专利名称：脱氧麦根酸三价铁螯合物转运蛋白及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种脱氧麦根酸三价铁螯合物转运蛋白及其编码基因与应用，特别涉及一种来源于花生的脱氧麦根酸三价铁螯合物转运蛋白及其编码基因与应用。
背景技术：
铁在植物生长发育过程中具有不可替代的作用，是植物生长发育所必需的微量元素之一。尽管铁在土壤中的含量较高，在有氧及碱性土壤中铁的溶解性却很低，在石灰性土壤上很多植物面临着缺铁胁迫。促进植物对铁的吸收转运效率从而提高作物的耐低铁胁迫能力具有重要的实践意义。在低铁环境下植物在长期进化过程中形成了机理I和机理II两种不同的适应性反应机制。双子叶和非禾本科单子叶植物属于机理I植物。此类植物在缺铁时主要的生理反应表现为根系伸长受阻，根尖部分直径增加，并产生根毛，根部形态发生变化，Fe3+还原酶的活性增加，受ATP酶控制的质子分泌增加，使根际pH降低，提高铁的有效性。而单子叶禾本科植物为机理II植物，它们在缺铁时无机理I植物的明显的根形态上的变化，而是根系中植物铁载体的合成和分泌量增加。在分子生物学水平，植物吸收利用铁的关键基因在模式植物中逐渐研究清楚。机理I植物以模式植物拟南芥研究得相对清楚，缺铁时通过根表皮细胞质膜上铁还原酶基因AtFR02将三价铁还原成二价铁，然后通过根细胞质膜上的二价铁转运蛋白AtIRTl将二价铁转运到根细胞内供植物吸收利用。机理II植物以水稻，大麦及玉米研究得相对清楚。在缺铁条件下主要通过体内合成并分泌脱氧麦根酸类植物铁载体(MAs)，禾本科植物根系分泌的脱氧麦根酸将根际中难溶性铁螯合，再通过细胞质膜上的YSl转运蛋白将脱氧麦根酸铁螯合物转运到根细胞内。YSl转运蛋白首次在玉米中分离得到，因该基因缺失后玉米叶片表现为黄色条纹(yellow stripe)表型命名而来。研究者们通过酵母功能互补试验确定了 ZmYSl基因对脱氧麦根酸铁三价螯合物(MAs-Fe(III))的转运能力。此外研究发现在大麦中HvYSl及水稻中0sYSL15也参与从根际土壤中吸收转运MAs-Fe (III)供植物吸收利用。最近的研究表明，大麦中的HvYSL2及水稻0sYSL18对MAs-Fe(III)也具有转运作用。机理I植物中也存在YSL同源基因。NA(尼克烟酰胺)为脱氧麦根酸类植物铁载体合成的前体，通常与二价金属离子结合形成稳定的复合物在植物体内转运。目前已有的研究表明机理I植物YSL基因主要负责NA与金属离子螯合物的转运。在模式植物拟南芥中存在8个YSL基因。AtYSLl对于Fe-NA向籽粒中的运输起到了很重要的作用。AtYSL2对Fe (II)-NA、Fe (II)-PS及Cu (II)-NA具有转运作用。此外，Gendre等人对于超累积植物天蓝遏蓝菜中存在的YSL同源基因进行了一些研究。他们在天蓝遏蓝菜中找到了三个YSL同源基因，根据分别与拟南芥中YSL基因的同源性高低而命名为TcYSL3、TcYSL5、TcYSL7。研究表明TcYSL7主要在植物的花中表达，TcYSL5主要在叶片中表达，而TcYSL3在各器官中表达量都比较均一。进一步通过酵母功能互补实验发现，其中只有TcYSL3对于Fe(II)-NA以及Ni (II)-NA复合物具有运输作用。尽管机理I植物自身不合成脱氧麦根酸，令人惊奇的是最近的研究表明拟南芥AtYSL3对MAs-Fe (III)及Fe (II)-NA具有转运作用。YSL基因家族无论在机理I植物及机理II植物中都具有重要的意义，该基因家族对于铁在土壤中的吸收运输及铁向地上部和籽粒中的运输都起到至关重要的作用。花生是我国重要的油料作物之一，但是在我国北方石灰性土壤上花生缺铁黄化成为限制其产量和品质的重要因子。同时花生又是迄今为止非测序植物之一，这将极大地限制从分子水平对花生铁营养的研究。运用分子生物学及基因工程手段，对花生脱氧麦根酸三价铁螯合物转运蛋白AhYSLl基因的获得与功能研究将为揭示花生吸收利用铁的分子机制起到极大的推动作用。尽管花生不合成脱氧麦根酸，这将为在特定环境下理解花生利用脱氧麦根酸铁提供重要的依据。同时运用该基因也将为从分子育种或基因工程培育耐低铁胁迫花生或其它植物品种提供重要的理论基础，具有深远的实践意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种脱氧麦根酸三价铁螯合物转运蛋白及其编码基因。本发明所提供的脱氧麦根酸三价铁螯合物转运蛋白，名称为AhYSLl，来源于豆科、落花生属、花生(A.hypogaea)品种鲁花14,是如下I)或2)的蛋白质:I)由序列表中序列2所示的·氨基酸序列组成的蛋白质；2)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加，且具有脱氧麦根酸三价铁螯合物转运活性的由I)衍生的蛋白质。序列表中的序列2由679个氨基酸残基组成，编码上述AhYSLl蛋白的基因也属于本发明的保护范围。