专利名称：一株东方伊萨酵母及其全细胞转化产胞二磷胆碱的方法
技术领域：
一株东方伊萨酵母及其全细胞转化产胞二磷胆碱的方法，涉及到胞二磷胆碱的制备，属于生物制药技术领域。
背景技术：
胞二磷胆碱，又名胞磷胆碱，化学名称是胆碱胞嘧啶_5’ - 二磷酸酯单纳盐，是卵磷脂生物合成的前体。补充外源性胞二磷胆碱即能激活卵磷脂的生物合成，刺激脑干网状结构的兴奋，提高苏醒阈值，恢复神经组织机能，改善脑代谢和神经传导，提高患者的意识水平。此外，胞二磷胆碱还是一种重要的核酸药物，能调节脑血管运动张力，改善大脑代谢功能。胞二磷胆碱作用的靶器官是肝脏和脑组织，临床用以治疗颅脑外伤及颅脑术后昏迷、 帕金森氏综合症、迟发性运动障碍、神经性耳聋和耳鸣、脑血管疾病以及小脑与脊髓共济失调。鉴于胞二磷胆碱的广泛应用，其制备技术成为较受关注的研究课题。胞二磷胆碱的生产方法有化学合成法、酶法和微生物转化法，早在20世纪50年代就有报道通过化学法合成胞二磷胆碱，但化学合成的胞二磷胆碱产品不适合药用，随后采用酶促的方法合成胞二磷胆碱，但成本较高。目前常用的方法是微生物转化法，但存在着转化率、产量不高的问题。微生物细胞转化制备胞二磷胆碱主要是通过ATP的再生体系和胞二磷胆碱合成酶系。ATP的再生是通过糖酵解途径(EMP)来实现，胞二磷胆碱合成酶系包括核苷酸激酶、 核苷二磷酸激酶、胆碱激酶和磷酸胆碱胞苷转移酶，ATP是胞二磷胆碱合成过程中磷酸供体。ATP的再生体系与胞二磷胆碱合成酶系偶联时，反应体系中只需存在葡萄糖、磷酸盐、 5’ -胞苷酸和磷酸胆碱即可合成胞二磷胆碱。因此，胞二磷胆碱的合成速率取决于ATP再生的速率、胞二磷胆碱合成酶系的速率以及二者偶联的速率。东方伊萨酵母α oriental is)细胞中ATP的再生量取决于EMP途径，而通过添加钾离子、镁离子和锰离子等离子可以改变代谢流向，提高ATP的再生速率，从而与胞二磷胆碱酶系速率相匹配，实现高效制备胞二磷胆碱。
发明内容
本发明的目的是使用东方伊萨酵母α oriental is)高效制备胞二磷胆碱。本发明的思路是以磷酸胆碱、5’ -胞苷酸或其前体物质为底物，以葡萄糖为能量供体，通过无机盐提高ATP再生速率，利用东方伊萨酵母(/. oriental is)透性细胞制备胞
二磷胆碱。本发明主要包括以下四个方面
(1)胞二磷胆碱的制备是以磷酸胆碱、5’ -胞苷酸为底物，以葡萄糖为能量供体，在水溶液中通过透性酵母细胞制备胞二磷胆碱。(2)上述(1)的制备方法中，所使用的酵母细胞为东方伊萨酵母(/. orimiahi)Zl，中国典型培养物保藏中心，菌种编号为CCTCC Ν0:Μ 2011272。
(3)上述(1)的制备方法中，葡萄糖为能量供体，一方面提供菌体的能量需求，另一方面为胞二磷胆碱合成酶系提供ATP，本发明中通过添加钾离子、镁离子和锰离子中的一种或组合提高ATP的再生速率。(4)上述(1)的制备方法中，使用的酵母细胞经培养离心后得到的酵母全细胞， 并在制备的水溶液中添加甲苯来提高细胞的透性，以提高胞二磷胆碱合成酶系的速率。本发明的技术方案一株东方伊萨酵母，其命名为东方伊萨酵母ijssatchenkia orimiahi)Z1，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO =M 2011272。