专利名称：尖孢镰刀菌的分子检测方法及其引物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于检测尖孢镰刀菌的引物，以及利用所述引物检测尖孢镰刀菌的分子检测方法。
背景技术：
尖孢镰刀菌(/^sari oxysporum))是一种重要的植物病原真菌，可以引起很多重要农作物的维管束萎蔫病害，根据对不同寄主植物的致病性差异可将尖孢镰刀菌分为不同的专化型(Smith S N. An Overview of Ecological and Habitat Aspects in the Genus Fusarium with Special Emphasis on the Soil-Borne Pathogenic Forms. Plant Pathology Bulletin, 2007，16(3) 97-120)，有些专化型内还可进一步分为不同的小种，目前已报道的尖孢镰刀菌专化型和小种有120多个(Armstrong G. Formae speciales and races of Fusari umoxysp ο rum causing wilt diseases. Fusarium diseases， biology，and taxonomy, 1981 )。尖孢镰刀菌在土壤中营兼性寄生，腐生能力强，在土壤和植株残株上均可长期生存(Notz Rj Maurhofer Mj Dubach H，Haas Dj Defago G. Fusaric acid-producing strains of Fusarium oxysporum alter 2, 4-diacetylphloroglucinol biosynthetic gene expression in Pseudomonas fluorescens CHAO in vitro and in the rhizosphere of wheat. Applied and Environmental Microbiology, 2002，68(5) 22 )，且在寄主的整个生育期均可侵染(Zhrng Z G，Zhang J Y，Wang Y C，Zheng X B. Molecular detection of Fusarium oxysporumf. sp. niveum and Mycosphaerella melonis in infected plant tissues and soil. FEMS microbiology letters, 2005， 249(1) 39-47)。病害症状一旦显现，对农业生产造成巨大危害，并且病害流行速度快， 造成的经济损失非常严重。目前没有杀菌剂可以安全、有效而又经济地控制这种病害(Lin Y H, Chang J Y, Liu E T, Chao C P, Huang J W, Chang PFL. Development of a molecular marker for specific detection of Fusarium oxysporum f. sp. cubense race A. European Journal of Plant Pathology, 2009, 123(3) 353—365)。因此，亟需一种能够在发病初期或土壤中进行早期快速检测的技术，以便及时采用有针对性的有效防治措施来控制病害的发生和传播。尖孢镰刀菌的传统检测方法耗时长、灵敏度低、易受人为及环境等诸多因素的干扰(Daniells Jj Davis Dj Peterson Rj Pegg K. Goldfinger not as resistant to sigatoka/yellow si gat oka as first thought. Infomusa, 1995， 4(1) 6)，不會邑在病害潜伏期和初发期作出诊断，很难对病害发生进行及时的监测和有效控制，所以传统的检测方法逐步被分子检测技术所取代。^iang等(Zhang Z G, Zhang J Y, Wang Y C, Zheng X B. Molecular detection of Fusarium oxysporumf. sp. niveum and Mycosphaerella melonis in infected plant tissues and soil. FEMS microbiology letters, 2005, 249(1) 39_47)根据 ITS 序列设计引物 Fn-l/i^n-2 对/^ oxysporum f. sp. niveum 进行特异性检测；Fernandez 等(Fernandez D, Ouinten Μ, Tantaoui A, Geiger JP, Daboussi M J, Langin T. Fot 1 insertions in the Fusarium oxysporum f. sp. albedinis genome provide diagnostic PCR targets for detection of the date palm联 · Applied and Environmental Microbiology, 1998, 64(2) 633)*艮据
Fot 1 transposon 序列，设计了对/^ oxysporum f. sp. a^et/iflis 检测的特异性引物 BI03-F0A1/TL3-F0A^ ;Chen等(陈微，文景芝，李永刚.应用巢式PCR检测黄瓜尖镰孢菌、Fusarium oxysporum f. sp. cucumbrum).东北农业大学学报,2007, 38(003) 335-338)根据ITS序列采用PCR-RFLP和nested PCR在黄瓜接种发病早期可检测出黄瓜枯萎病菌。病原菌的鉴定研究多以ITS序列、RAPD分析等为基础开展。然而部分真菌由于种间rDNA-ITS序列相似性较高，仅以ITS区做为靶序列，不能有效地进行检测。 