编码所述脱氧麦根酸三价铁螯合物转运蛋白的基因为如下1)-4)中任一种:I)序列表中的序列I所示的DNA分子；2)编码序列是序列表中序列I的第319-2358位的DNA分子；3)在严格条件下与上述I)或2)所限定的DNA分子杂交的DNA分子,且该DNA分子编码AhYSLl ；4)与I)或2)或3)限定的基因序列具有90%以上同源性的DNA分子，且该DNA分子编码AhYSLl ；所述4)中的基因，与I)或2)或3)限定的基因最好有95%以上的同源性。序列表中的序列I由2660个核苷酸组成，包括5'端非编码区，一个完整的开放阅读框(ORF)和包含ployA尾巴的3'端非编码区，自5'端第319-2358碱基为该基因的编码区，编码了序列表中序列2所示的脱氧麦根酸三价铁螯合物转运蛋白。含有上述编码AhYSLl蛋白的基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。所述重组表达载体为在pDR195的多克隆位点间插入所述脱氧麦根酸三价铁螯合物转运蛋白编码基因得到的重组表达载体；在本发明的实施例中，所述多克隆位点具体为Not I 和 BamH I。所述表达盒由能够启动所述编码脱氧麦根酸三价铁螯合物转运蛋白的基因表达的启动子，所述编码脱氧麦根酸三价铁螯合物转运蛋白的基因，以及转录终止序列组成。所述重组菌为携带有所述编码脱氧麦根酸三价铁螯合物转运蛋白的基因的酵母。
所述AhYSLl蛋白，或所述编码脱氧麦根酸三价铁螯合物转运蛋白的基因，或所述重组表达载体，或所述表达盒在下述a)或b)中的应用也属于本发明的保护范围:a)提高生物对脱氧麦根酸三价铁螯合物转运；b)培育耐低铁胁迫生物；所述低铁中的铁为脱氧麦根酸三价铁螯合物。在本发明的实施例中，所述生物具体为酵母。培育具有高脱氧麦根酸三价铁螯合物性能的生物的方法也属于本发明的保护范围。所述培育具有高脱氧麦根酸三价铁螯合物转运性能的生物的方法包括如下步骤:将所述重组表达载体转化目的生物，得到脱氧麦根酸三价铁螯合物转运性能高于所述目的生物的重组生物。在本发明的实施例中，所述生物具体为酵母；所述重组表达载体具体为在PDR195的多克隆位点Not I和BamH I之间插入AhYSLl基因得到的重组表达载体。另夕卜，扩增所述AhYSLl基因的全长或任一片段的引物也属于本发明的保护范围，如核苷酸序列如下的引物对:5’ -CAAGAAGGCAAAGTTGATGGTT-3’和5’ -AATTCCTATGGCACTAGAAAGC-3’。实验证明本发明所提供的AhYSLl蛋白能够使fet3和fet4基因缺失的酵母突变体菌株DEY1435恢复对脱氧麦根酸三价铁螯合物的转运功能，这证实了 AhYSLl蛋白具有脱氧麦根酸三价铁螯合物转运的功能，进而为培育耐低铁胁迫植物品种提供了重要的理论基础。
图1为AhYSLl基因在转录水平表达受铁供应水平的影响。其中，横坐标中的字母R代表根系，NL代表新叶，O L代表老叶；数字(4、7或11)代表处理天数。纵坐标的数值为AhYSLl基因拷贝数与内参基因Ahubiquitin拷贝数的比值。图2为AhYSLl基因酵母功能互补试验结果。其中，A为DEY1453在Fe (II)-NA的SD平板上的生长情况；B为DEY1453在Fe(III)-NA的SD平板上的生长情况；C为DEY1453在Fe(III)-DMA的SD平板上的生长情况；D为DEY1453在FeCl3的SD平板上的生长情况。A、B、C、D 中第一排均为 DEY1453/pDR195，第二排均为 DEY1453/pDR195_AhYSLl ;且从左到右四列 DEY1453 的 0D600 值均分别为 1，ΚΓ1，1(Γ2，1(Γ3。图3为AhYSLl基因花生根系原位杂交定位结果。其中，A代表反义探针；B代表正义探针。
具体实施例下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。水培营养液配方如下:终浓度为0.5mM的KH2PO4、终浓度为0.75mM的K2SO4、终浓度为0.1mM的KCl、终浓度为0.65mM的MgSO4.7H20、终浓度为2mM的CaSO4.2H20、终浓度为
Iμ M的H3BO3、终浓度为I μ M的MnSO4.4Η20、终浓度为I μ M的ZnSO4.7Η20、终浓度为0.1 μ M的 CuSO4.5Η20、终浓度为 0.005 μ M 的(NH4)6Mo7O24.4Η20、终浓度为 80 μ M 的 EDTA-Fe, pH为5.8 6。缺铁处理营养液配方为上述水培营养液配方不加EDTA-Fe，其余组分与上述水培
营养液完全一致。实施例1、花生脱氧麦根酸三价铁螯合物转运蛋白及其编码基因的获得一、水培花生的培养将花生品种“鲁花14”的种子用10%双氧水消毒20-30分钟后，清洗置于饱和硫酸钙溶液中通气8小时，然后置于铺有吸水纸的托盘中，并盖好避光，于人工培养室中培养。培养室设置条件为光照14小时30°C，黑暗10小时25°C。1_2天左右花生发芽后移入石英砂中培养，待长出1-2片叶子后转入水培营养液中培养。正常培养一周后转入缺铁处理营养液中，缺铁处理一周后观察花生新叶表现脉间失绿的缺铁症状，取花生根系及叶片，迅速放入液氮中，并于_80°C冰箱保存备用。