专利名称：一种海蜇小分子糖肽的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种糖肽的制备方法，具体的说是一种海蜇小分子糖肽的制备方法。
背景技术：
海蜇是一种医食同源的大型食用水母，具有较高的营养价值和药用价值。海蜇低糖低脂高蛋白，所以是一种天然保健食品。现代医学研究表明海蜇具有降血压、降血脂、预防动脉粥样硬化、美容护肤等功效。由于海蜇含水量高，易自溶等特点，因此对其研究前期主要集中在毒素方面。但随着科学技术和现代仪器分析手段的不断进步，对于海蜇体内活性成分的研究越来越多，如毒素、多糖、糖胺聚糖、胶原蛋白、胶原多肽、糖蛋白等，并对他们的生物活性进行深入研究。但关于海蜇糖肽的研究未见报道。海蜇体内含糖量较低，大部分与糖蛋白结合在一起以糖蛋白的形式存在。目前，从生物体制备糖肽的方法，主要通过直接酶提取的方法，例如，专利01138079. 9草栽灵芝多糖肽及其提取方法，首先对草栽灵芝产生子实体进行清洗、干燥、破碎；然后用乙醇回流后热水提取，将提取液浓缩，乙醇沉淀即获得粗糖肽。专利8910M71. 5—种云芝糖肽(PSP)的生产方法，也是采用热水浸提和醇析的方法，获得糖肽。以上方法获得的糖肽分子量较大， 一般在1 IOXlO4Da以上，对于糖肽结构进一步研究十分不利。
发明内容
为解决现有技术提取的糖肽分子量较大，对糖肽结构的进一步研究不利的问题， 本发明提供了一种海蜇小分子糖肽的制备方法。本发明为解决上述技术问题采用的技术方案为一种海蜇小分子糖肽的制备方法，包含以下步骤
1)海蜇糖蛋白的提取用组织捣碎机将新鲜海蜇绞碎，称取组织捣碎液，按每克组织捣碎液加入細1浓度为0. 5mol/L的NaCl溶液的比例加入NaCl溶液混合均勻，在10°C的条件下置于恒温摇床内提取10h，然后取出送入离心机中，在温度为4°C、离心转速为4000r/ min的条件下离心20min，取上清液，备用；
2)将步骤1中的上清液用中空纤维素膜浓缩到原体积的1/20，在浓缩后的上清液中边搅拌边加入质量浓度为95%的乙醇，当溶液中乙醇质量浓度达75%时，停止加入乙醇，静置池，在温度为4°C、离心转速为lOOOOr/min的条件下离心15min，取沉淀物冻干即为粗糖蛋白，备用；
3)使用DEAE-52纤维素柱层析，所用层析柱规格为1.6X40cm，内填物为DEAE-52纤维素，具体步骤为
取步骤2)中制得的粗糖蛋白5g，加5ml蒸馏水溶解，过膜，上样，用浓度为lmol/LNaCl 溶液进行连续梯度洗脱，流速为0. 5ml/min，每管收集2. 5ml的收集液，用紫外检测仪监控， 当紫外图谱上的谱线恢复到基线位置超过3h，则层析结束，隔管检测糖含量，合并蛋白峰和糖峰重叠的收集液，透析，冻干，得到白色絮状初步纯化的糖蛋白，备用；4)使用凝胶柱层析法进一步分离纯化，所用层析柱规格为1.6X60cm，内填物为 Blue-Sepharose 6FF,具体步骤为
取步骤3)中得到的初步纯化的糖蛋白5g，用5ml蒸馏水溶解，过膜，上样，洗脱液为双蒸水，流速为0. 5ml/min，每管收集2. 5ml的收集液，用紫外检测仪监控，当紫外图谱上的谱线恢复到基线位置超过3h，则层析结束，然后隔管检测糖含量，合并蛋白峰和糖峰重叠的收集液，冻干，得白色絮状的糖蛋白，备用；
5)海蜇糖蛋白的酶解取步骤4)中的糖蛋白溶入蒸馏水中制成质量浓度为0.lmg/mL 的糖蛋白溶液，在糖蛋白溶液中加入复合蛋白酶进行酶解，复合蛋白酶的加入量为糖蛋白溶液质量的0. 3-0. 7%，在pH8. 0、温度65°C的条件下酶解l_2h，制得糖肽溶液，备用；
