专利名称：一种基于egfp的t载体的制备方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，特别涉及一种T载体及其制备方法。
背景技术：
PCR是分子生物学和基因工程领域中最基本的技术之一，它是在体外获得大量目的基因或DNA片段的有效手段。PCR过程是由具有热稳定性的DNA聚合酶介导催化。当使用高保真DNA聚合酶扩增时，可得到具有平末端的PCR产物，而使用普通的Taqmk聚合酶扩增时，可得到3’末端都具有单个凸起的A的PCR产物。这是因为普通的7 冲NA聚合酶除了正常的合成功能之外，还具有不依赖于DNA模板的合成能力，能够在PCR产物的3’末端额外地添加一个脱氧核苷酸，通常为dATP，使PCR产物并不是具有平末端的双链DNA，而是两个3’末端都多了一个A的双链DNA。正是这类PCR产物所具有的凸起的A，为PCR产物的直接克隆提供了便利，即可使用T-A克隆的方法，对PCR产物不作限制性内切酶处理的情况下，就可以在DNA连接酶的作用下，直接将PCR产物连接到T载体上。在进行T-A克隆时，比较关键的是制备T载体，即在两个3’末端都具有一个凸起的T的线性化载体。T载体是处理构建好的前T载体而得到的，通常有两种策略一种是利用能产生平末端的限制性内切酶(如EcoR V,Sma I)切割前T载体，得到具有平末端的线性化载体，然后在普通Ti^DNA聚合酶的催化下，将dTTP添加到线性化载体的3’末端；另一种是利用特殊的限制性内切酶(如km I,Eaml 105 I)切割前T载体，直接产生两个3’末端都具有一个凸起的T的线性化载体。与第一种方法相比，使用第二种方法制备T载体时更加简便。在构建前T载体时，不同的开发者往往使用不同的筛选标记基因，已商品化的 T载体上的筛选标记基因主要是b-半乳糖苷酶a肽段基因(hc^r)、细胞死亡控制基因 (.ccdB)等。使用IacZ,基因作为筛选标记基因时，可以根据a_互补原理，利用蓝白斑实现阳性克隆的筛选，但需要使用hc^T缺陷型大肠杆菌菌株，还需要使用价格昂贵的X-Gal (5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)和IPTG (异丙基硫代半乳糖苷)，另外，这两种试剂的失效或在平板上涂布不勻，都可能导致显色失败，产生假阳性结果。使用基因作为筛选标记基因时，由于ccdB产物的毒性，不产生载体自连的菌落，极大地提高了 T-A克隆的效率，但在构建前T载体时需要使用特殊的菌株。增强型绿色荧光蛋白基因0 1/^)也可作为筛选标记基因，借助紫外线的激发甚至日光的照射，可以观察到绿色荧光，因此，可以直接根据绿色荧光的有无，简便地筛选到阳性克隆。但是，由于^ ) 0基因连接在诱导型强启动子(如Iac启动子、T7启动子等)下游， 在实现阳性克隆的筛选时，还需使用IPTG作为诱导剂，且绿色荧光不够强，需在紫外灯下进行筛选，而紫外线的照射可能对菌落或目的基因造成损伤，或者在37°C下进行长时间的培养，通常为16-18小时，在这样的条件下很容易产生卫星菌落。这两个因素限制了基因在T-A克隆中的应用。因此，要有效地利用EGFP基因作为筛选标记，最关键的是在EGFP 基因上游采用组成型强启动子，无需紫外线照射或长时间培养，在日光或日光灯照射下，就能够看到菌落是否具有明显的绿色荧光。大肠杆菌T/7/7基因启动子是一个组成型强启动子，Skrlj等人报道了突变的脂蛋白(Ipp)基因的启动子(Rn)，它具有更强转录活性。本发明将该突变启动子构建到Αβν基因上游，成功构建了以Αβν基因作为筛选标记的T载体， 应用该T载体进行T-A克隆时，载体自连产生的假阳性菌落在37°C培养12小时后，在日光照射下即可呈现明显的绿色荧光，极大地提高了 T-A克隆的效率。
发明内容
本发明为了克服上述现有技术中的不足，提供一种制备T载体的方法，以提高T-A 克隆的效率。本发明以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因作为筛选标记，用组成型强启动子Rn 介导EGFP基因的表达，并将能切割前T载体制备T载体的限制性内切酶(EcoR V.Xcm I等) 识别位点引入EGFP基因上游。1、一种基于增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的T载体，所述T载体的两个末端位于组成型启动子和EGFP基因之间，所述T载体应用于T-A克隆时，载体自连产生的假阳性菌落在日光下呈现绿色荧光，携有外源DNA的阳性菌落呈现白色；
