专利名称：一种基于双酶偶联高通量检测微生物生产乙醇和c3-c6正烷醇的新方法
—种基于双酶偶联高通量检测微生物生产乙醇和C3-C6正烷醇的新方法技术领域
本发明属于工业微生物筛选和开发利用领域，特别涉及一种基于双酶偶联反应的高通量检查微生物生产乙醇和C3-C6正烷醇的检测方法。技术背景
过去的200多年，建立在煤炭、石油、天然气等化石燃料基础的能源体系极大地推动了人类社会的发展。然而近年来，由于石油、天然气、煤炭等能源的过量开采与消耗，世界已面临严重的能源危机，而且国际原油价格攀升不下，对石油需求量日益大增，自1993年我国首次成为石油产品净进口国以来，2010年全年原油进口 21，845万吨，所以寻找清洁、廉价、可再生的替代能源成为未来能源战略的关键。燃料乙醇和燃料丁醇被认为是可以代替石油、煤炭等化石燃料
作为替代高污染化石燃料的理想选择，生物燃料早已受到世界各国重视。近年来，美国、巴西、韩国、印尼等国家以及欧盟都相继出台了支持生物燃料普及的能源发展战略。欧盟计划到2020年用生物燃料替代20%化石燃料。美国的《国家生物燃料行动计划》也提出，2020年生物燃料将占其能源总消费量的25%，2050年达到50%。燃料乙醇、燃料丁醇是由生物资源经过一系列的物理、生物、化学变化过程而获得的可再生燃料，具有热值高、性能好、使用便捷等优点。丙醇、戊醇和己醇均是良好的化工原料，广泛应用于涂料、印刷油墨、日化用品、医药和农药中间体的生产以及合成饲料添加剂和香料等。实现生物燃料生产的核心是获得性能优良的微生物菌种。
在微生物代谢过程中，乙醇作为产物被释放到培养基中，为了验证微生物的产乙醇能力，需要测定培养基中的乙醇含量。目前乙醇测定的常用方法主要包括比重法、比色法、气相色谱法和液相色谱法。比重法操作简便，可用于高含量乙醇测定，但对乙醇测定特异性，但是微生物代谢过程中，产生的乙醇含量很难达到比重法检测的最低限；比色法，如重铬酸钾比色法和碘量法，显色缓慢且不稳定，受多种因素干扰，操作较为繁琐；色谱法能检测微量乙醇，精密度和准确性很高，但仪器昂贵、操作和维护繁琐。另外，还有红外光谱、荧光和激光拉曼光谱等乙醇分析方法的报道，但仍处于实验室研究阶段。另外利用醇脱氢酶可以检测乙醇含量，但是醇脱氢酶需要依赖于NDA+，但是NDA+相当昂贵，且需要在340nm出测定吸光值，因此就需要紫外检测器，增加了检测的费用。因此，寻求简便、快速、准确和应用广泛的乙醇分析方法倍 受重视。
目前产乙醇菌株的筛选方法比较单一，有报道，根据TTC(2，3，5_氯化三苯基四氮唑)的显色反应进行筛选。TTC是一种显色剂,氧化还原色素,溶于水中成为无色溶液,但还原后即生成红色而不溶于水的三苯基甲臢(TPF)，TPF比较稳定，不会被空气中的氧自动氧化。TTC能够被微生物代谢过程中的脱氢酶氧化，发生显色反应，但是TTC只能说明菌株具有脱氢酶或脱氢酶活性的高低，不能说明是否能够产生乙醇。
另外，乙醇和C3-C6正烷醇均可用液相色谱和气象色谱法检测，但是这两种检测方法样品的前处理过于麻烦，且仪器价格比较昂贵，操作繁琐，由此可见目前的筛选方法和乙醇及C3-C6正烷醇检测方法都不适用于高通量筛选产各种醇的菌株，寻求一种简便、快速、准确的方法检测各种正烷醇，对于高通量筛选合适菌株生产乙醇和高级正烷醇具有重要意义。发明内容
本发明的目的
本发明的目的在于提供一种基于双酶偶联反应的高通量检测微生物生产乙醇和C3-C6正烷醇的新方法。通过醇氧化酶和过氧化氢酶偶联的方法测定乙醇和C3-C6正烷醇，高通量筛选目标微生物。与传统微生物筛选方法相比，基于双酶偶联反应的高通量筛选方法成本低、效率高、目的性更强，能够从广泛的自然界中筛选性能优良的菌株。
本发明的思路
利用醇氧化酶和过氧化氢酶偶联的方法，测定乙醇和C3-C6正烷醇含量。在氧气存在条件下，醇被醇氧化酶氧化，形成醛和过氧化氢，形成的过氧化氢与4-安替比林和苯酚在过氧化氢酶作用下形成一种红色物质醌亚胺。醌亚胺是一种红色物质，在500nm处有特征吸收值。微生物代谢产生乙醇和其他C3-C6的有机醇，通过96孔酶标板和微孔读板器，利用双酶偶联方法分析检测代谢产物，筛选高产各种醇的菌株，为基础研究提供宝贵的菌种资源。
本发明的技术路线
本发明的技术路线如下:
(I)利用培养基将筛选样品进行富集培养48h ；