二、花生总RNA的提取将上述步骤一制备的两种花生样品(根系和叶片)分别放入已经用液氮预冷的研钵中，迅速加入液氮研磨植物样品直至成粉末状，各取出约0.1克粉末样品于1.5μ I无RNase离心管中，加入Iml的RNA提取液Trizol (Invitrogen),立即润旋震荡15秒,使核蛋白充分解离，室温静置5分钟，加入200 μ I氯仿，充分混匀，静置5分钟，放入事先已经预冷到4°C的离心机中，以12000 Xg的速度离心15分钟，取上清液入新的1.5ml的离心管中，力口Λ 500 μ I异丙醇，上下颠倒充分混匀，室温放置10分钟，然后4°C 12000 Xg离心10分钟，取出后倒掉上清液，加入Iml的75%乙醇，4°C 7500 X g离心5分钟，重复洗涤两次，取出后倒掉乙醇，并吸出所有上清液后置于超净台中室温下风干。加入适量的DEPC水和RNA酶抑制剂，得到两种样品的RNA，均放于-20°C或_80°C冰箱中贮存备用。三、AhYSLl基因全长序列的获得从NCBI 数据库中(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/)搜索花生的 EST 序列并保存，用数据库中已知的大麦HvYSl及玉米ZmYSl序列在BioEdit软件中对保存的花生EST序列文本文件进行Local Blast，这样就获得了花生中YSL基因家族EST片段序列。利用该序列设计扩增3端上游引物及通用dT17-adap引物作为下游引物(invitrogen公司)，引物分别为:AhYSLl-3’GSP:5’-CAAGAAGGCAAAGTTGATGGTT-3’(序列表中序列 I 的第 2223-2244位)dT17-adap:5’ -GACTCGAGTCGACATCGATTTTTTTTTTTTTTTTT-3’取已提好的花生根系RNA样品约2 μ g,用ReverTraAce反转录酶(Τ0Υ0Β0公司)进行反转录cDNA的合成。反转录体系为:RNA 2 μ g，5X反应缓冲液4 μ 1，dNTPs (IOmM) 2 μ 1，Oligo (dT) 12_18 (10 μ Μ) 0.5 μ I，ReverTraAce 反转录酶 I μ I，用水补足到 20 μ I 体系，42°C反应I小时，99°C 5min终止反应。然后将以上反应液稀释5倍备用。PCR 反应体系为:10 X 反应缓冲液 2 μ 1，dNTPs (2mM) 2 μ I, MgS04 (25mM) 0.8 μ I,正向引物 AhYSLl-3，GSP (0.0lmM) 0.6 μ 1，反向引物 dT17-adap (0.0lmM) 0.6 μ 1，ddH2013.7 μ 1，反转录后cDNA稀释产物2μ l，K0D-plus DNA聚合酶(Τ0Υ0Β0公司)0.4μ 1，用灭菌水补足到20 μ I体系。 PCR反应程序为:96°C预变性2min ;98°C变性10s，55°C退火30s，68°C延伸lmin，35个循环；72°C延伸lOmin。PCR反应后琼脂糖凝胶电泳，切胶回收，然后将回收得到的DNA连接到pCR -Blunt I1- TOPO 载体(Invitrogen公司)。具体连接体系为:切胶回收PCR产物2 μ 1，盐溶液0.5 μ l，pCR -Blunt I1-TOPO 载体0.5 μ 1，混匀后常温放置5-30min。冰上放置后转化到大肠杆菌。涂于含Kan (卡那霉素)的LB平板后37°C过夜培养，挑单克隆于LB液体培养基中37°C过夜摇菌，收集菌体提取质粒后进行测序，得到花生脱氧麦根酸三价铁螯合物转运蛋白基因的3’端序列。根据上述获得的花生中YSL基因家族EST片段序列设计如下引物，利用
51RACESystem for Rapid Amplification of cDNA Ends 试剂盒(Invitrogen 公司)扩增花生脱氧麦根酸三价铁螯合物转运蛋白基因的5’端序列:AhYSLl-5’ GSPl:5’ -TTAGGGTCTCCCACATT-3’ (序列 I 的第 1927-1943 位)AhYSLl-5，GSP2:5，-CACATGAACATTGCTCTGGGAGAGGTT-3’ (序列 I 的第 1830-1856位)AhYSLl-5，GSP3:5，-GATACCCTTGCTGCTCAGCTGCTAC-3，(序列 I 的第 1429-1453位) AhYSLl-5’ GSP1-2:5’ -GACTGTGAAAACAAGGTATC-3’ (序列 I 的第 1523-1542 位)AhYSLl-5，GSP3-2:5，-GCCATATAAGCCCTTCATGTTGGTTTC-3，(序列 I 的第 1270-1296位)参照5' RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends 试剂盒说明书，以上述获得的cDNA为模板，经过两轮PCR扩增，得到花生脱氧麦根酸三价铁螯合物转运蛋白基因的5’端序列。经测序拼接获得花生脱氧麦根酸三价铁螯合物转运蛋白基因的核苷酸序列(如序列表中序列I所示，将其命名为AhYSLl基因)。