专利名称：基于磁分离与高保真聚合酶校正功能的核酸序列分析方法
技术领域：
本发明涉及核酸序列分析领域，特别是涉及一种基于磁分离与高保真聚合酶校正功能的核酸序列分析方法，所述核酸序列比由常规Sanger测序法所能分析的序列长度更长。
背景技术：
生物的遗传信息由非常长的脱氧核糖核酸(DNA)分子组织成染色体的形式储存。 在生物学研究中，DNA序列分析对于遗传信息的获取至关重要，是遗传学和基因组学发展的基础。基于测序技术的深入而全面的遗传学和基因组学研究可以应用于基础研究(基因功能鉴定、信号通路构建、系统生物学、生物进化、疾病机理研究等)，也可以应用于临床领域 (疾病预测、预防、早期诊断、个性化治疗等)。2000年6月沈日，人类基因组工作草图由美国、英国、法国、德国、日本和中国科学家宣布基本完成，2002年2月又公布了“精细图”。这是基因组学研究领域的一个里程碑式的工作。随着人类基因组计划的实施，也推动了模式生物基因组的测序工作。目前，科学家已完成了水稻、家蚕、大鼠、小鼠、熊猫等多类物种的基因组测序。自人类基因组测序完成，美国国立卫生研究院(National Institute of Health, NIH)便提供了 “革命性基因组测序技术”(Revolutionary Genome Sequencing Technologies)项目基金，以开发革命性的DNA测序技术为目标，并随之推出了 1000美元基因组计划，使得发展高通量、低成本、长读取长度的测序技术越来越受到关注，也预示着将来的测序技术不仅只作为一种科学研究的工具，而将发展成为一种产业，为人类的生活健康服务。针对基因组测序，已发展了多种方法，最早可以追溯到20世纪50年代。1%4年已经出现了关于测序技术的报导，即Whitfeld等用化学降解的方法测定多聚核糖核苷酸序列。1975年至1977年间，Sanger等发明的双脱氧核苷酸(Dideoxyribonucleotide triphosphate, ddNTP)末端终止法和Gilbert等发明的化学降解法，标志着第一代测序技术的诞生，它帮助人们完成了从噬菌体基因组到人类基因组草图等大量的测序工作，但由于其存在成本高、速度慢等方面的不足，因此并不是最理想的测序方法。在此后三十几年的发展中陆续产生了第二代测序技术，包括Roche公司的妨4技术、Illumina公司的Solexa 技术和ABI公司的SOLiD技术。与第一代技术相比，第二代测序技术不仅保持了高准确度， 而且大大降低了测序成本并极大地提高了测序速度，但由于第二代测序技术产生的测序结果长度较短，比较适合对序列已知的基因组进行重新测序，在对全新的基因组进行测序时还需要结合第一代测序技术。近年，Helicos公司的单分子测序技术、Pacific Biosciences 公司的单分子实时(Single Molecule Real Time, SMRT)测序技术和 Oxford NanoporeTechnologies公司正在研究的纳米孔单分子测序技术被认为是第三代测序技术。第一代测序方法中，Sanger法和Gilbert法都是先得到随机长度的DNA链，再通过电泳方法读出序列。两者不同之处在于，Sanger法通过ddNTP随机中断待测序列的合成，而Gilbert法是先用特定的化学试剂标记碱基再用化学方法打断待测序列。目前广泛使用的测序方法都基于Sanger法，该方法的原理是利用DNA聚合酶对结合在待测定序列模板上的引物进行延伸，直到掺入一种ddNTP为止。每一轮序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有四种脱氧核糖核苷酸(Deoxyribonucleotide triphosphate, dNTP), 并混有一定比例的一种ddNTP，DNA核苷酸链通过和dNTP戊糖C-3位的羟基反应而延长， 而ddNTP由于其戊糖C-3位不含羟基而使核苷酸链的延伸反应终止，由此产生不同长度的核酸片段，它们具有共同的起始点，但终止在不同的ddNTP上，进而通过各种信号分析手段读取核苷酸序列，包括最初的电泳方法以及后来发展的荧光标记方法等。