专利名称：牛iPS细胞拟胚体的制作方法
牛i PS细胞拟胚体的制作方法本发明涉及动物细胞的拟胚体制作方法，尤其涉及一种牛iPS细胞拟胚体的制作方法。胚胎干细胞(Embryonic stem cell，ES细胞)是一种来源于囊胚内细胞团的多能性干细胞群体，具有较强的再生能力和可塑性，在体外培养环境条件下，能够高效地进行外源基因导入、基因敲除或基因改造等遗传修饰操作。在一定的诱导环境条件下ES细胞能够分化形成机体所有类型的组成细胞，包括雌性的卵母细胞和雄性的精子。ES细胞向卵母细胞和精子的分化将会为转基因动物的生产、新品种培育、野生动物保护及人的生殖健康等奠定重要的基础，具有极强的应用价值和现实意义。iPS细胞(Induced pluripotent stem cell)作为一种新型的多能性干细胞，与ES 细胞在细胞形态、增殖、基因表达和畸胎瘤形成、分化能力等方面具有相似或相同的特性。 2006年日本科学家Yamanaka实验室率先利用逆转录病毒介导0ct4、Klf4、Sox2和c_Myc 四个基因在小鼠成纤维细胞表达后，成纤维细胞转变成这种与小鼠ES细胞性能相似或相同的多能性干细胞被称为iPS细胞。高产优质牛的胚胎来源稀少，牛ES细胞分离培养成功率极低，牛iPS细胞的诱导仅需要优质种牛的部分皮肤细胞，则避免了牛ES细胞分离培养需要破坏大量高产优质牛的胚胎。同时，牛iPS细胞具有强大的可塑性，能够高效地进行外源基因导入、基因敲除和基因改造等遗传修饰操作，利用基因工程修饰的牛iPS细胞诱导分化成精子或卵子，可以有效地解决目前转基因动物生产存在的目的基因表达率低、表达不稳定、转基因动物生产效率低等诸多问题。牛iPS细胞在体外向生殖细胞精子或卵子的分化过程中第一步则需要制作拟胚体，优质拟胚体的制作为牛iPS细胞在体外向生殖细胞精子或卵子的分化奠定重要基础。常规拟胚体的制作中使用胰酶-EDTA的消化液把干细胞连同饲养层细胞一起消化成单个细胞，把这些混合的细胞群体采用倒挂细胞液形成悬滴，细胞液悬滴中的混杂细胞共同形成细胞团，这样形成的拟胚体细胞团中包含较多的饲养层细胞，由于饲养层细胞混杂在拟胚体中，极大地降低了拟胚体的质量，会导致下游的分化效率降低和分化质量下降，从而严重影响多能性干细胞向生殖细胞精子或卵子及其他类型细胞的分化效率，削弱多能性干细胞的临床和生产的应用价值和意义。本发明要解决的技术问题是提供一种步骤简单，效果明显的牛iPS细胞拟胚体制作方法。为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是，一种牛iPS细胞拟胚体的制作方法，包括如下步骤(1)细胞培养和慢病毒感染
取妊娠约2. 5和4月龄牛胎儿，采用组织块培养法添加高糖DMEM培养液分别建立牛胎儿成纤维细胞系；磷酸钙介导四种限定基因融合蛋白0ct4、Sox2、c-Myc、Klf4慢病毒表达载体及其包装组分在细胞中构建成限定因子慢病毒，12-16h后更换新鲜培养液， 病毒包装4 后收集病毒液，经超滤浓缩后添加到牛胎儿成纤维细胞培养板内，细胞密度为1. 04 X IOVcm2，添加含终浓度为10 μ g/ml Polybrene高糖DMEM培养液，第1次病毒感染后第2d更换含1000U/mlLIF、4ng/ml bFGF的高糖DMEM培养液，连续感染4次，每次间隔 Mh，细胞克隆形成后，lmg/ml Dispase消化后接种到经丝裂霉素处理的12. 