进一步，根据此序列设计PCR扩增花生脱氧麦根酸三价铁螯合物转运蛋白编码序列(⑶S)的引物如下=Adap-AhYSLl-F:5，-TCAAAAGAAAGAAAAAAAATATACCCCAGCCTCGAATGATGTTTTCCCCATCAAGT-3 ’(划线部分为序列I的第319-339位)Adap-AhYSLl-R:5，-ACTTGACCAAACCTCTGGCGAAGAAGTCCAAAGCTCTAGGAAGGGACAAATTTCAT-3，(划线部分为序列I的第2388-2359位)以上述步骤中反转录获得的“鲁花14”花生根系的cDNA为模板，以Adap-AhYSLl-F和Adap-AhYSLl-R为引物，进行PCR扩增，对扩增产物进行测序，得到含有花生脱氧麦根酸三价铁螯合物转运蛋白的编码序列(如序列表中序列I的第319-2358位所示)的片段。利用DNAman软件翻译AhYSLl基因序列得到其编码的氨基酸序列，如序列表中序列2所示。应用 TMHMM 跨膜区域分析软件(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)对 AhYSLl 转运蛋白序列进行分析表明该AhYS LI蛋白具有14个跨膜区域。实施例2、花生脱氧麦根酸三价铁螯合物转运蛋白AhYSLl基因表达对铁的响应一、水培花生处理水培培养花生(“鲁花” 14)，具体方法同实施例1步骤一。在正常条件下培养约一周后转入缺铁的营养液中培养(实验组)，同时设置正常供铁对照组。处理4、7、11天后分别取实验组和对照组花生的根系、新叶及老叶样品，然后提取花生根系及叶片RNAjiJ用DNaseI (Takara公司)消化去除可能污染的基因组DNA，然后进行反转录，通过相对定量Real-time PCR方法，利用Ahubiquitin基因作为内参基因，分析AhYSLl基因在加铁和缺铁处理条件下转录水平表达量。二、相对定量 Real time PCR以步骤I提取的RNA为模板，使用如下引物进行反转录PCR(具体操作同实施例1)，得到AhYSLl基因片段(序列I的第2223-2421位):QAhYSLl-F(同 AhYSLl-3， GSP):5， -CAAGAAGGCAAAGTTGATGGTT-3’QAhYSLl-R:5’ -AATTCCTATGGCACTAGAAAGC-3’ (序列 I 的第 2400-2421 位)以步骤I提取的RNA为模板，使用参照文献Luo et al.，2004中的Ubiquitin-F:AAGCCGAAGAAGATCAAGCAC, Ubiquitin-R:GGTTAGCCATGAAGGTTCCAG 引物进行反转录 PCR (具体操作同实施例1)，得到Ahubiquitin内参基因片段。琼脂糖凝胶电泳检测上述获得的AhYSLl基因片段，得到大小约为199bp的单一目的条带，检测上述获得的Ahubiquitin内参基因片段，得到大小约为145bp的单一目的条带。
利用Zero Blunt Topo PCR Cloning Kit (Invitrogen 公司)，对上述经琼脂糖凝胶电泳鉴定正确的AhYSLl基因片段和Ahubiquitin内参基因片段，分别从各自剩下的PCR产物中取I μ I,加0.5μ I的盐溶液，I μ I灭菌水,及0.5μ L的pCR -Blunt I1-TOPO 载体(Invitrogen公司)，室温连接约30分钟，然后将3 μ I连接反应液加到TopolO感受态细胞中(Invitrogen公司)按照如下步骤进行转化:冰上放置30分钟左右，然后42度水浴放置约45秒，迅速放到冰上，3分钟后加200 μ I LB液体培养基，置于37度摇床摇I小时，然后把该菌液涂到含有卡那霉素(Kanamycin)的LB平板上，37度培养箱过夜培养。约13-15小时后，可见单一的小菌落，挑单菌落于2ml的LB液体培养基中，在37度摇床摇12小时左右，提取质粒，进一步测序鉴定分析，保证所有碱基序列无误后选择该质粒待用。将上述测序表明含有AhYSLl基因片段的重组质粒，及含有Ahubiquitin内参基因片段的重组质粒均稀释成不同的浓度梯度，使分别为IO3拷贝数/ μ 1，IO4拷贝数/ μ 1，IO5拷贝数/μ 1，IO6拷贝数/ μ 1，IO7拷贝数/ μ 1，对于每种质粒，上述不同浓度各取I μ I作为模板，制作本实施例Real time PCR的标准曲线。每次Real time PCR时都要分别以上述稀释好的质粒为模板作标准曲线，以便根据标准曲线计算该基因在样品中的拷贝数。用花生的根系及叶片样品RNA反转录后的cDNA稀释5倍加2 μ I为模板，反应体系为TaKaRa SYBR Green premix (Takara公司)6.25 μ 1，ROX Reference Dye 0.25 μ 1，正向反向引物各0.2 μ mol，然后以灭菌水补足到12.5 μ I体系，应用 Applied Biosystems StepOne PlusTM Real Time PCR System进行 PCR反应。PCR反应程序为:95°C预变性2min30s ;95°C变性15s ;55°C退火30s ;72°C延伸30s，同时收集荧光；40个循环；溶解曲线95°C 15s,60°C lmin，95°C 15s。