2、本发明提供由前T载体pPmGl制备T载体的方法，按照下述步骤进行
(1)制备含有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因表达盒的前T载体pPmGl，所述表达盒包括组成型启动子Rn、EGFP基因，以及位于两者之间的平末端酶切位点；
(2)用相应的限制性内切酶切割所述的前T载体，利用TaqDNA聚合酶将dTTP合成到线性化前T载体pPmGl的3’末端，使之具有凸起的T尾，制备成熟的T载体；
3、本发明提供由前T载体pPmG2制备T载体的方法，按照下述步骤进行(1)制备含有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因表达盒的前T载体pPmG2，所述表达盒包括组成型启动子 Pm, EGFP基因，以及位于两者之间的两个串联的)(cm I酶切位点；
(2)用限制性内切酶km I切割所述的前T载体pPmG2，直接获得在3’末端具有凸起的T尾的成熟的T载体。本发明的优点
本发明以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因作为筛选标记基因构建T载体，应用本发明设计的T载体进行T-A克隆时，外源DNA的插入可阻断EGFP的表达，使阳性菌落呈现白色， 载体自连产生的假阳性菌落在日光下即可呈现绿色荧光，因此，可直接依据菌落的绿色荧光表型简便快速地筛选出阳性克隆。由于T-A克隆时不需要使用X-Gal和IPTG，本发明既可节约实验成本，又可避免X-Gal和IPTG失活或涂布不勻导致的假阳性。
图1 前T载体pPmGl和pPmG2的图谱。图2 根据绿色荧光/白色表型筛选阳性菌落，其中箭头所指的菌落具有绿色荧光，为假阳性菌落；其余白色菌落为阳性菌落。
图3 菌落PCR法鉴定阳性克隆，其中泳道1-22为白色菌落的PCR产物，泳道23为阳性对照，泳道M为绿色荧光菌落的PCR结果。
具体实施例方式在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。下面结合具体的实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。实施例一基于EGFP的前T载体pPmGl及T载体的制备方法
以表达载体pET-28a和克隆载体pUC18为出发载体，按如下步骤和方法实施 1、前T载体pPmGl的构建
(1)化学合成两条经5，磷酸化的DNA (序列表中SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所述DNA 序列)，高温变性后退火，形成具有Bgl Il.Xba I所对应粘性末端的双链DNA，连入经Bgl II 和)(ba I双酶切的pET48a，筛选出具有组成型强启动子的中间载体pETRii。(2)设计和合成1对引物(序列表中SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4所述DNA序列)， 在上游引物中引入BamH I和EcoR V酶切位点，在下游引物中引入Hind III酶切位点，采用PCR技术获得EGFP基因，经BamH I和Hind III进行双酶切后，与经同样的酶切割的中间载体PETRii连接，转化大肠杆菌Dffia感受态细胞，在日光下筛选出具有绿色荧光的菌落， 即获得能组成型表达EGFP的中间载体pETPmGl。(3)设计和合成1对引物(序列表中SEQ ID NO. 5和SEQ ID N0. 6所述DNA序列)， 并在引物5’末端均引入Sma I酶切位点，从中间载体pETPmGl上PCR扩增EGFP表达盒，用 Sma I切割PCR产物，与经Pvu II酶切的pUC18连接，转化大肠杆菌Dffia感受态细胞，在日光下筛选出具有绿色荧光的菌落，即获得能组成型表达EGFP的前T载体pPmGl (见图1)。2、T 载体 pPmGl-T 的制备
(I)EcoR V酶切2、mg前T载体pPmGl，反应条件依据EcoR V供应商提供的说明书， 酶切后进行琼脂糖凝胶电泳，利用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收线性化的载体。(2)在 88 mL 线性化载体中，加入 10 mL IOXPCR Buffer, 1 mL dTTP (100 mM), 1 mL Taq DNA聚合酶(5U/mL)，72°C反应2 h，利用PCR产物回收试剂盒回收加尾产物，即T 载体pPmGl-T，测定DNA浓度，将浓度调整为50 ng/mL,分装，_20°C冰箱中保存。3、T-A克隆验证