然而，除去成本与通量的考虑，目前基于Sanger法的测序方法都存在读长不够长(500-1000bp)的主要缺陷。 造成此缺陷的原因主要有两方面一方面由于聚合酶的合成能力有限，合成的片段长度有限(500-700bp);另一方面由于目前信号分析能力有限，超过一定长度后，由于信号累积造成的背景干扰或信号淬灭致无法获取等原因，无法解码长度更长的序列。读长不够长之缺陷即引起了核酸片段拼接组装的难题，尤其是存在大量重复序列的情况下。因此，在片段合成和信号解析方面取得突破是改进Sanger测序法读长不够长之缺陷的关键。众所周知，高保真DNA聚合酶由于具有3’ -5’核酸外切酶活性，能够在DNA核苷酸链延伸的过程中，将错误配对的核苷酸移除，再以正确配对的核苷酸为底物继续进行DNA 核苷酸链的合成，称之为高保真聚合酶的校正功能。在测序技术的发展过程中，为了提高 DNA聚合酶的合成能力，通过基因工程的方法对聚合酶进行了改造，得到了专为测序反应使用的不具有3’ -5’核酸外切酶活性且合成速度较快的DNA聚合酶，称之为测序酶。测序酶由于在延伸DNA核苷酸链的过程中未对掺入的核苷酸进行检验与校正，在提高DNA核苷酸链合成速率的同时，也一定程度上提高了合成出错的概率。而实际上，高保真聚合酶的校正功能除了能将错配的核苷酸移除，还能将中断DNA核苷酸链合成的核苷酸移除，掺入正确配对并能继续DNA核苷酸链合成的核苷酸，使DNA核苷酸链的延伸合成得以继续。因此，高保真DNA聚合酶的校正功能，不仅能提高DNA核苷酸链合成的正确率，也能够降低测序过程中的背景信号，是具有双重功能的非常有用而方便的工具酶。
发明内容
发明目的本发明的目的在于解决上述所提到的传统Sanger测序方法中读长不够长的问题，提出一种基于磁分离与高保真聚合酶校正功能的核酸序列分析方法，具有背景信号低、读长更长和操作方便的优点。技术方案一种基于磁分离与高保真聚合酶校正功能的核酸序列分析方法，1) 将耐3’ -5’核酸外切酶消化的测序引物固定于磁性介质上，与待测DNA序列进行杂交；2) 加入成分包括不具有3’ -5’核酸外切酶活性之DNA聚合酶的第一步延伸反应溶液，延伸经过标记的脱氧核糖核苷酸单体与双脱氧核糖核苷酸单体，通过检测标记物信号得到核苷酸种类与个数信息；3)加入成分包括具有3’ -5’核酸外切酶活性之高保真DNA聚合酶的第二步延伸反应溶液，利用高保真聚合酶的校正功能移除2)中已延伸的ddNTP并替换延伸上耐3’ -5’核酸外切酶消化的核苷酸单体；4)对磁性介质进行磁分离并清洗；循环上述步骤 2)、3)和4)所进行的过程，直到确定待测DNA中的核苷酸序列信息。所述磁性介质为体现磁学性质的物体，包括具有磁学性质的物质构成的物体或以具有磁学性质的物质为部件的物体，包括平板、微孔、微球。所述经过标记的脱氧核糖核苷酸单体与双脱氧核糖核苷酸单体为直接或间接标记着荧光分子、放射性同位素或酶的dNTP与ddNTP。所述经过标记的dNTP与ddNTP，所述四种单体均标记相同的标记物，或标记不相同、不完全相同的标记物。经过标记的dNTP与ddNTP，其中ddNTP与同种类dNTP之间的分子数比例为1:50^1:10000ο所述不具有3，-5，核酸外切酶活性之DNA聚合酶为Taq DNA聚合酶、Τ7测序酶、 Vent" DNA聚合酶、DeepVent- DNA聚合酶或测序酶。所述具有3’ -5’核酸外切酶活性的高保真DNA聚合酶为Vent DNA聚合酶、 DeepVent DNA聚合酶或Pfu DNA聚合酶。所述耐3’ -5’核酸外切酶消化的核苷酸单体为硫化修饰的dNTP α S、环化修饰的 acy-NTP或锁核酸。采用线性方式依次读取完整核苷酸序列或采用阵列方式读取部分核苷酸序列后再利用序列拼接软件进行拼接。该测序技术具体过程如下