PCR后仪器将自动通过用质粒作为模板所做的标准曲线得出在不同模板条件下AhYSLl基因及Ahubiquitin内参基因的拷贝数。最后通过计算用AhYSLl基因拷贝数/内参基因Ahubiquitin的拷贝数得到AhYSLl基因在不同处理下的相对表达值。结果如图1所示。这一结果表明该花生AhYSLl基因在根系中缺铁处理11天时表达明显高于正常供铁水平。在新叶中缺铁处理11天时在缺铁处理条件下表达增强的反应更明显。而在老叶中在缺铁处理7天时表达就显著高于正常供铁，但在处理11天，加铁与正常供铁表达量没有差异。实施例3、酵母功能互补试验验证AhYSLl蛋白在酵母中对脱氧麦根酸三价铁螯合物的转运功能酵母转化主要试剂如下:10XTE:0.1M Tris, IOmM EDTA 调节 PH 至 7.5，121 度高压灭菌 20min。IOXLiAc:g卩IM醋酸锂，称取10.2g醋酸锂加适量高纯水溶解，用冰醋酸调节PH值到7.5，定容至Ij 100ml, 121度高压灭菌20min。50% PEG (聚乙二醇):50g PEG加水定容到100ml，120度高压灭菌20min。Yro培养基:20g蛋白胨、IOg酵母提取物、20g葡萄糖，加水定容到1L，调节PH为4.7。SD 平板(IL):(NH4)2S04 5g、MgS04 5 00mg、NaCl 500mg、CaCl2 500mg、KH2P048 50mg、K2HPO41 50mg>H3BO3 500 μ g>CuSO4 40 μ g>KI 100 μ g>FeCl3 200 μ g、MnS04400 μ g、Na6Mo7O24200 μ g、ZnS04 400 μ g、生物素20 μ g、泛酸2mg、叶酸2ug、肌醇10mg、烟酸400 μ g、对氨基苯酸200 μ g、维生素B6 400 μ g、核黄素200 μ g、维生素BI 400 μ g、色氨酸20mg、亮氨酸lOOmg、组氨酸20mg、葡萄糖20g、琼脂粉20g，加水定容至1L，121度高压灭菌后倒约30个平板。缺铁的SD平板(IL):与上述SD平板(IL)相比，缺少"FeCl3 200 μ g”，其余组分
完全一致。一、pDR195-AhYSLl转化酵母突变株DEY1453及鉴定在AhYSLl基因序列编码区(序列I的第319-2358位)两端设计引物，包括起始密码子与终止密码子,并在正反向引物5’端分别加上载体pDR195 (Haruhiko Inoue, TakanoriKobayashi，Tomoko Nozoye, Michiko Takahashi，Yusuke Kakei，Kazumasa Suzuki, MikioNakazono，Hiromi Nakanishi，Satoshi Mori,and Naoko K.Nishizawa.Rice OsYSL 15 isan iron-regulated iron (III)-deoxymugineic acid transporter expressed in theroots and is essential for iron uptake in early growth of the seedlings.TheJournal of Biological Chemistry.2009.284，3470—3479.)用 Not I 和 BamH I 酶切后线性载体两端约35bp序列，最后所用引物如下:Adap-AhYSLl-F:5，-TCAAAAGAAAGAAAAAAAATATACCCCAGCCTCGAATGATGTTTTCCCCATCAAGT-3，(划线部分为序列I的第319-339位)Adap-AhYSLl-R:5，-ACTTGACCAAACCTCTGGCGAAGAAGTCCAAAGCTCTAGGAAGGGACAAATTTCAT-3，(划线部分为序列I的第2388-2359位)用KOD-plus DNA聚合酶PCR扩增含线性载体两端序列的AhYSLl基因全长，PCR反应体系为 10XK0D-plus 缓冲液 2μ l，2mM dNTPs 2 μ l,25mM MgSO4 0.8μ1，正向反向引物分别 10 μ M 0.6μ 1，“鲁花”14 花生根系 cDNA 0.5μ I, KOD-plus DNA 聚合酶 0.4 μ 1，加灭菌水至 20 μ I 体系。PCR 反应程序为:94°C 2min，94°C 15s，60°C 30s，68°C 2min，30 个循环，72°C IOmin0 PCR反应后电泳检测鉴定条带大小(约2110bp)正确后备用，测序结果表明该PCR产物具有序列I的第319-2358位核苷酸。
