萄糖磷酸氢二钾硫酸镁苹果酸钠酵母粉琼脂水按 1% 0. 2% 0. 1% 0. 2% 2% 2% 94. 5%的重量百分比，配制成初级菌种培养基并装入茄瓶；③将步骤②中的初级培养基接入保藏菌种，接种量为0. 1%，在温度37士0. 5°C条件下静置培养20h 士池后获得初级菌种；④将步骤③得到的初级菌种，放入按葡萄糖磷酸氢二钾硫酸镁苹果酸钠酵母粉水=3%% 0. 2%% 0. 1%% 0. 2%% 1. 5%% 95%%重量百分比配制成的摇瓶培养基中，并在往复式摇床上培养，160士 10转/分，温度37°C 士0. 5°C，时间周期 10 12h，当菌种镜检及OD等各项指标达标后即获得摇瓶液体菌种。2、高产率次黄嘌呤核苷发酵液制取①将葡萄糖、磷酸氢二钾、硫酸镁、苹果酸钠、酵母粉、水按 5% 0.2% 0. 1% 0.2% 1.0% 93. 5%的重量百分比配制成二级菌种培养基，并经 121°C 士 l°C、15min士 Imin蒸汽灭菌后泵入二级种子罐，后降温至37°C 士0. 5°C接入摇瓶菌种，接种量为0. 士0.02% ；同时将经过0. 25 0. 3Mpa压缩、过滤后的无菌空气输入二级种子罐；此时通风比1 0. 2 0. 4v/V. min, pH6 8，压力0. 03 0. IMPa，培养IOh 12h，经菌种镜检及OD等各项指标达标后即获得二级菌种；②将葡萄糖、磷酸氢二钾、硫酸镁、苹果酸钠、酵母粉、水按 15% 0. 2% 0. 1% 0. 1% 0. 8% 83. 8%的重量百分比配制成发酵培养基， 经121°C 士 l°C、15min 士 Imin蒸汽灭菌后泵入发酵罐，后降温至37°C 士 0. 5°C接入二级菌种，接种量为10% 士0.5% ；同时在上述步骤①中保压、无菌空气输入的条件下，将经 120士 l°C、8min蒸汽灭菌后50 70g/dL的葡萄糖液与0. 2% 士0. 02%苹果酸钠同时进行连续流加；此时通风比为1 0. 3 0. 6v/V. min, pH 6 8，压力0. 04MPa 0. IMPa，发酵 50h 60h进行培养；当产苷达到55士2g/L时，即获得次黄嘌呤核苷发酵液。实例1 1、取葡萄糖lg，磷酸氢二钾0. 2g，硫酸镁0. Ig,苹果酸钠0. 2g，酵母粉2g，琼脂 2g，水94. 5g配制成初级菌种培养基并装入茄瓶，经121°C，22min蒸汽灭菌后，静置冷却至 37°C，接入保藏菌种，37°C无菌状态下静置培养20小时，得到初级菌种。2、取葡萄糖36g，磷酸氢二钾2. 4g，硫酸镁1. 2g，苹果酸钠2. 4g，酵母粉18g，水 1140. Og配制成摇瓶菌种培养基，装入摇瓶经121°C，20min蒸汽灭菌后，冷却至37°C，接入上步得到的初级菌种培养基液，在往复式摇床上培养，接种量为0. 1%，转速160转/分，温度36. 5°C，时间周期10h，获摇瓶液体菌种。所得菌种镜检菌体均勻，粗壮，无污染，用752 分光光度计测量(量程10mm，波长600nm)得OD为0. 71。3、取葡萄糖^Kg,磷酸氢二钾1. 4Kg，硫酸镁0. 7Kg，苹果酸钠1. 4Kg，酵母粉7Kg， 水661.5Kg配制成二级菌种培养基，泵入二级种子罐，经12rC、15min蒸汽灭菌后，无菌状态降温至37°C，接入摇瓶液体菌种。接种量为0. 1%，同时将经过0. 25Mpa压缩、过滤后的无菌空气输入二级种子罐；通风量10 25m7h，pH6. 8 7. 2，二级种子罐压力0. 05MPa，培养12h，获得二级菌种。二级菌种镜检菌体均勻，粗壮，无污染，用752分光光度计测量(量程10mm，波长600nm)得 OD 为 0. 83。4、取葡萄糖1050Kg，磷酸氢二钾14Kg，硫酸镁7Kg，苹果酸钠7Kg，酵母粉56Kg， 水5866Kg配制成发酵培养基，泵入发酵罐，经121°C、15min蒸汽灭菌后，无菌状态降温至 37 °C，接入二级液体菌种，接种量为0. 1 %，同时将经过0. 25Mpa压缩、过滤后的无菌空气输入发酵罐；通风量80 420m3/h，pH6. 8 7. 2 (通入液氨控制PH值)，发酵罐压力0. 05MPa, 将经120°C、Smin蒸汽灭菌后的700L的500g/L的葡萄糖液与0. 