1)以四种经过标记的双脱氧核糖核苷酸单体ddATP、ddTTP、ddCTP、ddGTP进行单碱基延伸反应，记录得到的信号值，作为下述测序过程中信号处理的基准。2)将耐3’ -5’核酸外切酶消化的测序引物固定于磁性介质上，与待测DNA序列进行杂交。所述耐3’-5’核酸外切酶消化的测序引物即引物末位核苷酸为硫化修饰的 dNTP α S、环化修饰的acy-NTP或锁核酸(Locked Nucleic Acid, LNA)。所述磁性介质为体现磁学性质的物体，包括以具有磁学性质的物质构成的物体或以具有磁学性质的物质为部件的物体，包括平板、微孔、微球，这对于本领域普通技术人员是显然的。3)平行进行四组反应，加入第一步延伸反应溶液，溶液成分包括不具有3’ -5’核酸外切酶活性之DNA聚合酶、四种经过标记的双脱氧核糖核苷酸单体ddATP、ddTTP、ddCTP、 ddGTP中的一种及其对应的脱氧核糖核苷酸单体dATP、dTTP、dCTP、dGTP，ddNTP与同种类正常dNTP之间的分子数比例为1 50 1 10000，优选比例1 100 1 5000，更优选比例为 1 10(Tl 2000，最优选比例为1 1000，通过延伸进行经典的链终止反应，进而检测标记物信号得到核苷酸种类及个数信息。所述不具有3’ -5’核酸外切酶活性之DNA聚合酶为Taq DNA聚合酶、Τ7测序酶、Vent—DNA聚合酶、De印Vent— DNA聚合酶、测序酶等。所述经过标记的dNTP与ddNTP为直接或间接标记着可检测到的基团的脱氧核糖核苷单体与双脱氧核糖核苷单体，例如荧光分子、放射性同位素、酶等常规标记物，这对于本领域的普通技术人员是显然的。所列举的酶和标记物只是举例说明本发明，不能以任何方式限制本发明的范围。4)继续平行进行四组反应，加入第二步延伸反应溶液，溶液成分包括具有3’ -5’ 核酸外切酶活性的高保真DNA聚合酶，步骤3)中检测知道的特定的一种耐3’-5’核酸外切酶消化的核苷酸单体，利用高保真聚合酶的校正功能移除步骤3)中已延伸的带有标记物
5的核苷酸单体并以耐3’-5’核酸外切酶消化的核苷酸单体为底物进行核苷酸链的延伸。所述具有3，-5，核酸外切酶活性的高保真DNA聚合酶为Vent DNA聚合酶、De印Vent DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶等。所述耐3’-5’核酸外切酶消化的核苷酸单体为硫化修饰的dNTP α S、 环化修饰的acy-NTP或锁核酸(LNA)。这对于本领域的普通技术人员是显然的。所列举的酶和经过修饰的核苷酸单体只是举例说明本发明，不能以任何方式限制本发明的范围。5)利用磁铁对磁性介质进行磁分离并以清洗缓冲液对磁性介质进行若干次清洗，清除步骤3)与步骤4)中经过标记的ddNTP;再次检测标记物信号，记录数值作为下一轮反应信号值的基数。循环上述3)、4)和5)所进行的过程，直到确定待测DNA中的核苷酸序列信息。有益效果与现有技术相比，本发明具有以下特点