将pDR195载体用Not I和BamH I进行酶切，双酶切体系为:pDR195载体质粒5 μ I, Buffer M I μ I, Not I和BamH I酶各0.5 μ 1，灭菌水补足到10 μ I体系。37°C酶切5小时后获得线性的PDR195载体。将6μ1酶切后的线性pDR195载体质粒与3μ1 PCR扩增后获得的含线性载体pDR195两端序列的AhYSLl基因全长的PCR产物同时转化到酵母突变体菌株DEY1453(Haruhiko Inoue, Takanori Kobayashi, Tomoko Nozoye, Michiko Takahashi,Yusuke Kakei,Kazumasa Suzuki,Mikio Nakazono, Hiromi Nakanishi,Satoshi Mori,andNaoko K.Nishizawa.Rice OsYSL 15 is an iron-regulated iron(III)-deoxymugineicacid transporter expressed in the roots and is essential for iron uptake inearly growth of the seedlings.The Journal of Biological Chemistry.2009.284,3470-3479.)(缺失高亲和力铁转运基因fet3和低亲和力铁转运基因fet4)。具体操作如下:将少量酵母突变体DEY1453菌株接种到4ml YPD培养基中，30°C摇16-18小时。向50ml新的YPD培养基中加入适量的上述菌液，调节0D600值为0.2-0.3，30°C摇3_4小时使0D600约为0.4-0.6，收集菌液，IOOOg 25°C离心5min,去上清，向沉淀中加8ml TE，混匀后IOOOg 25°C离心5min，去上清后，在沉淀的菌中加入1200 μ I灭菌水、150 μ I IOXTE及150 μ I 10 X LiAc，震荡数秒使菌株悬浮起来，得到酵母突变株菌悬浮液。取2个1.5ml离心管分别加入pDR195载体10 μ I (对照组)，6 μ I酶切后的线性pDR195载体质粒与3 μ I PCR扩增后获得的含线性载体两端的AhYSLl基因全长的PCR产物的混合物(实验组)。再分别加入80 μ I灭菌水和10 μ I已经过煮沸处理的鲑鱼精DNA，然后加入上述已处理好的酵母突变株菌悬浮液100 μ 1，震荡混匀，加480 μ I的50%PEG,60 μ I IOXTE及60 μ I 10 X LiAc后30度摇30min，再加70ul 二甲基亚砜温和混匀，42度水浴15min，冰上放置90s，短暂离心后去上清，加200 μ I灭菌双蒸水并轻轻混匀。取100 μ I涂于含铁的SD平板上。约2-3天左右长出菌落。挑单菌落，放入10 μ I灭菌水中，取2 μ I作为PCR模板， 以Adap-AhYSL 1-F，Adap-AhYSLl-R为正反向引物进行PCR反应，电泳鉴定AhYSLl是否转化到酵母中。将经鉴定表明含有AhYSLl基因的重组酵母(PCR鉴定得到21 IObp条带)命名为DEY1453/pDR195-AhYSLl ;转入pDR195空载体的重组酵母命名为 DEY1453/pDR195。二、酵母功能互补试验1、含 Fe (II)-NA，Fe(III)-NA, Fe(III)-DMA 的 SD 平板配制首先，分别配制Iml浓度为IOmM的FeSO4溶液、Iml浓度为IOmM的FeCl3溶液，Iml浓度为30mM的烟酰胺(NA)溶液，以及Iml浓度为30mM的脱氧麦根酸(DMA)溶液。其次，从上述配制好的溶液中，取30 μ I浓度为IOmM的FeSO4溶液和15 μ I浓度为30mM的烟酰胺溶液混合，配成Fe (II) -NA溶液；取30 μ I浓度为IOmM的FeCl3溶液和15 μ I浓度为30mM的烟酰胺溶液混合，配成Fe (III) -NA溶液；取30 μ I浓度为IOmM的FeCl3溶液和15 μ I浓度为30mM的脱氧麦根酸溶液混合，配成Fe (III) -DMA溶液；上述三种配制好的溶液均在常温放置4小时左右后，用0.2μπι过滤离心管13500rpm离心10分钟，取上清待用。再次,配制缺铁的SD平板液45ml,并将pH调至7.0后,平均分成三份,每份15ml,高压灭菌后，待溶液温度降至60度左右分别加入经上述步骤离心后的Fe(II)-NA溶液，Fe (III)-NA溶液及Fe (III)-DMA溶液(三种溶液各自45 μ I)，倒板冷却。2、酵母功能互补试验具体操作如下:挑单菌落到YPD培养基中，30度过夜摇菌。向20ml新的YPD培养基中加入适量上述菌液，调节0D600值为0.2，接着摇4小时左右，取Iml菌液离心30s，去上清，加Iml 10 X TE涡旋混匀，离心30s，去上清，重复2遍后加Iml灭菌水重复洗2遍，最后加300 μ I灭菌水涡旋混匀，测定0D600值，用灭菌水将0D600值稀释调节为1，然后依次稀释10倍，得到0D600值分别为1，ΙΟ—1，10_2，10_3浓度梯度的菌液，然后分别将该菌液依次点5μ I于配制好的Fe (II)-NA，Fe (III)-NA及Fe (III)-DMA的SD平板，放置30°C培养室培养3-4天左右，比较酵母的生长状况。同时，设置含FeCl3的SD平板作为Fe的对照。结果如图2所示，转入AhYSLl基因的酵母(DEY1453/pDR195_AhYSLl)在提供Fe (II)-NA及Fe (III)-NA铁的平板上都没有正常生长，与转入pDR195空载体的酵母(DEY1453/pDR195)生长情况一致；而在提供Fe(III)-DMA的SD平板上转入AhYSLl基因的酵母(DEY1453/pDR195-AhYSLl)明显比转入pDR195空载体的酵母(DEY1453/pDR195)长势好；在FeCl3 (非螯合态的三价铁)对照平板上，DEY1453/pDR195-AhYSLl酵母与DEY1453/PDR195酵母生长一致。