1 %苹果酸同时连续流加的方式加入发酵罐中，使发酵罐中葡萄糖液浓度始终保持在20-40g/L之间，流加结束后，葡萄糖浓度稳步下降到0 0. 5g/L，发酵终止，发酵停止后得鸟嘌呤核苷发酵液8500L，发酵55h，产酸达到58. 2g/L、转化率43. 6%0实例2 1、取葡萄糖lg，磷酸氢二钾0. 2g，硫酸镁0. Ig,苹果酸钠0. Og,酵母粉2g，琼脂 2g，水94. 7g配制成初级菌种培养基，装入茄瓶经121 °C，22min蒸汽灭菌后，静置冷却至 37°C，接入保藏菌种，37°C无菌状态下静置培养20小时，得到初级菌种。2、取葡萄糖36g，磷酸氢二钾2. 4g，硫酸镁1. 2g，苹果酸钠0. Og,酵母粉18g，水 1142. 4g配制成摇瓶菌种培养基，装入摇瓶经121°C，20min蒸汽灭菌后，冷却至37°C，接入上步得到的初级菌种培养基液，在往复式摇床上培养，接种量为0. 1%，转速160转/分，温度36. 5°C，时间周期10h，获摇瓶液体菌种。所得菌种镜检菌体均勻，粗壮，无污染，用752 分光光度计测量(量程10mm，波长600nm)得OD为0. 60。3、取葡萄糖^Kg,磷酸氢二钾1. 4Kg，硫酸镁0. 7Kg，苹果酸钠0. OKg，酵母粉7Kg， 水662. 9Kg配制成二级菌种培养基，泵入二级种子罐，经121°C、15min蒸汽灭菌后，无菌状态降温至37°C，接入摇瓶液体菌种，接种量为0. 1%，同时将经过0. 25Mpa压缩、过滤后的无菌空气输入二级种子罐；通风量10 25m3/h，pH6. 8 7. 2，二级种子罐压力0. 05MPa，培养 14h，获得二级菌种。二级菌种镜检菌体均勻，粗壮，无污染，用752分光光度计测量(量程 IOmm,波长600nm)得 OD 为 0. 75。4、取葡萄糖1050Kg，磷酸氢二钾14Kg，硫酸镁7Kg，苹果酸钠0. OKg，酵母粉56Kg， 水5873Kg配制成发酵培养基，泵入发酵罐，经121°C、15min蒸汽灭菌后，无菌状态降温至 37 °C，接入二级液体菌种，接种量为0. 1%，同时将经过0. 25Mpa压缩、过滤后的无菌空气输入发酵罐；通风量80 420m3/h，pH6. 8 7. 2 (通入液氨控制PH值)，发酵罐压力0. 05MPa, 将经120°C、Smin蒸汽灭菌后的650L的500g/L的葡萄糖液与0. 1 %苹果酸同时连续流加的方式加入发酵罐中，使发酵罐中葡萄糖液浓度始终保持在20 40g/L之间，流加结束后，葡萄糖浓度稳步下降到0 0. 5g/L，发酵终止，发酵停止后得鸟嘌呤核苷发酵液8500L，发酵 60h，产酸达到47. 3g/L、转化率35. 16%。实例3 1、取葡萄糖lg，磷酸氢二钾0. 2g，硫酸镁0. Ig,苹果酸钠0. 4g，酵母粉2g，琼脂 2g，水94. 3g配制成初级菌种培养基，装入茄瓶经121 °C，22min蒸汽灭菌后，静置冷却至 37°C，接入保藏菌种，37°C无菌状态下静置培养20小时，得到初级菌种。2、取葡萄糖36g，磷酸氢二钾2. 4g，硫酸镁1. 2g，苹果酸钠4. 8g，酵母粉18g，水 1137. 6g配制成摇瓶菌种培养基，装入摇瓶经121°C，20min蒸汽灭菌后，冷却至37°C，接入上步得到的初级菌种培养基液，在往复式摇床上培养，接种量为0. 1%，转速160转/分，温度36. 5°C，时间周期10h，获摇瓶液体菌种。所得菌种镜检菌体均勻，粗壮，无污染，用752 分光光度计测量(量程10mm，波长600nm)得OD为0. 78。3、取葡萄糖^Kg,磷酸氢二钾1. 4Kg，硫酸镁0. 7Kg，苹果酸钠2. 8Kg，酵母粉7Kg， 水660. IKg配制成二级菌种培养基，泵入二级种子罐，经12rC、15min蒸汽灭菌后，无菌状态降温至37°C，接入摇瓶液体菌种，接种量为0. 1%，同时将经过0. 25Mpa压缩、过滤后的无菌空气输入二级种子罐；通风量10 25m3/h，pH6. 8 7. 2，二级种子罐压力0. 05MPa，培养 10h，获得二级菌种。二级菌种镜检菌体均勻，粗壮，无污染，用752分光光度计测量(量程 10mm,波长600nm)得 OD 为 0. 91。
