专利名称：Il-21衍生物的制作方法
IL-21衍生物
本发明是申请号200480029663.0、申请日为2004年10月8日的同名申请的分案申请°发明领域
本发明涉及白介素21(IL_21)或其类似物(包括作为IL-21拮抗剂发挥作用的 IL-21变体)的衍生物的合成和纯化。
发明背景
IL-21在例如WO 00/53761中被描述成T细胞生长和NK活性的刺激物。以前没有描述过IL-21的衍生物。其作为具有改良特征的有效制药学衍生物，在许多应用中引起关注。
发明概述
本发明提供了 IL-21或其变体的衍生物。
—方面，本发明提供了包含聚合分子或亲脂性衍生物的IL-21或其变体的衍生物。
在本发明的一个方面，IL-21或其变体的衍生物所包含的聚合分子是一个或多个 PEG基团。
在本发明的一个方面，IL-21或其变体的衍生物在分子的N末端、C末端、或内部包含衍生化。
在本发明的一个方面，衍生化位于IL-21序列中天然存在的氨基酸和/或添加入或替代入的氨基酸。
本发明提供了特定变体、表达该特定变体的分离DNA、以及与聚合分子进行衍生化作用的用途。本发明还提供了 IL-21或其变体的衍生物用于制造治疗癌症或感染性疾病的药物的用途。
发明详述
本发明提供了 IL-21肽的多种衍生物，包括包含IL-21肽或其变体的经过化学修饰的肽。根据衍生用分子的特征，化学修饰可能改变分子的化学和生物学特征。修饰的后果可能是肽的生物学功能得到保持，或者肽的活性可能有所降低。例如，衍生化作用可能延长衍生化肽在体内的功能半衰期，从而补偿活性的降低。例如，可以通过将IL-21肽或其类似物与亲水性部分(moiety)偶联产生保持生物学活性的IL-21衍生物来实现IL-21衍生物的持久作用特性。衍生化作用可以提供例如半衰期延长的肽以便于持续维持治疗有效量的 IL-21或其具有相同生物学作用的衍生物。由此可以减少施用有效量的持久肽所需要的数量。衍生化可以保护分子免于酶的降解和由体内清除出去。衍生化优选是非免疫原性的。 在本发明的一个方面，可以修改肽的溶解性。
IL-21 活性的定义见 Parrish-Novak, 2000, Nature 408 :57-63 ；Brady, J.、 Hayakawa,Y.、Smyth,M. J.、禾口Nutt,S.L. ,2004,IL_21induces the functional maturation of murine NK cells, Journal of immunology (巴尔的摩，马里兰)172 :2048-2058 ；Collins, Μ. 、ffhitters, Μ. J.、禾口 Young, D. Α. ,2003, IL—21 and IL—21 receptor :a new cytokine pathway modulates innate and adaptive immunity, Immunol. Res. 28 131-140 ；Habib, Τ. 、Nelson, Α.、禾口 Kaushansky，K. ，2003， IL—21 :a novel IL-2-family lymphokine that modulates B, T, and natural killer cell responses, J. Allergy Clin.Immunol. 112 1033-1045 ；Sivakumar, P.V. ,2004, Interleukin-21 is a T-helper cytokine that regulates humoral immunity and cell—mediated anti-tumour responses, Immunology 112 177 ；Wang, G.、Tschoi, M.、Spolski, R.、Lou, Y.、Ozaki, K.、Feng, C.、Kim, G.、Leonard, W. J.、禾口 Hwu, P. , 2003, In vivo antitumor activity of interleukin 21 mediated by natural killer cells, Cancer Res. 63 :9016-9022 ；以及 Wang, G.,2003, In vivo antitumor activity of interleukin 21 mediated by natural killer cells. Cancer Res 63 :9016。认为IL-21及其衍生物可用于治疗肿瘤性疾病。