①磁性介质的引入使得两步延伸反应溶液的替换与清洗过程变得迅速而方便，整个测序过程不仅可以在单个反应容器中以线性方式进行，也可以排列成阵列方式进行；有利于发展成为高通量自动化的平台技术，从而有可能通过自动化仪器实现测序工作，具有很大的应用前景。②高保真DNA聚合酶的校正功能使测序过程减少了错误延伸的现象。在DNA扩增中通常使用的Taq DNA聚合酶扩增碱基的出错率为10_5，而高保真DNA聚合酶扩增碱基的出错率为10_6，因此高保真DNA聚合酶的引入有利于提高测序结果的准确性。③另一方面，高保真DNA聚合酶的校正功能降低了标记物的信号累积效应。在传统的延伸合成测序方法中，当标记物阻碍了下一步测序信息的获得时，通常采用将标记物破坏或者将标记物与单体分离的方法清除标记物信息，以进行下一步延伸测序。但是，无论是采用化学或物理的方法破坏标记物结构，还是将标记物与单体切割分离，都可能对延伸位点造成破坏，从而增加错误延伸的可能性，影响测序的长度和正确性。而本发明提供的方法利用酶对带有标记物的核苷酸进行生物切割，在清除标记物信号、减少背景噪音的同时， 也保护了延伸位点的完整性，有利于进行长读长的序列分析。
图1为本发明“一种基于磁分离与高保真聚合酶校正功能的核酸序列分析方法” 中公布之具体实施方式
的实验流程。图2为核壳型Y -Fe203iAu金磁颗粒的制备过程示意图； 图3为Y-Fe2O3OAu复合颗粒的透射电镜图4为颗粒的红外吸收图谱。图5为高保真DNA聚合酶的校正功能。泳道0 :DNA分子量标志DL2000 ；泳道1 上游引物末位碱基为ddNTP + Taq DNA聚合酶；泳道2 上游引物末位碱基为dNTP + Taq DNA聚合酶；泳道3 上游引物末位碱基为ddNTP + Pfu高保真DNA聚合酶；泳道4 上游引物末位碱基为dNTP + Pfu高保真DNA聚合酶。图6为经配有Cy5滤色片的扫描仪扫描后记录的荧光信号图。图6A为第一轮延伸时四组反应中Cy5荧光信号图；图6B为第二轮延伸时四组反应中Cy5荧光信号图；图6C 为第三轮延伸时四组反应中Cy5荧光信号图。
具体实施例方式本发明利用磁性介质利于分离的特性与高保真DNA聚合酶的校正功能，公布了一种能够迅速完成原位清除链终止核苷酸并替换延伸进行核酸序列分析的方法。在本发明的一个较佳实施例中，以金磁纳米颗粒作为磁性介质、Pfu高保真DNA聚合酶原位清除链终止核苷酸并替换延伸进行序列分析，具体实验流程如图1示。①将耐3’-5’核酸外切酶消化的测序引物固定于磁性介质上，与待测DNA序列进行杂交；②加入成分包括不具有3’ -5’ 核酸外切酶活性之DNA聚合酶的第一步延伸反应溶液，延伸经过标记的脱氧核糖核苷酸单体与双脱氧核糖核苷酸单体，通过检测标记物信号得到核苷酸种类与个数信息；③加入成分包括具有3’ -5’核酸外切酶活性之高保真DNA聚合酶的第二步延伸反应溶液，利用高保真聚合酶的校正功能移除②中已延伸的ddNTP并替换延伸上耐3’-5’核酸外切酶消化的核苷酸单体；④对磁性介质进行磁分离并清洗；循环上述步骤②、③和④所进行的过程，直到确定待测DNA中的核苷酸序列信息。以下特定的实施例旨在更详细地描述本发明。这些实施例的目的在于解释本发明，而不应理解为限定本发明的范围。实施例1适合测序的金磁纳米颗粒的制备
磁性纳米颗粒是指颗粒尺度至少有一维在1-1000 nm之间的材料，当它们达到一定的临界尺度时，会呈单磁畴并表现出超顺磁性，是20世纪70年代以来逐步产生和发展起来的新型生物医学功能材料。在通常情况下，处于胶态的磁性微粒呈杂乱无序的运动状态，可稳定悬浮于液相介质中，方便地进行各种生物学反应；而在外磁场作用下磁性微粒便表现出良好的磁响应性，可方便地将微粒与介质分离开来；当撤去外加磁场后，磁性微粒又可重新悬浮于液相介质中而不聚集。在本发明实施例中，后续反应检测的是荧光标记信号，由于一般的磁性纳米颗粒存在一定的荧光背景，不利于信号采集，因此需要在磁性纳米颗粒表面修饰金壳，有效消除磁性纳米颗粒的荧光背景才适合在其表面直接读取信号进行核酸序列分析。图2给出了核壳型Y -Fe2O3OAu金磁颗粒的合成过程，包括三个步骤①制备磁性纳米!^e3O4颗粒，采用高温焙烧的方法把!^e3O4颗粒氧化成、-Fe2O3颗粒；②将得到的 Y-Fe2O3磁性颗粒以有机硅烷试剂修饰，在其表面引入-SH基团；③将氯金酸在柠檬酸的环境中原位还原到巯基功能化的Y-Fe2O3颗粒表面，得到核壳结构的Y-Fe2O3OAu复合颗粒。