这一结果说明该AhYSLl转运蛋白对Fe (II)-NA及Fe (III)-NA都不具有转运能力，仅对脱氧麦根酸三价铁具有转运作用。实施例4、花生脱氧麦根酸三价铁螯合物转运蛋白AhYSLl基因根系原位杂交组织定位一、原位杂交探针制备首先用KOD-plus DNA聚合酶PCR扩增得到制备探针的模板DNA。所用引物如下:AhYSLlprobe-F:5’ -TGCCATTCTTGCTCTTGCAA-3’
AhYSLlprobe-R:5’ -TGGGTGCAAGAATACAGGC-3’PCR后得到 261bp 的DNA片段。用 Zero Blunt Topo PCR Cloning Kit (Invitrogen公司)将该片段克隆到pCR -Blunt I1-TOPO 载体(Invitrogen公司)，然后进行测序，确定序列正确及插入片段的方向，选取方向不同的插入片段分别制备正义和反义探针。将得到的插入不同方向片段的载体质粒约3μ g分别用BamH I酶切后，用等体积的苯酚:氯仿:异戍醇(25: 24:1)进行抽提，13500rpm离心IOmin,取上清加等体积的氯仿:异戊醇(24: I)混匀后13500rpm离心IOmin,取上清加20 μ I浓度为3Μ的醋酸钠和500 μ I冷的无水乙醇，_20°C放置Ih后，13500rpm离心15min，倒掉上清液，用70%乙醇洗涤沉淀，离心5min后室温晾干,加13.5 μ I的DEPC水溶解。在纯化后的13.5 μ I线性载体质粒中加入DIG RNA Labeling Mix (Roche公司)2 μ I，T7 RNA聚合酶I μ I (Τ0Υ0Β0公司)，反转录缓冲液2 μ I，用DEPC水补足到20 μ I体系，37°C 放置2h。再加 2μ I DNaseI (Takara 公司)，37°C 放置 15min，然后加0.8μ I 0.5ΜEDTA (ρΗ8.0)终止反应。最后加2 μ I浓度为5Μ的LiCl和75 μ I冷的无水乙醇，_20°C放置2h，沉淀纯化探针，13500rpm离心15min，70%乙醇洗涤后，用24 μ I的DEPC水溶解正反义探针，均按4μ I每管分装，_80°C保存备用。_■、花生根系样品石腊切片制备花生水培正常培养一周后，转入缺铁营养液中，缺铁处理一周后取花生根系样品，并用刀片将根系样品切为0.5-lcm的小段，放入冰上冷却的FAA固定液(50%乙醇90ml，冰醋酸5ml，甲醛5ml)中固定，将置于冰上的含样品的FAA固定液抽真空lOmin，放气后重复抽真空2次(每次IOmin)，然后4度过夜固定。将固定后的样品用DEPC水洗两遍，然后依次换溶液50%乙醇Ih ;50%乙醇+10%叔丁醇1.5h ;50%乙醇+20%叔丁醇2h ;50%乙醇+35%叔丁醇2h ;50%乙醇+50%叔丁醇2h ;25%乙醇+75%叔丁醇2h ;25%乙醇+75%叔丁醇(含0.1%伊红Y)过夜；100%叔丁醇2h; 100%叔丁醇2h ;67%叔丁醇+33%石蜡油3h-5h ;倒出1/3叔丁醇石蜡油混合液，补充同体积60°C融化的石蜡于上层，60°C，6-12h ;倒出1/2体积叔丁醇石蜡油混合液，补充同体积60°C融化的石蜡，60°C，6-12h，并重复2遍；倒出全部液体，加入纯的融化石蜡，60°C，8h，重复2遍；最后将含有样品的石蜡在65°C烫板上迅速倒入平整光滑的四方小纸盒中，并使根系样品摆放均匀。慢慢冷却到常温使石蜡凝固。切取含有根系样品的蜡块，使一个蜡块中含有一段根系，切成四方均匀的小块，然后用切片机将小蜡块切成10 μ m连续的蜡带，再将蜡带平展到滴有DEPC水放置于45°C烫板上的玻片上，待蜡带平展开后，将玻片倾斜，倒掉玻片上的水，并用滤纸尖将蜡带下的小水珠小心吸出，然后将玻片放置于45°C烫板上36-48小时，4°C或_20°C保存备用。三、原位杂交IOX 杂交 buffer:100 μ I 浓度为 IM 的 Tris-HCl ρΗ7.5，20 μ I 浓度为 0.5Μ 的EDTA,600y I浓度为5Μ的NaCl，补充至1ml。20 X SSC 组成:17.53g NaCl，8.82g 柠檬酸钠，pH 调至 7.0，配成 IOOml。NTE:50ml 浓度为 5M 的 NaCl，5ml 浓度为 IM 的 Tris-HCl ρΗ7.5，Iml 浓度为 0.5Μ的EDTA，用水补足到500ml。将准备好的花生根系石蜡切片玻片依次放入二甲苯10min，2遍；100%乙醇2min，