肿瘤性疾病或癌应当理解为指所有形式的赘生性细胞生长，包括囊性瘤和实体瘤，骨和软组织肿瘤，包括良性和恶性两种性质的肿瘤，包括肛门组织、胆管、膀胱、血细胞、骨、骨(继发)、 肠(结肠和直肠)、脑、脑(继发)、乳房、乳房(继发)、类癌瘤、子宫颈、儿童癌、眼、食道(食管)、头和颈、卡波西肉瘤、肾、喉、(急性成淋巴细胞性)白血病、(急性髓细胞样)白血病、 (慢性淋巴细胞性)白血病、(慢性髓细胞样)白血病、(其它)白血病、肝、肝(继发)、肺、 肺(继发)、淋巴结(继发)、(何杰金氏)淋巴瘤、(非何杰金氏)淋巴瘤、黑素瘤、间皮瘤、 骨髓瘤、卵巢、胰腺、阴茎、前列腺、皮肤、软组织肉瘤、胃、睾丸、甲状腺、未知原发性肿瘤、阴道、外阴、子宫中的肿瘤。软组织肿瘤包括良性单体性许旺氏细胞瘤(Benign Schwannoma Monosomy)、硬纤维瘤、成脂细胞瘤、脂肪瘤、子宫平滑肌瘤、明细胞肉瘤、皮肤纤维肉瘤、尤因肉瘤、骨骼外粘液样软骨肉瘤、粘液样脂肪肉瘤、分化良好的脂肪肉瘤、小泡型横纹肌肉瘤、和滑膜肉瘤。具体的骨肿瘤包括非骨化性纤维瘤、单房性骨囊肿、内生软骨瘤、动脉瘤样骨囊肿、成骨细胞瘤、成软骨细胞瘤、软骨粘液纤维瘤、骨化性纤维瘤和釉质瘤、巨细胞瘤、 纤维性结构不良、尤因肉瘤、嗜曙红细胞肉芽肿、骨肉瘤、软骨瘤、软骨肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、和转移癌。白血病指由骨髓生成的白细胞的癌，包括但不限于白血病的四种主要类型急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、急性成髓细胞性白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、和慢性髓细胞样白血病(CML)。
在讨论本发明的详细实施方案之前，提供与本发明主要方面有关的具体术语的定义。
在本发明的内容中，“IL-21”定义为WO 00/53761中作为SEQ ID No :2公布的序列或该序列的不含N端序列的序列。本申请还描述了 IL-21的变体和衍生物。在本发明的内容中，术语“IL-21”由此指WO 00/53761中描述的IL-21，任选不含N端序列。本发明涵盖来自其它物种的相应蛋白质(“直向同源物(ortholog) ”)。特别感兴趣的是来自其它哺乳动物物种的IL-21多肽，包括啮齿类、猪、羊、牛、狗、猫、马、和其它灵长类。
"IL-21衍生物”包括衍生化或与另一种功能分子相连接。连接可以是与其它分子实体(诸如抗体、毒素、放射性同位素、毒害细胞的或抑制细胞的试剂、或聚合分子或亲水性基团)化学偶联、基因融合、非共价相连、诸如此类。非限制性实例包括聚合基团，诸如例如PCT/DK2004/000531中公布的树状分子(dendrimer)、聚环氧烷(PAO)、聚烷撑二醇 (PAG)、聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG)、分支PEG、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯共马来酸酐、聚苯乙烯共马来酸酐、葡聚糖、羧甲基葡聚糖；血清蛋白质结合配体，诸如与清蛋白结合的化合物，像脂肪酸，(5-(^4脂肪酸，脂肪族二酸，(例如C5-C24)。清蛋白结合物见丹麦专利申请PCT/DK04/000625。清蛋白结合物也可以是具有如下化学式的化合物
权利要求
1.IL-21衍生物或其变体，其在N-末端，C-末端包含氨基酸修饰，或者在hIL-21肽内连接有亲脂性取代基，其中所述变体与hIL-21肽具有70%以上的同一性。
2.根据权利要求1的IL-21衍生物，其中的亲脂性取代基是在其侧链带有用于衍生化的功能基团的氨基酸，其中的氨基酸选自Asp，Glu，Cys, Gin, Ser, Thr和Tyr。
3.根据权利要求2的IL-21衍生物，其中的修饰在赖氨酸残基上。
4.根据权利要求3的IL-21衍生物，其中的赖氨酸残基选自Lys22，Lys53,Lys57, Lys78, Lys89, Lysl02, Lysl03, Lysl06, Lysll3 禾口 Lysll8。
5.根据权利要求1-4中任一项的IL-21衍生物，其中亲脂性取代基在水中的溶解度为 20°C下，0. lmg/100ml-250mg/100ml 水。
6.根据权利要求1-5中任一项的IL-21衍生物，其中的亲脂性取代基包含4-40碳原子。
7.根据权利要求1-6中任一项的IL-21衍生物，其中的亲脂性取代基通过间隔物与 hIL-21肽连接。
8.根据权利要求7的IL-21衍生物，其中的间隔物选自Lys，Glu,Asp, β -丙氨酸， Y-丁酸(GABA)，Y-谷氨酸和丁二酸。