6)糖肽分级采用超滤的方法，对步骤5)获得的糖肽溶液进行分级，用3000Da进行超滤，滤液浓缩、冻干后即得到海蜇小分子糖肽。本发明所述的冻干操作为常规操作，可在任意型号的冻干机中进行。本发明所用到的复合蛋白酶为市售的常规蛋白水解酶。有益效果本发明先从新鲜海蜇原料里提取糖蛋白，然后对粗糖蛋白进行分离纯化，获得目标糖蛋白后，采用酶解技术进行酶解，最终获得分子量较小的糖肽。与传统的酶法从生物体内直接获得糖肽比较，本发明避免生成物其它组分对酶活性的影响，直接准确地作用于糖蛋白，可以充分发挥酶的活性，获得小分子的糖肽，在进行糖肽或糖蛋白结构分析时，必须用到质谱，而质谱只能检测分子量较小的物质，本发明获得的小分子量糖肽，能够进行质谱分析，因此对糖蛋白结构解析十分重要。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明做进一步的阐述。实施例1
一、海蜇糖蛋白的制备，其操作如下
1)用组织捣碎机将新鲜海蜇绞碎，称取200g组织捣碎液，加入800ml浓度为0.5mol/ L的NaCl溶液混合均勻，在10°C的条件下置于恒温摇床内提取10h，然后取出送入离心机中，在离心转速为4000r/min的条件下离心20min，取上清液，备用；
2)将步骤1中的上清液用中空纤维素膜浓缩到原体积的1/20，在浓缩后的上清液中边搅拌边加入质量浓度为95%的乙醇，当溶液中乙醇质量浓度达75%时，停止加入乙醇，静置池，在离心转速为lOOOOr/min的条件下离心15min，取沉淀物冻干即为粗糖蛋白，备用；
3)使用DEAE-52纤维素柱层析，所用层析柱规格为1.6X40cm，内填物为DEAE-52纤维素，具体步骤为
取步骤2)中制得的粗糖蛋白5g，加5ml蒸馏水溶解，过膜，上样，用浓度为lmol/LNaCl 溶液进行连续梯度洗脱，流速为0. 5ml/min，每管收集2. 5ml的收集液，用紫外检测仪监控， 当紫外图谱上的谱线恢复到基线位置超过3h，则层析结束，隔管检测糖含量，合并蛋白峰和糖峰重叠的收集液，透析，冻干，得到白色絮状初步纯化的糖蛋白，备用；
4)使用凝胶柱层析法进一步分离纯化，所用层析柱规格为1.6X60cm，内填物为 Blue-Sepharose 6FF,具体步骤为
取步骤3)中得到的初步纯化的糖蛋白5g，用5ml蒸馏水溶解，过膜，上样，洗脱液为双蒸水，流速为0. 5ml/min，每管收集2. 5ml的收集液，用紫外检测仪监控，当紫外图谱上的谱线恢复到基线位置超过3h，则层析结束，隔管检测糖含量，合并蛋白峰和糖峰重叠的收集液，冻干，得白色絮状的糖蛋白。二、海蜇小分子糖肽的制备，操作步骤如下
取经离子交换和凝胶柱层析分离纯化后的糖蛋白Ig溶入蒸馏水中制成质量浓度为 0. lmg/mL的糖蛋白溶液，在糖蛋白溶液中加入复合蛋白酶进行酶解，复合蛋白酶的加入量为糖蛋白溶液质量的0. 3%，在pH8. 0、温度65°C的条件下酶解池，得到糖肽溶液，采用超滤的方法，对获得的糖肽溶液进行分级，用3000Da进行超滤，滤液浓缩、冻干后即得到海蜇小分子糖肽，经测定得出75%的糖肽分子量小于3000Da。实施例2
一、海蜇糖蛋白的制备方法如实施例1；
二、海蜇小分子糖肽的制备，操作步骤如下取经离子交换和凝胶柱层析分离纯化后的糖蛋白Ig溶入蒸馏水中制成质量浓度为0. lmg/mL的糖蛋白溶液，在糖蛋白溶液中加入复合蛋白酶进行酶解，复合蛋白酶的加入量为糖蛋白溶液质量的0. 5%，在pH8. 0、温度65°C 的条件下酶解池，得到糖肽溶液，采用超滤的方法，对获得的糖肽溶液进行分级，用3000Da 进行超滤，滤液浓缩、冻干后即得到海蜇小分子糖肽，经测定得出90%的糖肽分子量小于 3000Dao实施例3
一、海蜇糖蛋白的制备方法如实施例1；
二、海蜇小分子糖肽的制备，操作步骤如下取经离子交换和凝胶柱层析分离纯化后的糖蛋白Ig溶入蒸馏水中制成质量浓度为0. lmg/mL的糖蛋白溶液，在糖蛋白溶液中加入复合蛋白酶进行酶解，复合蛋白酶的加入量为糖蛋白溶液质量的0. 7%，在pH8. 0、温度65°C 的条件下酶解池，得到糖肽溶液，采用超滤的方法，对获得的糖肽溶液进行分级，用3000Da 进行超滤，滤液浓缩、冻干后即得到海蜇小分子糖肽，经测定得出90%的糖肽分子量小于 3000Dao实施例4