(2)将富集培养的混合菌利用无菌水进行稀释(获得单菌落)，涂布到固体培养基，培养48h ；
(3)将固体培养基上长出的单菌落转接到含有液体培养基的96深孔培养板中，每个孔接种一个单菌落，用硅胶盖盖好，培养48h ；
(4)将96深孔培养板利用冷冻离心机进行离心，使菌体沉淀；
(5)取96深孔培养板中的上清液与醇氧化酶和过氧化氢酶在96孔酶标板中反应，30°C保温 30min ；
(6)将反 应结束的96孔酶标板利用微孔读板器测定在500nm处的吸光值，并将测定的吸光值与利用醇氧化酶和过氧化氢酶测定醇的标准曲线进行对比，查到醇的浓度；
(7)将测定产乙醇或高级正烷醇浓度高的生产菌株进行保存。
本发明的优点
本发明的优点是:
(I)效率高，醇氧化酶和过氧化氢酶偶联能够快速检测乙醇或高级正烷醇的含量。
(2)通量高，96深孔培养板和96孔酶标板并结合微孔读板器一起使用，使得目的菌株的筛选范围更广。
(3)成本低，能够以较低成本获得大量菌种。
(4)可以获得更多菌株，为基础研究提供菌种资源。
具体实施
以下为列举的实施例，以便于更好地理解本发明。
实施例1
利用醇氧化酶和过氧化氢酶偶联的方法测定乙醇的标准曲线。Buffer I (200 μ L)中各物质含量为:苯酚:6mmol/ml, EDTA:75mg/L,磷酸盐缓冲液:pH = 7.5,0.lmol/L。BufferII(IOOyL)中各物质含量为:醇氧化酶:3000u/L，过氧化氢酶:600u/L，4-安替比林:3.5m mol/L，磷酸盐缓冲液0.lmol/L pH = 7.5。配制标准乙醇浓度分别为0,0.1,0.5，1.0,1.5,2.0,2.5g/L0步骤:在96孔酶标板中先加入Buffer I溶液200 μ L，再加入不同浓度的乙醇10 μ L,最后加上BufferII溶液100 μ L,所用过程均在冰上进行,混匀之后用封膜封好，30°C保温30min，在500nm下，测定吸光值，建立0D500nm吸光值与乙醇浓度的标准曲线，R2 = 0.999 (附图1)，说明乙醇浓度与500nm处的吸收值呈显著线性关系。
实施例2
称取温泉土样10g，利用培养基在60°C，200rpm条件下进行富集培养24h ;将富集培养的菌群稀释105、106、107倍，涂布到固体培养基上，601:静止培养2411。将每孔体积为3mL的96深孔培养板加入ImL的培养基，并将单菌落接种到其中，60°C静止培养24h。利用Eppendorf冷冻离心机将96深孔培养板在4000rpm, 4°C条件下离心30min。
在96孔酶标板中先加入Buffer I溶液200 μ L，再加入上清液10 μ L，最后加上Buffer II溶液100 μ L，所用过程均在冰上进行，混匀之后用封膜封好，30°C保温30min，在500nm下，测定吸光值。根据乙醇标准曲线计算96株菌乙醇产量，得到一株乙醇产量最高的菌株。
实施例3
将上述筛选得到的菌株接种到培养基中，在200rpm，6(TC条件下进行培养24h ;取IOmL培养基，IOOOOrpm离心5min,分别利用醇氧化酶和过氧化氢酶偶联的方法以及高效液相法测定乙醇浓度，得到浓度分别为2.32g/L和2.39g/L，两个数据基本吻合，在误差范围内，说明双酶偶联的方 法测定乙醇可靠。
实施例4
取纯正丙醇配制成浓度分别为0.8,1.6,3.2,4.8,6.4,8.0g/Lo在96孔酶标板中先Buffer I溶液200 μ L，再加入不同浓度的正丙醇10 μ L，最后加上BufferII溶液100 μ L，所用过程均在冰上进行，混匀之后用封膜封好，30°C保温30min，在500nm下测定吸光值，建立0D500nm吸光值与正丙醇浓度的标准曲线(附图2)，R2 = 0.999，说明在一定范围内，正丙醇浓度与500nm处的吸收值呈显著线性关系。
实施例5
取纯正丁醇配制成浓度分别为0，1.6,3.2,4.8,6.4,8.lg/L。在96孔酶标板中先Buffer I溶液200 μ L，再加入不同浓度的正丁醇10 μ L，最后加上BufferII溶液100 μ L，所用过程均在冰上进行，混匀之后用封膜封好，30°C保温30min，在500nm下测定吸光值，建立0D500nm吸光值与正丁醇浓度的标准曲线(附图3)，R2 = 0.998，说明在一定范围内，正丁醇浓度与500nm处的吸收值呈显著线性关系。