具体实验过程如下所述。①采用溶剂热法制备直径为300 nm左右的!^e3O4磁性纳米颗粒。称取!^eCl3 ·6Η20 1. 35 g、醋酸钠(NaAc) 3. 6 g 以及聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG) 1.0 g，溶解于40 ml乙二醇中，磁搅拌溶解，形成黄褐色的胶体。将胶体转移至四氟乙烯反应釜，密封，以200° C反应8小时；反应完全后磁分离，以乙醇与去离子水清洗，烘干后即得!^e3O4磁性纳米颗粒样品。取上述制备得到的!^e3O4颗粒置于马弗炉中以380°C焙烧2小时，自然冷却至室温后得到Y-Fe2O3磁性纳米颗粒。②将上述Y-Fe2O3纳米颗粒研磨均勻后重新分散于95%乙醇中并超声，以170转/分进行搅拌，同时滴加入3-巯丙基三甲氧基硅烷(3-Mercaptopropyltriethoxysilane，MPTES)，搅拌过夜，反应完全后磁分离，再用95%的乙醇洗涤三次，即得到巯基修饰的Y_Fe203磁性纳米颗粒。③将步骤②中所得巯基修饰的Y-Fe2O3颗粒分散于95%乙醇中，超声30分钟，以170转/分进行搅拌，并滴加入0. 44 M的氯金酸溶液与0. 2 M的柠檬酸钠溶液，反应完成后，以95%的乙醇洗涤三次，磁分离便得到了核-壳结构的Y -Fe2O3OAu复合颗粒。图3为Y-Fe2O3OAu复合颗粒的透射电镜图，可以看出颗粒呈球形、大小均勻，并有较好的分散性。图4为上述三步骤中分别得到之颗粒的红外吸收图谱，其中的a为Y-Fe2O3 颗粒的红外吸收曲线；b为Y-Fe2O3颗粒修饰巯基后的红外吸收曲线；c曲线为Y-FhO3OAu 复合颗粒的的红外吸收曲线。实施例2 Pfu高保真DNA聚合酶对于ddNTP校正功能的验证
3’_5’外切酶活性是多种DNA聚合酶具有的内在功能，它在DNA合成过程中对掺入的核苷酸进行检验，从3’ -5’方向移除与模板不匹配的核苷酸，称之为DNA聚合酶的校正功能。 根据DNA合成的不同需要，利用现代基因工程方法对各种DNA聚合酶进行了改造，得到了功能侧重不同的DNA聚合酶，Pfu高保真DNA聚合酶即是其中之一。Pfu高保真DNA聚合酶除了能从3’ -5’方向移除在DNA合成过程中掺入的与模板不匹配的核苷酸，还能移除在DNA 合成过程中掺入的阻碍核苷酸链继续延伸的核苷酸，例如具有空间位阻的经过修饰的核苷酸或终止了核苷酸链延伸的ddNTP。在本发明中，对若干种具有3’ -5’外切酶活性的高保真DNA聚合酶进行了检验， 筛选出能够有效移除ddNTP的Pfu高保真DNA聚合酶。实验过程如下加入IOXBuffer 2 μ L, Mg2+ (25 mM) 2 μ L、dNTP (2. 5 mM) 1.5 μ L、上游引物和下游引物各 2 μ L，p-GEM-T fesy质粒模板0. 2 μ L、DNA聚合酶0. 5 μ L，加去离子水补足体积至20 μ L，将反应混合物置于PCR仪中。PCR参数95°C 3分钟；95°C 30秒，54°C 30秒，72°C 6分钟，；35个循环， 循环结束后72°C最终延伸15分钟。反应结束后各取10 μ L PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳分析。结果如图5所示。一般Taq DNA聚合酶在上游引物末位碱基为dNTP (泳道 2)时能对模板进行完整扩增，在上游引物末位碱基为ddNTP (泳道1)时不能对模板进行扩增，说明ddNTP确实终止了核苷酸链的延伸；而Pfu高保真DNA聚合酶在上游引物末位碱基为dNTP (泳道3)与ddNTP (泳道4)时都能对模板进行完整扩增，说明Pfu高保真DNA聚合酶对于终止核苷酸链延伸的ddNTP进行了有效移除，使核苷酸链的合成得以继续。由此证明了 Pfu高保真DNA聚合酶对于ddNTP具有校正功能，能够原位清除终止核苷酸链延伸的 ddNTP从而继续延伸过程。实施例3基于磁分离与高保真聚合酶校正功能的核酸序列分析原理对p-GEM-T Easy质粒载体进行测序