2遍；95% 乙醇 Imin ；85% 乙醇 Imin ；70% 乙醇 Imin ；50% 乙醇 Imin ；30% 乙醇 Imin ；DEPC水 Imin, 2 遍；蛋白酶 K (0.5μ g/ml) 37 °C，20min ；DEPC 水 lmin, 2 遍；4 % 多聚甲醒,2min ；PBS (NaCl 8g, KCl 0.2g, Na2HPO4 1.15g, KH2PO4 0.2g 配成 1L, PH7.4)2min，2 遍；0.1M 三乙醇胺(PH8.0)，加上250 μ I乙酸酐搅拌后迅速放入玻片，IOmin ;PBS，5min，2遍；DEPC水 5min, 2 遍；30 % 乙醇 Imin ；50 % 乙醇 Imin ；70 % 乙醇 Imin ；85 % 乙醇 Imin ；95 % 乙醇Imin ;100%乙醇2min,2遍；抽真空,30_60min ;杂交(每张玻片杂交液组成:去离子甲酰胺 100 μ 1，50XDehardts 4 μ 1，IOX 杂交 buffer 20 μ 1,10mg/ml SSDNA 10 μ 1，50%硫酸葡聚糖 40μ 1，用 DEPC 水补足至Ij 200 μ l)，50°C，16h ；0.1 X SSC50°C, 30min ；0.1XSSC50°C,lh30min ；NTE 37°C，5min，2 遍；20 μ g/ml RNaseA 于 NTE 中，37°C，30min ;NTE 37°C,5min,
3遍；0.I X SSC 50 °C, Ih ；PBS 常温，5min ;1 % 封闭液(blocking reagent) (Roche 公司)Ih ;抗地高辛抗体(Roche公司)I μ I加到500 μ I浓度为I %的blocking reagent中稀释，然后滴加到玻片上，放置2h;PBS10min，3遍；缓冲液(0.1M Tris-HCl pH7.5,0.15MNaCl) 10min，3 遍；加显色缓冲液(0.1M Tris-HCl pH9.5,0.1M NaCl,50mM MgCl2)放置5min ;将20 μ L的NBT/BCIP (Roche公司)稀释到980 μ I显色缓冲液中，滴加到玻片上进行显色，8-16h后PBS洗玻片，5min, 3遍，然后用显微镜观察根系组织切片染色。如图3所示，相对于对照(正义探针)，AhYSLl基因反义探针染色信号明显在花生根系表皮细胞，表明AhYSLl基因定位在花生根系表皮。
权利要求
1.蛋白质，为下述I)或2): 1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质； 2)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添力口，且具有脱氧麦根酸三价铁螯合物转运活性的由I)衍生的蛋白质。
2.编码权利要求1所述蛋白的基因。
3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于:所述基因为如下1)-4)中任一种: 1)序列表中的序列I所示的DNA分子； 2)编码序列是序列表中序列I的第319-2358位的DNA分子； 3)在严格条件下与上述I)或2)所限定的DNA分子杂交的DNA分子,且该DNA分子编码权利要求1所述蛋白； 4)与I)或2)或3)限定的基因序列具有90%以上同源性的DNA分子，且该DNA分子编码权利要求1所述蛋白； 所述4)中的基因，与I)或2)或3)限定的基因最好有95%以上的同源性。
4.含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
5.根据权利要求4所述的重组表达载体或重组菌，其特征在于:所述重组表达载体为在PDR195的多克隆位点间插入权利要求2或3所述基因得到的重组表达载体；所述重组菌为携带有权利要求2或3所述基因的酵母。
6.权利要求1所述的蛋白，或权利要求2或3所述的基因，或权利要求4所述的重组表达载体或表达盒在在下述a)或b)中的应用: a)提高生物对脱氧麦根酸三价铁螯合物转运； b)培育耐低铁胁迫生物；所述低铁中的铁为脱氧麦根酸三价铁螯合物。
7.培育具有高脱氧麦根酸三价铁螯合物转运性能的生物的方法，所述方法包括如下步骤:将权利要求4或5所述的重组表达载体转化目的生物，得到脱氧麦根酸三价铁螯合物转运性能高于所述目的生物的重组生物。
8.根据权利要求6所述的应用或权利要求7所述的方法，其特征在于:所述生物为酵母。
9.扩增权利要求2或3所述基因的全长或任一片段的引物。
全文摘要
本发明公开了一种脱氧麦根酸三价铁螯合物转运蛋白及其编码基因与应用。本发明所提供的蛋白为下述1)或2)1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加，且具有脱氧麦根酸三价铁螯合物转运活性的由1)衍生的蛋白质。实验证明本发明所提供的AhYSL1蛋白能够使fet3和fet4基因缺失的酵母突变体菌株DEY1435恢复对脱氧麦根酸三价铁螯合物的转运功能，这证实了AhYSL1蛋白具有脱氧麦根酸三价铁螯合物转运的功能，进而为培育耐低铁胁迫植物品种提供了重要的理论基础。
文档编号C12N15/11GK103159837SQ201110409999
公开日2013年6月19日 申请日期2011年12月9日 优先权日2011年12月9日
发明者左元梅, 熊宏春, 笕雄介, 西泽直子, 张福锁 申请人:中国农业大学