用所述东方伊萨酵母全细胞转化产胞二磷胆碱的方法，以磷酸胆碱和5’ -胞苷酸为底物，以葡萄糖为能量供体，通过添加无机离子提高ATP再生速率，利用东方伊萨酵母 (/. oriental is) CCTCC NO :M 2011272 透性细胞制备胞二磷胆碱。胞二磷胆碱的制备是在水溶液中进行，反应温度为2(T40°C，pH为圹9，反应时间为6 24h。胞二磷胆碱制备中底物磷酸胆碱的起始反应浓度为l(Tl00ymol/mL，5’ -胞苷酸的起始反应浓度为1(Γ50 μ mol/mL ；能量供体葡萄糖的起始反应浓度为5(Γ500 μ mol/mL ； 添加的无机离子为钾离子、镁离子、锰离子的无机盐形式，可以是磷酸盐、硫酸盐等，添加离子的方式可以是一种或几种离子的组合，其中钾离子的起始反应浓度为(Γ200 μ mol/mL，镁离子的起始反应浓度为(T200ymol/mL，锰离子的起始反应浓度为(Γ50 μ mol/mL ；使用的酵母全细胞为东方伊萨酵母O· oriental is) CCTCC NO :M 2011272，通过培养离心得到的酵母全细胞，在反应中添加形式是酵母泥，起始添加浓度为20(Tl000g/L ；在反应中通过添加甲苯来改变酵母细胞的通透性，甲苯的起始反应浓度为0.广10mL/L。本发明的有益效果本发明中以葡萄糖为能量供体，一方面提供菌体的能量需求， 另一方面为胞二磷胆碱合成酶系提供ATP;通过添加钾离子、镁离子和锰离子中的一种或组合改变代谢流向，提高ATP的再生速率，从而与胞二磷胆碱酶系速率相匹配，实现高效制备胞二磷胆碱。使用的酵母细胞为经培养离心后得到酵母全细胞，并在制备的水溶液中添加甲苯来提高细胞的透性，以提高胞二磷胆碱合成酶系的速率。生物材料样品保藏东方伊萨酵母ijssatchenkia oriental is) Zl,已保藏于中国典型培养物保藏中心，地址中国武汉武汉大学，保藏日期2011年7月四日，保藏编号为 CCTCC NO :M 2011272。
图1本发明制备胞二磷胆碱主要代谢途径示意图。
具体实施例方式实施例1
东方伊萨酵母的培养，所用的酵母培养基为葡萄糖50 g/L，尿素2.0 g/L，磷酸二氢钾 1. 5 g/L,七水合硫酸镁0. 5 g/L,七水合硫酸锌4. 0 mg/L,七水合硫酸铁3. 0 mg/L,四水合硫酸锰0. 3 mg/L，无水氯化钙1. 0 mg/L,生物素0. 05 mg/L,以蒸馏水定容。东方伊萨酵母的接种量为10%，于30° C摇床培养M h，然后4500r/min离心lOmin，弃上清后得到酵母泥，
4即可用于制备胞二磷胆碱。在反应器中配制由25ymol/mL磷酸胆碱，lOymol/mL 5，-胞苷酸，200 μ mol/mL 葡萄糖，5 μ mol/mL七水合硫酸镁以及上述培养基培养离心得到的酵母泥2000g和水组成的反应液10L，氢氧化钠调节pH 6. 0，于32° C转化10h，反应结束后，测定反应液中胞二磷胆碱的产量为2. 0 g/L，转化率达到61. 9%。实施例2
在反应器中配制由25 μ mol/mL磷酸胆碱，10 μ mol/mL 5’ -胞苷酸，200 μ mol/mL葡萄糖，5 μ mol/mL七水合硫酸镁以及按照实施例1所述的培养东方伊萨酵母的方法培养离心得到的酵母泥2000g和水组成的反应液10L，氢氧化钠调节pH 6. 0，并添加0. lmL/L的甲苯，于32° C转化10h，反应结束后，测定反应液中胞二磷胆碱的产量为2. 4g/L，转化率达到 74. 2%ο实施例3