将链亲和素修饰于实施例1中得到的金磁纳米颗粒上，即可进行下述测序过程 ①设计四条引物，其下游第一位碱基为已知的A、T、C、G中的一种，5’端修饰着生物素，通过链亲和素与生物素的反应将引物固定于链亲和素-金磁纳米颗粒。以Cy5标记的双脱氧核糖核苷酸单体ddATP、ddTTP、ddCTP、ddGTP分四组平行进行单碱基延伸反应，经配有Cy5滤色片的扫描仪扫描后记录得到信号值，作为后续信号处理的基准。②根据p-GEM-T Easy质粒载体的SP6位点设计测序引物为 TTCTATAGTGTCACCTAAAT，引物5’端修饰生物素以固定于链亲和素-金磁纳米颗粒，3’端末位碱基为硫化修饰的dTTP α S，将连有引物的链亲和素-金磁纳米颗粒与待测DNA序列进行杂交。
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③分四组平行进行反应，同时重复3次，加入第一步延伸反应溶液，具体实验过程如下加入 IOXBuffer 2 μ L、Mg2+ (25 mM) 2 μ L、ddNTP 及其对应的 dNTP 混合物 1. 5 μ L、连接有步骤②中测序引物的金磁纳米颗粒2 μ L,p-GEM-T fesy质粒模板0. 2 μ L.Taq DNA聚合酶0.5 μ L，加去离子水补足体积至20 μ L，将反应混合物置于PCR仪中。PCR参数95°C 3分钟；95°C 30秒，54°C 30秒，72°C 1分钟，1个循环，磁分离，以清洗缓冲溶液对金磁纳米颗粒进行三次清洗，弃上清，经配有Cy5滤色片的扫描仪扫描后记录第一轮延伸时四组反应中Cy5荧光的有无和强弱，如图6A示，在ddATP与dATP组合的反应管中检测到了 Cy5荧光信号，而其他反应管中并无信号，通过与步骤①得到的信号强度比较确定A碱基个数为1。④继续平行进行四组反应，同时重复3次，加入第二步延伸反应溶液，具体实验过程如下加入IOXBuffer 2 μ L、Mg2+ (25 mM) 2 μ L、由步骤③检测得知的dATP α S 1.5 μ L、步骤③中的金磁纳米颗粒，p-GEM-T fesy质粒模板0. 2 μ L、Pfu高保真DNA聚合酶0. 5 μ L，加去离子水补足体积至20 μ L，将反应混合物置于PCR仪中。PCR参数95°C 3分钟； 950C 30秒，54°C 30秒，72°C 3分钟，1个循环，磁分离。由此利用Pfu高保真DNA聚合酶的校正功能移除步骤③中已延伸的带有Cy5荧光标记的ddATP并延伸上对应的耐3’-5’核酸外切酶消化的dATP α S。⑤磁分离，以清洗缓冲溶液对步骤④中的金磁纳米颗粒进行三次清洗，清除步骤 ③与步骤④中经Cy5标记的ddATP ；再以扫描仪扫描后记录该次循环中剩余的Cy5荧光值作为下次循环Cy5荧光值的基数。循环上述③、④和⑤所进行的过程，直到确定p-GEM-T Easy质粒载体中的核苷酸序列信息并与已知的P-GEM-T Easy质粒载体DNA图谱进行比对。图6为经配有Cy5滤色片的扫描仪扫描后记录的前三轮延伸时四组反应中的Cy5 荧光信号。图6A为第二轮延伸时四组反应中Cy5荧光信号。图6B为第二轮延伸时四组反应中Cy5荧光信号，在ddGTP与dGTP组合的反应管中检测到了 Cy5荧光信号，而其他反应管中并无信号，通过与步骤⑤得到的信号强度比较确定G碱基个数为1。图6 C第三轮延伸时四组反应中Cy5荧光信号，在ddCTP与dCTP组合的反应管中检测到了 Cy5荧光信号，而其他反应管中并无信号，通过与步骤⑤得到的hi信号强度比较确定C碱基个数为1。