实施例6
取纯正戊醇配制成浓度分别为40.0,48.5，65.0,70.0,81.0g/L。在96孔酶标板中先Buffer I溶液200 μ L，再加入不同浓度的正戊醇10 μ L，最后加上BufferII溶液100 μ L，所用过程均在冰上进行，混匀之后用封膜封好，30°C保温30min，在500nm下测定吸光值，建立0D500nm吸光值与正戊醇浓度的标准曲线(附图4)，R2 = 0.981，说明在一定范围内，正戊醇浓度与500nm处的吸收值呈显著线性关系。
实施例7
取纯正己醇配制成浓度分别为40.0,48.5，65.0,70.0,81.0g/L。在96孔酶标板中先Buffer I溶液200 μ L，再加入不同浓度的正己醇10 μ L，最后加上Buffer II溶液100 μ L，所用过程均在冰上进行，混匀之后用封膜封好，30°C保温30min，在500nm下测定吸光值，建立0D500nm吸光值与正己醇浓度的标准曲线(附图5)，R2 = 0.984，说明在一定范围内，正己醇浓度与500mn处的吸收值呈线性关系。
附图1:乙醇浓度与双酶偶联反应产物在500nm处吸光值建立的标准曲线。
附图2:正丙醇浓度与双酶偶联反应产物在500nm处吸光值建立的标准曲线。
附图3:正丁醇浓度与双酶偶联反应产物在500nm处吸光值建立的标准曲线。
附图4:正戊醇浓度与双酶偶联反应产物在500nm处吸光值建立的标准曲线。
附图5:正己醇浓度与双酶偶联 反应产物在500nm处吸光值建立的标准曲线
权利要求
1.一种利用醇氧化酶和过氧化酶偶联反应的检测微生物生产乙醇和C3-C6正烷醇的高通量检测新方法，步骤如下: (1)将培养基富集菌群经稀释后涂布到固体培养基中，待单菌落长出后接种到96深孔培养板中培养； (2)将96深孔培养板利用冷冻离心机在合适的条件下离心，取其上清液进行测定； (3)利用双酶偶联的方法，在96孔酶标板中结合BufferI和Buffer II测定上述上清液中醇含量。
2.按权利要求1中所述的方法，其特征是:所述的96深孔培养板是体积为3mL，但是每孔中加入0.5-2.5mL的培养基。
3.按权利要求1中所述的方法，其特征是:所述的冷冻离心机是能够直接离心96深孔培养板。
4.按权利要求1中所述的方法，其特征是:所述的离心条件为4°C，4000rpm离心10_60min。
5.按权利要求1中所述的方法，其特征是:所述的上清液中不能含有菌体。
6.按权利要求1中所述的方法，其特征是:所述的双酶是醇氧化酶和过氧化氢酶。
7.按权利要求1中所述的方法，其特征是:所述的BufferI中各物质含量为:苯酚:l-10mmol/ml, EDTA:25_150mg/L，磷酸盐缓冲液:pH7.5,0.05-0.5mol/L。
8.按权利要求1中所述的方法，其特征是:所述的BufferII中各物质含量为:醇氧化酶:500-6000U/L，过氧化氢酶:100-1000U/L，4-安替比林:l-5mmol/L，磷酸盐缓冲液0.05-0.5mol/L, pH = 7.5。
9.按权利要求1中所述的方法，其特征是:所述的96孔酶标板需要放置冰上，待Buffer I和Buffer II及样品加入到其中后在30°C下反应5_60min。
10. 按权利要求1中所述的方法，其特征是:所述的测定波长为500nm。
全文摘要
本发明涉及一种基于双酶偶联反应的高通量检测微生物生产乙醇和C3-C6正烷醇的新方法，具体涉及利用醇氧化酶和过氧化氢酶偶联，在相应缓冲溶液中与乙醇或C3-C6正烷醇的反应，产生红色物质醌亚胺。双酶偶联反应在96孔酶标板中进行，利用微孔读板器读取在500nm处的吸光值。乙醇和C3-C6正烷醇与双酶偶联反应生成产物在500nm处的吸光值与其浓度成线性关系，能够根据标准曲线计算浓度，并利用微孔读板器和96孔酶标板进行高通量检测。
文档编号C12Q1/30GK103146803SQ20111043291
公开日2013年6月12日 申请日期2011年12月7日 优先权日2011年12月7日
发明者王钦宏, 齐显尼, 涂然, 孙琳, 姜丹 申请人:天津工业生物技术研究所