5d小鼠胎儿成纤维细胞饲养层上，添加含1000U/ml LIF、4ng/ml bFGF的高糖DMEM培养液进行培养；诱导形成的牛iPS细胞经免疫荧光和碱性磷酸酶染色检测验证；(2)拟胚体的制作取牛iPS细胞用PBS洗涤，加入lmg/ml Dispa e放置于培养箱消化lOmin，用手轻轻震动拍打培养皿，收集脱落的牛iPS细胞集落，离心，PBS洗涤，再离心后用去除1000U/ ml LIF,4ng/ml bFGF的高糖DMEM培养液重悬，接种细胞于低贴附的细菌培养皿培养箱中培养；(3)拟胚体的悬浮培养接种培养的第2d，从低贴附的细菌培养皿中连同拟胚体一起将细胞培养液转移至离心管中，室温静止，待细胞集落形成的拟胚体自然沉淀到离心管底后，转移拟胚体接种到新的低贴附的细菌培养皿中，补加去除1000U/ml LIF、4ng/ml bFGF的高糖DMEM培养液于
培养箱中培养；(4)拟胚体的贴壁培养拟胚体在低贴附的细菌培养皿中培养一周后，从低贴附的细菌培养皿中连同拟胚体一起将细胞培养液转移至离心管中，室温静止，待细胞集落形成的拟胚体自然沉淀到离心管底后，转移拟胚体接种到明胶包被的普通细胞培养皿中，补加去除1000U/ml LIF,4ng/ ml bFGF的高糖DMEM培养液于培养箱中培养，一周后即可用于体外三胚层分化能力检测。本发明的有益效果是本发明介绍的牛iPS细胞拟胚体制作方法步骤简单，制作的拟胚体质量优异。其制作的优质拟胚体将会为牛iPS细胞高效诱导分化及形成精子和卵子等奠定基础，同时也为使用牛皮肤来源细胞或其他类型的体细胞经iPS细胞转变成精子和卵子开辟了通道，对于利用现代生物技术加快牛的新品种培育具有着重要的意义。下面结合附图和具体实施方式
对本发明作进一步详细的说明。
图1是自然状态下牛iPS细胞在饲养层上的生长形态；图2是牛iPS细胞形成拟胚体的生长形态一、材料和方法(1)细胞培养和慢病毒感染取妊娠约2. 5和4月龄荷斯坦奶牛胎儿，采用组织块培养法添加高糖DMEM培养液分别建立牛胎儿成纤维细胞系。磷酸钙介导四种限定基因融合蛋白0Ct4、SOX2、C-MyC、Klf4 慢病毒表达载体及其包装组分在细胞中构建成限定因子慢病毒，12-16h后更换新鲜培养液，病毒包装4 后收集病毒液，经超滤浓缩后添加到牛胎儿成纤维细胞培养板内，细胞密度为1. 04 X 10Vcm2,添加含终浓度为10 μ g/ml Polybrene高糖DMEM培养液，第1次病毒感染后第2d更换含1000U/ml LIF、4ng/ml bFGF的高糖DMEM培养液，连续感染4次， 每次间隔Mh，细胞克隆形成后，lmg/ml Dispase消化后接种到经丝裂霉素处理的12. 5d小鼠胎儿成纤维细胞饲养层上，添加含1000U/ml LIF、4ng/ml bFGF的高糖DMEM培养液进行培养。(2)免疫荧光和碱性磷酸酶染色检测牛iPS细胞经多聚甲醛室温固定，Triton X-100的PBS溶液通透，BSA的PBS溶液封闭后，一抗为0ct4、NanOg、SSEA-l按1 200稀释后分别添加至细胞上孵育过夜，PBS洗涤，添加红色荧光标记的二抗按1 200稀释后室温避光共孵育，PBS洗涤，1 μ g/mL的DAPI 细胞核染色，荧光镜下观察。牛iPS细胞经多聚甲醛固定细胞，添加碱性磷酸酶染液进行染色，以胞浆着色为红棕色或咖啡色颗粒为阳性。