一、海蜇糖蛋白的制备方法如实施例1；
二、海蜇小分子糖肽的制备，操作步骤如下取经离子交换和凝胶柱层析分离纯化后的糖蛋白Ig溶入蒸馏水中制成质量浓度为0. lmg/mL的糖蛋白溶液，在糖蛋白溶液中加入复合蛋白酶进行酶解，复合蛋白酶的加入量为糖蛋白溶液质量的0. 5%，在pH8. 0、温度65°C 的条件下酶解lh，得到糖肽溶液，采用超滤的方法，对获得的糖肽溶液进行分级，用3000Da 进行超滤，滤液浓缩、冻干后即得到海蜇小分子糖肽，经测定得出74%的糖肽分子量小于 3000Dao
权利要求
1. 一种海蜇小分子糖肽的制备方法，其特征在于，包含以下步骤1)海蜇糖蛋白的提取用组织捣碎机将新鲜海蜇绞碎，称取组织捣碎液，按每克组织捣碎液加入細1浓度为0. 5mol/L的NaCl溶液的比例加入NaCl溶液混合均勻，在10°C的条件下置于恒温摇床内提取10h，然后取出送入离心机中，在温度为4°C、离心转速为4000r/ min的条件下离心20min，取上清液，备用；2)将步骤1中的上清液用中空纤维素膜浓缩到原体积的1/20，在浓缩后的上清液中边搅拌边加入质量浓度为95%的乙醇，当溶液中乙醇质量浓度达75%时，停止加入乙醇，静置池，在温度为4°C、离心转速为lOOOOr/min的条件下离心15min，取沉淀物冻干即为粗糖蛋白，备用；3)使用DEAE-52纤维素柱层析，所用层析柱规格为1.6X40cm，内填物为DEAE-52纤维素，具体步骤为取步骤2)中制得的粗糖蛋白5g，加5ml蒸馏水溶解，过膜，上样，用浓度为lmol/LNaCl 溶液进行连续梯度洗脱，流速为0. 5ml/min，每管收集2. 5ml的收集液，用紫外检测仪监控， 当紫外图谱上的谱线恢复到基线位置超过3h，则层析结束，隔管检测糖含量，合并蛋白峰和糖峰重叠的收集液，透析，冻干，得到白色絮状初步纯化的糖蛋白，备用；4)使用凝胶柱层析法进一步分离纯化，所用层析柱规格为1.6X60cm，内填物为 Blue-Sepharose 6FF,具体步骤为取步骤3)中得到的初步纯化的糖蛋白5g，用5ml蒸馏水溶解，过膜，上样，洗脱液为双蒸水，流速为0. 5ml/min，每管收集2. 5ml的收集液，用紫外检测仪监控，当紫外图谱上的谱线恢复到基线位置超过3h，则层析结束，然后隔管检测糖含量，合并蛋白峰和糖峰重叠的收集液，冻干，得白色絮状的糖蛋白，备用；5)海蜇糖蛋白的酶解取步骤4)中的糖蛋白溶入蒸馏水中制成质量浓度为0.lmg/mL 的糖蛋白溶液，在糖蛋白溶液中加入复合蛋白酶进行酶解，复合蛋白酶的加入量为糖蛋白溶液质量的0. 3-0. 7%，在pH8. 0、温度65°C的条件下酶解l_2h，制得糖肽溶液，备用；6)糖肽分级采用超滤的方法，对步骤5)获得的糖肽溶液进行分级，用3000Da进行超滤，滤液浓缩、冻干后即得到海蜇小分子糖肽。
全文摘要
一种海蜇小分子糖肽的制备方法，新鲜海蜇绞碎后的组织捣碎液中加入氯化钠溶液提取，然后用中空纤维素薄膜浓缩，然后加入乙醇沉淀得到粗糖蛋白，然后用DEAE纤维素离子交换柱层析和凝胶柱层析纯化，收集洗脱液冻干得到纯化的海蜇糖蛋白，再用复合蛋白酶酶解得到糖肽溶液，糖肽溶液超滤后的滤液冻干得到海蜇小分子糖肽。与传统的酶法从生物体内直接获得糖肽比较，本发明避免生成物其它组分对酶活性的影响，直接准确地作用于糖蛋白，可以充分发挥酶的活性，获得小分子的糖肽。本发明获得的小分子量糖肽，能够进行质谱分析，因此对糖蛋白结构解析十分重要。
文档编号C12P21/06GK102517365SQ201110403338
公开日2012年6月27日 申请日期2011年12月7日 优先权日2011年12月7日
发明者任国艳, 刘志龙, 崔国庭, 康怀彬, 梁旺春, 樊金玲, 郭金英, 陈秀金 申请人:河南科技大学