用普通的7 ^ DNA聚合酶获得750bp的PCR产物，取适量PCR产物与1 mL T载体 PPmGl-T建立连接反应，热击法转化大肠杆菌Dffia感受态细胞，涂布于含氨苄青霉素的LB 平板，37°C培养12 h。在日光灯照射下，可见白色菌落和绿色荧光菌落(见图2)，分别挑取 100个白色菌落和1个绿色荧光菌落于含氨苄青霉素的LB液体培养基，37°C振荡培养3 h， 低速离心收集时，100个白色菌落培养物中沉淀的细胞全为白色，而绿色荧光菌落培养物的沉淀细胞呈现绿色荧光。进一步利用菌落PCR法对上述细菌培养物进行鉴定，100个白色菌落中均含有插入的外源DNA片段(见图3)。实施例二 基于EGFP的前T载体pPmG2及T载体的制备方法
以表达载体pET-28a和克隆载体pUC18为出发载体，按如下步骤和方法实施 1、前T载体pPmG2的构建(1)具组成型强启动子的中间载体PETRii的构建方法与实施方式一中相应的方法相同。(2)设计和合成1对引物(序列表中SEQ ID NO. 7和SEQ ID NO. 4所述DNA序列)， 在上游引物中引入BamH I和两个串联的km I酶切位点，并保证开放阅读框正确，在下游引物中引入Hind III酶切位点，采用PCR技术获得EGFP基因，经BamH I和Hind III进行双酶切后，与经同样的酶切割的中间载体PETRii连接，转化大肠杆菌Dffia感受态细胞，在日光下筛选出具有绿色荧光的菌落，即获得能组成型表达EGFP的中间载体pETPmG2。(3)将中间载体pETPmG2的EGFP表达盒克隆到pUC18上，获得能组成型表达EGFP 的前T载体pPmG2 (见图1)的方法，与实施方式一中相应的方法相同。2、T 载体 pPmG2_T 的制备
Xcm I酶切2、mg前T载体pPmG2，反应条件依据km I供应商提供的说明书，酶切后进行琼脂糖凝胶电泳，利用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收线性化的载体，即为成熟的T载体 pPmG2-T,测定DNA浓度，将浓度调整为50 ng/mL,分装，_20°C冰箱中保存。3、T-A克隆验证
T-A克隆及阳性克隆的验证方法与实施方式一中相应的方法相同。
权利要求
1.一种基于EGFP的T载体，其特征在于其中所述T载体的两个末端位于组成型启动子和EGFP基因之间，所述T载体应用于T-A克隆时，载体自连产生的假阳性菌落在日光下呈现绿色荧光，携有外源DNA的阳性菌落呈现白色。
2.根据权利要求1所述的一种基于EGFP的T载体的制备方法，其特征在于按照下述步骤进行(1)制备含有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因表达盒的前T载体pPmGl，所述表达盒包括组成型启动子Rn、EGFP基因，以及位于两者之间的平末端酶切位点；(2)用相应的限制性内切酶切割所述的前T载体，利用TaqDNA聚合酶将dTTP合成到线性化前T载体pPmGl的3’末端，使之具有凸起的T尾，制备成熟的T载体。
3.根据权利要求1所述的一种基于EGFP的T载体的制备方法，其特征在于按照下述步骤进行(1)制备含有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因表达盒的前T载体pPmG2，所述表达盒包括组成型启动子Rik EGFP基因，以及位于两者之间的两个串联的km I酶切位点；(2)用限制性内切酶kmI切割所述的前T载体pPmG2，直接获得在3’末端具有凸起的T尾的成熟的T载体。
全文摘要
本发明公开了一种基于EGFP的T载体及制备方法，涉及基因工程领域。本发明制备的T载体，采用组成型强启动子介导增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的表达，外源DNA的插入可阻断EGFP的表达，使阳性菌落呈现白色，载体自连产生的假阳性菌落在日光下即可呈现绿色荧光。本发明设计的T载体应用于T-A克隆时，由于T-A克隆时不需要使用X-Gal和IPTG，本发明既可节约实验成本，又可避免X-Gal和IPTG失活或涂布不匀导致的假阳性。
文档编号C12N15/65GK102409061SQ201110070698
公开日2012年4月11日 申请日期2011年3月23日 优先权日2011年3月23日
发明者何华纲, 吴春笃, 朱姗颖 申请人:江苏大学