在反应器中配制由30 μ mol/mL磷酸胆碱，20 μ mol/mL 5’ -胞苷酸，300 μ mol/mL葡萄糖，5 μ mol/mL七水合硫酸镁，10 μ mol/mL磷酸二氢钾以及按照实施例1所述的培养东方伊萨酵母的方法培养离心得到的酵母泥5000g和水组成的反应液10L，氢氧化钠调节pH 5.0， 并添加0. 5mL/L的甲苯，于32° C转化10h，反应结束后，测定反应液中胞二磷胆碱的产量为 5. lg/L，转化率达到78. 9%。实施例4
在反应器中配制由50 μ mol/mL磷酸胆碱，40 μ mol/mL 5’ -胞苷酸，400 μ mol/mL葡萄糖，5 μ mol/mL七水合硫酸镁，10 μ mol/mL磷酸二氢钾以及按照实施例1所述的培养东方伊萨酵母的方法培养离心得到的酵母泥5000g和水组成的反应液10L，氢氧化钠调节pH 6.0， 并添加0. 5mL/L的甲苯，于32° C转化10h，反应结束后，测定反应液中胞二磷胆碱的产量为 9.5 g/L，转化率达到73. 4%。实施例5
在反应器中配制由50 μ mol/mL磷酸胆碱，40 μ mol/mL 5’ -胞苷酸，400 μ mol/mL葡萄糖，5 μ mol/mL七水合硫酸镁，1 μ mol/mL硫酸锰以及按照实施例1所述的培养东方伊萨酵母的方法培养离心得到的酵母泥8000g和水组成的反应液10L，氢氧化钠调节pH 8.0，并添加0. 5mL/L的甲苯，于32° C转化10h，反应结束后，测定反应液中胞二磷胆碱的产量为IOg/ L，转化率达到77. 4%。实施例6
在反应器中配制由50 μ mol/mL磷酸胆碱，40 μ mol/mL 5’ -胞苷酸，400 μ mol/mL葡萄糖，5 μ mol/mL七水合硫酸镁，10 μ mol/mL磷酸二氢钾以及按照案例1所述的培养东方伊萨酵母的方法培养离心得到的酵母泥7500g和水组成的反应液15L，氢氧化钠调节pH6. 0， 并添加lmL/L的甲苯，于32°C转化他，反应结束后，测定反应液中胞二磷胆碱的产量为 10. 6g/L，转化率达到82%。实施例7
在反应器中配制由50 μ mol/mL磷酸胆碱，40 μ mol/mL 5’ -胞苷酸，400 μ mol/mL葡萄糖，5 μ mol/mL七水合硫酸镁，10 μ mol/mL磷酸二氢钾，1 μ mol/mL硫酸锰以及按照实施例1 所述的培养东方伊萨酵母的方法培养离心得到的酵母泥5000g和水组成的反应液10L，氢氧化钠调节pH 6. 8，，并添加0. 5mL/L的甲苯，于34° C转化10h，反应结束后，测定反应液中胞二磷胆碱的产量为10. 4 g/L，转化率达到80. 4%。实施例8
在反应器中配制由5(^11101/1^磷酸胆碱，4(^11101/1^ 5’ -胞苷酸，400 μ mol/mL葡萄糖，5 μ mol/mL七水合硫酸镁，10 μ mol/mL磷酸二氢钾，1 μ mol/mL硫酸锰以及按照实施例1 所述的培养东方伊萨酵母的方法培养离心得到的酵母泥5000g和水组成的反应液10L，氢氧化钠调节PH 6.0，并添加1!^/1的甲苯，于30°(转化10h，反应结束后，测定反应液中胞二磷胆碱的产量为10. 8g/L，转化率达到83. 5%。实施例9