4、取葡萄糖1050Kg，磷酸氢二钾14Kg，硫酸镁7Kg，苹果酸钠14Kg，酵母粉56Kg， 水5859Kg配制成发酵培养基，泵入发酵罐，经121°C、15min蒸汽灭菌后，无菌状态降温至 37 °C，接入二级液体菌种，接种量为0. 1%，同时将经过0. 25Mpa压缩、过滤后的无菌空气输入发酵罐；通风量80 420m3/h，pH6. 8 7. 2 (通入液氨控制PH值)，发酵罐压力0. 05MPa, 将经120°C、Smin蒸汽灭菌后的750L的500g/L的葡萄糖液与0. 1 %苹果酸同时连续流加的方式加入发酵罐中，使发酵罐中葡萄糖液浓度始终保持在20 40g/L之间，流加结束后，葡萄糖浓度稳步下降到0 0. 5g/L，发酵终止，发酵停止后得鸟嘌呤核苷发酵液9000L，发酵 52h，产酸达到44. lg/L、转化率34. 4% ο
权利要求
1.利用苹果酸钠提高次黄嘌呤核苷产率的方法，其特征是在于如下所述(1)摇瓶液体菌种培养①选用枯草芽孢菌Bacillussubtilis⑶IR-1005为保藏菌种，②将葡萄糖、磷酸氢二钾、硫酸镁、苹果酸钠、酵母粉、琼脂、水按重量百分比配制成初级菌种培养基并装入茄瓶，③在初级菌种培养基中接入步骤(1)①所述的保藏菌种，静置培养后获得初级菌种，④将上述初级菌种接入摇瓶培养基中，并在往复式摇床上培养，获得摇瓶液体菌种；(2)高产率次黄嘌呤核苷发酵液制取①将葡萄糖、磷酸氢二钾、硫酸镁、苹果酸钠、酵母粉、水按重量百分比配制成二级菌种培养基，蒸汽灭菌后泵入二级种子罐，降温后再接入步骤(1)④所述的摇瓶液体菌种，并将经压缩、过滤的无菌空气输入二级种子罐，培养后获得二级菌种；②将葡萄糖、磷酸氢二钾、硫酸镁、苹果酸钠、酵母粉、水按重量百分比配制成发酵培养基，蒸汽灭菌后泵入发酵罐，降温后再接入步骤( ①所述的二级菌种，并将经蒸汽灭菌、 降温后的葡萄糖与苹果酸钠液，在无菌、空气保压的情况下进行连续流加培养，即可获得高产率次黄嘌呤核苷发酵液。
2.根据权利要求1所述的利用苹果酸钠提高发酵生产肌苷产率的方法，其特征是初级菌种培养基的原料重量百分比为葡萄糖磷酸氢二钾硫酸镁苹果酸钠酵母粉琼脂水=士0. 5% 0. 2% 士0. 2% 0. 士0. 0. 2% 士0. 2% 2% 士2% 2% 士2% 94. 5% 士5%。
3.根据权利要求1所述的利用苹果酸钠提高发酵生产肌苷产率的方法，其特征是摇瓶菌种培养基的原料重量百分比为葡萄糖磷酸氢二钾硫酸镁苹果酸钠酵母粉水 =3% 士0. 5% 0. 2% 士0. 2% 0. 士0. 0. 2% 士0. 2% 1. 5% 士 1. 5% 95% 士2. 5%。
4.根据权利要求1所述的利用苹果酸钠提高发酵生产肌苷产率的方法，其特征是二级菌种培养基的原料重量百分比为葡萄糖磷酸氢二钾硫酸镁苹果酸钠酵母粉水 =5% 士 0. 2% 士0. 2% 0. 士0. 0. 2% 士0. 2% 1. 5% 士 1. 5% 93. 5% 士2. 5%。
5.根据权利要求1所述的利用苹果酸钠提高发酵生产肌苷产率的方法，其特征是发酵培养基的原料重量百分比为葡萄糖磷酸氢二钾硫酸镁苹果酸钠酵母粉水= 15% 士3% 0. 2% 士0. 2% 0. 士0. 0. 士0. 0. 8% 士0. 8% 83. 8% 士4. 2%。
6.根据权利要求1所述的利用苹果酸钠提高发酵生产肌苷产率的方法，其特征是以 50 70g/dL葡萄糖液与重量百分比0. 1 0. 2%苹果酸钠的量进行连续流加。
全文摘要
本发明公开了一种利用苹果酸钠提高次黄嘌呤核苷产率的方法，它由摇瓶液体菌种培养、肌苷发酵液制取两大工艺过程组成。选用了遗传稳定的保藏菌种GDIR-1005，根据调整细胞代谢流分配的原理，在发酵过程中采用添加苹果酸钠和流加葡萄糖液、苹果酸钠的新工艺，有效提高肌苷发酵过程产率，克服了发酵培养基C∶N比例失调、菌种产苷不高、发酵周期长、转化率低等不足。菌种同步生产率和产苷水平高，发酵产苷水平高，肌苷产率可达58g/L以上，转化率43％以上，达到现有工艺的最高水平。
文档编号C12R1/125GK102154414SQ20111006388
公开日2011年8月17日 申请日期2011年3月17日 优先权日2011年3月17日
发明者王健, 蔡传康, 闫汝东 申请人:许昌瑞达生物科技有限公司