9.根据权利要求7的IL-21衍生物，其中的间隔物选自Lys，Glu和Asp，且间隔物的羧基与氨基酸残基的氨基形成酰胺键，且间隔物的氨基与亲脂性取代基的羧基形成酰胺键。
10.根据权利要求7的IL-21衍生物，其中的间隔物是包含Asp,Glu，或Lys的二肽。
11.根据权利要求1-10中任一项的IL-21衍生物，其中的亲脂性取代基是直链或者分支烧基。
12.根据权利要求1-10中任一项的IL-21衍生物，其中的亲脂性取代基是直链或分支脂肪酸的酰基。
13.根据权利要求12的IL-21衍生物，其中亲脂性取代基的酰基是CH(CH2)nCO-,其中 η是4-38的整数。
14.根据权利要求13的IL-21衍生物，其中的亲脂性取代基的酰基选自CH3(CH2)6CO-, CH3 (CH2)8CO-, CHjCH2)1(lC0-，CH3(CH2)12CO-, CH3(CH2)14CO-, CH3 ^H2) ^⑶-，CH3(CH2)wCO-, CH3 (CH2) 20CO-，和 CH3 (CH2) ^CO-。
15.根据权利要求1-10中任一项的IL-21衍生物，其中的亲脂性取代基是直链或直链烷烃α，ω-二羧酸的酰基。
16.根据权利要求15的IL-21衍生物，其中的acyl基是HOOC(CH2)mCO-,其中的m是 4-38的整数。
17.根据权利要求16的IL-21衍生物，其中的acyl基选自HOOC(CH2)14CO-, HOOC (CH2) 16C0-, HOOC (CH2) 18C0-, HOOC (CH2) 20CO-,和 HOOC (CH2) ^⑶-。
18.根据权利要求1-10中任一项的IL-21衍生物，其中的亲脂性取代基是下述式的基团CH3 (CH2)p ((CH2) qC00H) CHNH-CO (CH2) 2C0_，其中的 ρ 和 q 是整数，而且 p+q 是 8_40 的整数。
19.根据权利要求1-10中任一项的IL-21衍生物，其中的亲脂性取代基是下述式的基团=CH3(CH2)rCO-NHCH(COOH) (CH2)2C0_，其中的 r 是 10-24 的整数。
20.根据权利要求1-10中任一项的IL-21衍生物，其中的亲脂性取代基是下述式的基团CH3 (CH2) sC0-NHCH ((CH2) 2 (COOH) 2C0_，其中 s 是 8- 的整数。
21.根据权利要求1-10中任一项的IL-21衍生物，其中的亲脂性取代基是下述式的基团:C00H(CH2)tCO-,其中的t是8-24的整数。
22.根据权利要求1-10中任一项的IL-21衍生物，其中的亲脂性取代基是下述式的基团-NHCH(COOH) (CH2)4NH-CO (CH2)uCH-,其中的 u 是 8-18 的整数。
23.根据权利要求1-10中任一项的IL-21衍生物，其中的亲脂性取代基是下述式的基团-NHCH(C00H) (CH2)4NH-COCH((CH2)2COOH)NH-CO(CH2)wCH3-,其中 w 是 10-16 的整数。
24.根据权利要求1-10中任一项的IL-21衍生物，其中的亲脂性取代基是下述式的基团-NHCH(C00H) (CH2)4NH-CO(CH2)2OKCOOH)NH-CO(CH2)xCH3-,其中 χ 是 10-16 的整数。
25.根据权利要求1-10中任一项的IL-21衍生物，其中的亲脂性取代基是下述式的基团-NHCH(COOH) (CH2)4NH-CO(CH2)2OKcOOH)NH-CO(CH2)yCH3-,其中 y 是 1-22 的整数。
26.根据权利要求1-10中任一项的IL-21衍生物，其中的亲脂性取代基是N-石胆酰基。
27.根据权利要求1-10中任一项的IL-21衍生物，其中的亲脂性取代基是N-胆酰基。
28.根据权利要求1-27中任一项的IL-21衍生物，其中所述的衍生物具有高达4个亲脂性取代基。
29.根据权利要求观的IL-21衍生物，其中所述的衍生物具有3个亲脂性取代基。
30.根据权利要求四的IL-21衍生物，其中所述的衍生物具有2个亲脂性取代基。
31.根据权利要求30的IL-21衍生物，其中所述的衍生物具有1个亲脂性取代基。
32.根据权利要求1-31中任一项的IL-21衍生物在制备用于治疗癌症的药物中的用途。
33.根据权利要求1-31中任一项的IL-21衍生物在治疗癌症中的用途。
34.表达根据权利要求7的IL-21衍生物的分离的DNA。
全文摘要
本发明提供了IL-21或其变体的衍生物。
文档编号C12P21/02GK102516386SQ20111040268
公开日2012年6月27日 申请日期2004年10月8日 优先权日2003年10月10日
发明者A·沃索, B·派施克, C·B·肖德特, F·Z·多沃尔德, H·沃尔迪克 申请人:诺沃挪第克公司