在反应器中配制由50 μ mol/mL磷酸胆碱，40 μ mol/mL 5’ -胞苷酸，400 μ mol/mL葡萄糖，10 μ mol/mL磷酸二氢钾，1 μ mol/mL硫酸锰以及按照实施例1所述的培养东方伊萨酵母的方法培养离心得到的酵母泥6000g和水组成的反应液12L，氢氧化钠调节pH 6. 5，并添加 5mL/L的甲苯，于32° C转化12h，反应结束后，测定反应液中胞二磷胆碱的产量为10. 6g/L， 转化率达到82%。实施例10
在反应器中配制由50 μ mol/mL磷酸胆碱，40 μ mol/mL 5’ -胞苷酸，400 μ mol/mL葡萄糖，5 μ mol/mL七水合硫酸镁，10 μ mol/mL磷酸二氢钾，1 μ mol/mL硫酸锰以及按照实施例1 所述的培养东方伊萨酵母的方法培养离心得到的酵母泥5000g和水组成的反应液10L，氢氧化钠调节PH 6.0,并添加lmL/L的甲苯，于32°C转化12h，反应结束后，测定反应液中胞二磷胆碱的产量为11. 2g/L，转化率达到86. 6%。
权利要求
1.一株东方伊萨酵母，其命名为东方伊萨酵母Os1SaicAez^ia orimi^is) Z1，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO =M 2011272。
2.用权利要求1所述东方伊萨酵母全细胞转化产胞二磷胆碱的方法，其特征在于以磷酸胆碱和5’ -胞苷酸为底物，以葡萄糖为能量供体，通过添加无机离子提高ATP再生速率， 利用东方伊萨酵母CCTCC NO =M 2011272透性细胞制备胞二磷胆碱；胞二磷胆碱的制备是在水溶液中进行的，反应温度是2(T40°C，pH4、，反应时间为6l4h ；所述的底物中，磷酸胆碱的起始浓度为l(Tl00ymol/mL，5’ -胞苷酸的起始浓度为 10 50ymol/mL ；所述的能量供体葡萄糖的起始浓度为5(Γ500 μ mol/mL ；所述添加的无机离子为钾离子、镁离子、锰离子中的一种或几种的组合；钾离子的起始反应浓度为(Γ200 μ mol/mL，镁离子的起始反应浓度为(Γ200 μ mol/mL，锰离子的起始反应浓度为0 50 μ mol/mL ；所使用的东方伊萨酵母全细胞为CCTCC NO =M 2011272通过培养离心得到的酵母全细胞，在反应中添加形式是酵母泥，起始添加浓度为20(Tl000g/L ；所述的东方伊萨酵母透性细胞是指在反应中通过添加甲苯处理改变酵母细胞的通透性，甲苯的起始反应浓度为0.广10mL/L。
全文摘要
一株东方伊萨酵母及其全细胞转化产胞二磷胆碱的方法，属于生物制药技术领域。本发明利用东方伊萨酵母(Issatchenkiaorientalis)Z1，即CCTCCNOM2011272，全细胞制备胞二磷胆碱，以磷酸胆碱和5’-胞苷酸为底物，以葡萄糖为能量供体，通过添加无机离子提高ATP再生效率；以葡萄糖为能量供体，一方面提供菌体的能量需求，另一方面为胞二磷胆碱合成酶系提供ATP；通过添加钾离子、镁离子和锰离子中的一种或组合改变代谢流向，提高ATP的再生速率，从而与胞二磷胆碱酶系速率相匹配，实现高效制备胞二磷胆碱；使用酵母全细胞，并在制备过程的水溶液中添加甲苯来提高细胞的透性，以提高胞二磷胆碱合成酶系的速率。
文档编号C12N1/16GK102286386SQ201110232740
公开日2011年12月21日 申请日期2011年8月15日 优先权日2011年8月15日
发明者丁重阳, 尤翠萍, 张梁, 石贵阳, 顾正华 申请人:江南大学