权利要求
1.一种基于磁分离与高保真聚合酶校正功能的核酸序列分析方法，其特征在于1) 将耐3’ -5’核酸外切酶消化的测序引物固定于磁性介质上，与待测DNA序列进行杂交；2) 加入成分包括不具有3’ -5’核酸外切酶活性之DNA聚合酶的第一步延伸反应溶液，延伸经过标记的脱氧核糖核苷酸单体与双脱氧核糖核苷酸单体，通过检测标记物信号得到核苷酸种类与个数信息；3)加入成分包括具有3’ -5’核酸外切酶活性之高保真DNA聚合酶的第二步延伸反应溶液，利用高保真聚合酶的校正功能移除2)中已延伸的ddNTP并替换延伸上耐3’ -5’核酸外切酶消化的核苷酸单体；4)对磁性介质进行磁分离并清洗；循环上述步骤 2),3)和4)所进行的过程，直到确定待测DNA中的核苷酸序列信息。
2.根据权利要求1所述基于磁分离与高保真聚合酶校正功能的核酸序列分析方法，其特征在于所述磁性介质为体现磁学性质的物体。
3.根据权利要求1所述基于磁分离与高保真聚合酶校正功能的核酸序列分析方法，其特征在于所述经过标记的脱氧核糖核苷酸单体与双脱氧核糖核苷酸单体为直接或间接标记着荧光分子、放射性同位素或酶的dNTP与ddNTP。
4.根据权利要求2所述基于磁分离与高保真聚合酶校正功能的核酸序列分析方法，其特征在于所述体现磁学性质的物体为具有磁学性质的物质构成的物体或以具有磁学性质的物质为部件的物体。
5.根据权利要求3所述基于磁分离与高保真聚合酶校正功能的核酸序列分析方法，其特征在于经过标记的dNTP与ddNTP，所述四种单体均标记相同的标记物，或标记不相同、不完全相同的标记物。
6.根据权利要求3所述基于磁分离与高保真聚合酶校正功能的核酸序列分析方法， 其特征在于经过标记的dNTP与ddNTP，其中ddNTP与同种类dNTP之间的分子数比例为 1:50 1:10000。
7.根据权利要求1所述基于磁分离与高保真聚合酶校正功能的核酸序列分析方法，其特征在于所述不具有3’ -5’核酸外切酶活性之DNA聚合酶为Taq DNA聚合酶、T7测序酶、 Vent" DNA聚合酶、DeepVent- DNA聚合酶或测序酶。
8.根据权利要求1所述基于磁分离与高保真聚合酶校正功能的核酸序列分析方法， 其特征在于所述具有3’-5’核酸外切酶活性的高保真DNA聚合酶为Vent DNA聚合酶、 DeepVent DNA聚合酶或Pfu DNA聚合酶。
9.根据权利要求1所述基于磁分离与高保真聚合酶校正功能的核酸序列分析方法，其特征在于所述耐3’ -5’核酸外切酶消化的核苷酸单体为硫化修饰的dNTP α S、环化修饰的 acy-NTP或锁核酸。
10.根据权利要求1所述基于磁分离与高保真聚合酶校正功能的核酸序列分析方法， 其特征在于采用线性方式依次读取完整核苷酸序列或采用阵列方式读取部分核苷酸序列后再利用序列拼接软件进行拼接。
全文摘要
一种基于磁分离与高保真聚合酶校正功能的核酸序列分析方法，1)将耐核酸外切酶消化的测序引物固定于磁性介质上，与待测DNA序列进行杂交；2)加入成分包括不具有核酸外切酶活性之DNA聚合酶的延伸反应溶液，延伸经过标记的脱氧核糖核苷酸单体与双脱氧核糖核苷酸单体，通过检测标记物信号得到核苷酸种类与个数信息；3)加入成分包括具有核酸外切酶活性之高保真DNA聚合酶的延伸反应溶液，利用高保真聚合酶的校正功能移除2)中已延伸的ddNTP并替换延伸上耐核酸外切酶消化的核苷酸单体；4)对磁性介质进行磁分离并清洗；循环上述步骤2)、3)和4)所进行的过程，直到确定待测DNA中的核苷酸序列信息。
文档编号C12Q1/68GK102191328SQ20111009798
公开日2011年9月21日 申请日期2011年4月19日 优先权日2011年4月19日
发明者何农跃, 曾新 申请人:东南大学