(3)拟胚体的制作取牛iPS细胞用PBS洗涤，加入lmg/ml Dispase放置于培养箱消化lOmin，用手轻轻震动拍打培养皿，收集脱落的牛iPS细胞集落，离心，PBS洗涤，再离心后用去除1000U/ ml LIF、4ng/ml bFGF的高糖DMEM培养液重悬，接种细胞于低贴附的细菌培养皿培养箱中培养。(4)拟胚体的悬浮培养接种培养的第2d，从低贴附的细菌培养皿中连同拟胚体一起将细胞培养液转移至离心管中，室温静止，待细胞集落形成的拟胚体自然沉淀到离心管底后，转移拟胚体接种到新的低贴附的细菌培养皿中，补加去除1000U/ml LIF、4ng/ml bFGF的高糖DMEM培养液于
培养才苜中培养ο(5)拟胚体的贴壁培养拟胚体在低贴附的细菌培养皿中培养一周后，从低贴附的细菌培养皿中连同拟胚体一起将细胞培养液转移至离心管中，室温静止，待细胞集落形成的拟胚体自然沉淀到离心管底后，转移拟胚体接种到明胶包被的普通细胞培养皿中，补加去除1000U/ml LIF,4ng/ ml bFGF的高糖DMEM培养液于培养箱中培养，一周后用于体外三胚层分化能力检测。(6)拟胚体的体外分化检测牛iPS细胞体外分化拟胚体经多聚甲醛室温固定，Triton X-100的PBS溶液 MiS., BSA 白勺 PBS—^1 α -actinin (Sarcomeric)、 α —Fetoprotein (AFP)、 NeurOfilament200，一抗按1 : 200稀释后分别添加至细胞上孵育过夜，PBS洗涤，红色荧光标记的二抗按1 200稀释后室温避光共孵育，PBS洗涤，1 μ g/mL的DAPI细胞核染色， 荧光镜下观察。牛iPS细胞经多聚甲醛固定细胞，添加碱性磷酸酶染液进行染色，以胞浆着色为红棕色或咖啡色颗粒为阳性。二、结果验证(1)牛iPS细胞的形成牛胎儿成纤维细胞经过慢病毒的4次感染，慢病毒介导限定因子融合蛋白在牛胎儿成纤维细胞中稳定表达，在含LIF和bFGF的高糖DMEM培养液培养条件下，牛胎儿成纤维细胞的形态开始发生改变，少量胎儿成纤维细胞逐渐由长梭形转变成圆球形，并呈聚集状生长形成细胞集落。经Dispase消化传代的细胞集落在饲养层细胞上生长速度快，集落形态稳定(图1)。经碱性磷酸酶染液作用后，牛iPS细胞集落碱性磷酸酶染色呈强阳性，细胞集落呈棕红色或紫红色，不同的细胞集落阳性程度呈现一定的差异，部分细胞克隆呈现集落中心弱阳性和周边强阳性，其它个别细胞克隆呈现集落中心强阳性和周边弱阳性。牛 iPS细胞高水平表达干细胞标记蛋白0ct4、Nanog及SSEA-I。(2)牛iPS细胞拟胚体的形成消化后的牛iPS细胞集落在低粘附力的培养皿中，形成拟胚体，形成的拟胚体成圆球形，表面光滑(图幻。iPS细胞集落在低粘附力的细菌培养皿上接种后第ld，细胞集落呈现细胞间连接较为松散，从培养皿上消化的饲养层细胞在低粘附力的细菌培养皿上贴壁生长，在拟胚体更换新的培养皿时贴壁的饲养层细胞被去除，由牛iPS细胞形成的拟胚体伴具有高的细胞纯度。随着拟胚体培养时间的延长，拟胚体中细胞间之间连接逐步变得较为致密，拟胚体间较易出现相互粘附形成更大的拟胚体集落，拟胚体的颜色逐步由浅变深。(3)牛iPS细胞拟胚体的三胚层分化在明胶包被的普通细胞培养皿中牛iPS细胞拟胚体贴壁，贴壁的拟胚体呈现自发分化，经过免疫细胞化学检测显示，iPS细胞拟胚体能够分化成表达 α -actinin(Sarcomeric)的中胚层心肌细胞、表达α-Fetoprotein(AFP)的内胚层肝细胞、表达Neurofilament外胚层神经细胞。结果证实了通过这种简单的拟胚体制作方法，牛iPS细胞拟胚体体外能够分化成机体的三个胚层组成细胞，从而为利用牛iPS细胞拟胚体制作技术诱导形成牛生殖细胞精子和卵子奠定坚实的基础。
权利要求
1. 一种牛iPS细胞拟胚体的制作方法，包括如下步骤(1)细胞培养和慢病毒感染取妊娠约2. 5和4月龄牛胎儿，采用组织块培养法添加高糖DMEM培养液分别建立牛胎儿成纤维细胞系；磷酸钙介导四种限定基因融合蛋白0ct4、Sox2、c-Myc, Klf4慢病毒表达载体及其包装组分在细胞中构建成限定因子慢病毒，12-16h后更换新鲜培养液，病毒包装4 后收集病毒液，经超滤浓缩后添加到牛胎儿成纤维细胞培养板内，细胞密度为 1.04X IOVcm2，添加含终浓度为lOyg/ml Polybrene高糖DMEM培养液，第1次病毒感染后第2d更换含1000U/ml LIF、4ng/ml bFGF的高糖DMEM培养液，连续感染4次，每次间隔 Mh，细胞克隆形成后，lmg/ml Dispase消化后接种到经丝裂霉素处理的12. 5d小鼠胎儿成纤维细胞饲养层上，添加含1000U/ml LIF、4ng/ml bFGF的高糖DMEM培养液进行培养；诱导形成的牛iPS细胞经免疫荧光和碱性磷酸酶染色检测验证；(2)拟胚体的制作取牛iPS细胞用PBS洗涤，加入lmg/ml Dispase放置于培养箱消化lOmin，用手轻轻震动拍打培养皿，收集脱落的牛iPS细胞集落，离心，PBS洗涤，再离心后用去除1000U/ml LIF,4ng/ml bFGF的高糖DMEM培养液重悬，接种细胞于低贴附的细菌培养皿培养箱中培养；(3)拟胚体的悬浮培养接种培养的第2d，从低贴附的细菌培养皿中连同拟胚体一起将细胞培养液转移至离心管中，室温静止，待细胞集落形成的拟胚体自然沉淀到离心管底后，转移拟胚体接种到新的低贴附的细菌培养皿中，补加去除1000U/ml LIF、4ng/ml bFGF的高糖DMEM培养液于培养箱中培养；(4)拟胚体的贴壁培养拟胚体在低贴附的细菌培养皿中培养一周后，从低贴附的细菌培养皿中连同拟胚体一起将细胞培养液转移至离心管中，室温静止，待细胞集落形成的拟胚体自然沉淀到离心管底后，转移拟胚体接种到明胶包被的普通细胞培养皿中，补加去除1000U/ml LIF、4ng/ml bFGF的高糖DMEM培养液于培养箱中培养，一周后即可用于体外三胚层分化能力检测。
全文摘要
本发明公开了牛iPS细胞拟胚体的制作方法，包括牛胎儿成纤维细胞的培养、牛iPS细胞的诱导和培养及鉴定、牛iPS细胞的拟胚体制作、牛iPS细胞的拟胚体悬浮培养和牛iPS细胞的拟胚体体外分化能力检测。该制作方法形成的牛iPS细胞拟胚体避免了传统拟胚体的悬滴操作、拟胚体组成细胞纯度高、拟胚体组成细胞体外分化能力强等特点，结果显示了牛iPS细胞拟胚体的制作方法具有实用性强、易操作和推广等优点。
文档编号C12N5/10GK102358892SQ20111028647
公开日2012年2月22日 申请日期2011年9月23日 优先权日2011年9月23日
发明者丁建平, 任春环, 刘亚, 刘洪瑜, 张子军, 张运海, 方富贵, 曹鸿国, 李运生, 杨盼, 章孝荣, 蒲勇, 陶勇 申请人:安徽农业大学