Martinez-Culebras 报道由于 C fragariae 和 C. Ioeosporioides 在 ITS 序列上同源性很高，无法利用ITS序列来设计C /ra识riae的特异性引物；张竞宇等在对TWhiia indica 的检测中发现，T. indica和T. walkeri的ITS序列只相差1个碱基，无法通过ITS序列设计特异性引物将两者分开；Liang等通过对小麦矮腥黑穗病菌iT. controversa)及其近似种小麦网腥黑穗病菌(7 caries),小麦光腥黑穗病菌(7 /beiiife)的rDNA-ITS序列比较发现，仅凭rDNA-ITS区难以区分这3种病原菌；Tang等(Tang J H, Wang W, Wang Y C. Molecular Detection of Colletotrichum orbiculare [J]. Scientia Agricultura Sinica, 2006, 10)通过对 C orbiculare 琳 C.腫的 rDNA -ITS 区序列的比对发现，两者在序列上仅相差7个碱基，不能利用特异引物将两者分开。所以，在对某些病原菌的分子检测和鉴定中，如果仅根据ITS序列做为靶目标设计引物，有可能无法将其与同属中的其它种分开。另外，RAPD存在稳定性和重复性差、共迁移等问题，在病原菌检测中受到一定限制。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种尖孢镰刀菌的分子检测方法及其引物，利用该引物及检测方法检测尖孢镰刀菌，速度快、准确、灵敏度高、稳定可靠。本发明提供的技术方案是一种用于检测尖孢镰刀菌的引物，其上游引物序列如 SEQ ID No. 1所述，下游引物序列如SEQ ID No. 2所述。
一种检测尖孢镰刀菌的试剂盒，该试剂盒包含上述的引物。—种利用上述引物检测尖孢镰刀菌的方法，其过程是提取待测样品的DNA作为模板，利用所述的引物进行PCR反应，取PCR反应扩增产物进行检测，如果存在分子量约为 699bp的DNA条带，则证明所检样品中含有尖孢镰刀菌。所述检测尖孢镰刀菌的方法，所述PCR反应的扩增体系为10.0 μ L SYBR Premix Ex Taq (2X) ,0. 4 μ L ROX Reference Dye II (50X)，引物(10 μ mol/L)各 0· 4 μ L, 模板2 μ L，用灭菌水补足体积至20 μ L。所述检测尖孢镰刀菌的方法，所述PCR反应的反应程序为95° C预变性30 s ； 95° C 变性 5 s, 65° C 退火 34 s，40 个循环；95° C 15 s，60° C 1 min，95° C 15 s, 60° C 15 s。进一步地，为提高检测尖孢镰刀菌的灵敏度，本发明还提供另一种用于检测尖孢
4镰刀菌的引物，包括两对引物，即第一对引物其上游引物核苷酸序列如SEQ ID No. 1所述， 下游引物核苷酸序列如SEQ ID No. 2所述，第二对引物其上游引物核苷酸序列如SEQ ID No. 3所述，下游引物核苷酸序列如SEQ ID No. 4所述。本发明还提供另一种检测尖孢镰刀菌的试剂盒，其包含上述的第一对引物和和第二对引物。本发明还提供另一种检测尖孢镰刀菌的方法，其过程是提取待测样品的DNA作为模板，利用所述的两对引物进行套式PCR反应，第一轮PCR反应的模板为提取待测样品的 DNA，引物为所述的第二对引物，第二轮PCR反应的模板为第一轮PCR反应产物，引物为所述的第一对引物，取第二轮PCR反应扩增产物进行凝胶电泳，如果存在分子量约为699bp的 DNA条带，则证明所检样品中含有尖孢镰刀菌。本发明具有以下有益效果
核糖体转录间隔区(ITS)作为病原菌分子检测最常用的靶序列，但是部分真菌种间 rDNA-ITS序列相似性较高，仅根据ITS序列做为靶目标设计引物，有可能无法将其与同属中的其它种分开，不能有效地进行检测。CYP51C基因编码留醇14α -去甲基化酶，是生物甾醇合成过程中关键酶。其中CYP51C序列具有在真菌种间高度变异和种内稳定的特性，相比常规检测靶标ITS、β-tubulin序列更合适作为生物系统发育指标，是病原菌分子检测的新的理想靶序列。本发明分析比较了尖孢镰刀菌(代o^F^or腫)与其它病原真菌的CYP51C 序列，设计出对尖孢镰刀菌基因组DNA有高度特异性的一对引物，结合PCR技术，建立了一套快速、高灵敏度、稳定可靠的检测尖孢镰刀菌的分子检测技术。该检测方法可以在病害侵染初期鉴定出病原物，为枯萎病的防治提供参考。更重要的是，基于新的靶序列CYP51C建立的检测体系为其它病原菌检测新靶标的应用提供了技术指导和理论依据，也为病原菌的分子检测研究奠定了方法基础。
图1比较分析CYP51C序列设计特异性引物C1/C2 ；
图2引物C1/C2特异性验证M 2 kb DNA marker ；泳道1_45 各菌株基因组DNA 的PCR扩增产物；泳道46 阴性对照；
图3引物对基因组DNA灵敏度验证，其中M : 2 kb DNA marker ；泳道1_10 模板浓度分别为 100 ng, 10 ng, 1 ng, 100 pg, 10 pg, 1 pg, 100 fg, 10 fg, 1 fg 和 100 ag基因组DNA的PCR扩增产物；泳道11 阳性对照；泳道12 阴性对照；
图4引物对分生孢子灵敏度验证，其中M : 2 1Λ DNA marker泳道1_7 模板分别为 106，105, 104, 103, 102, 101, 100个小分生孢子基因组DNA ；泳道8 阳性对照； 泳道9:阴性；
图5发病组织中尖孢镰刀菌的检测，其中M 2 1Λ DNA marker ；泳道1 阳性对照；泳道2-5 以发病植株粗提DNA为模板的PCR扩增产物；泳道6 健康植株对照。图6荧光定量分析标准曲线。
具体实施例方式下面通过具体实施方式
的详细描述来进一步阐明本发明，但并不是对本发明的限制，仅仅作示例说明。实施例1 设计、合成引物并建立尖孢镰刀菌检测试盒的PCR反应体系一、引物设计与合成
特异性引C1/C2的设计对GeneBank中的F. oxysporum和其它病原真菌的CYP51C序列进行比较分析(图1)，设计了一对特异性引物C1/C2，序列如下 Cl :5，-AAGAAGTCGAAGAATACATCGCT-3，(SEQ ID NO. 1)
C2 :5，- CGAGGAGTGTATGAGACGGC -3，(SEQ ID NO. 2)。设计的引物重新在 GeneBank 中BLAST分析验证其特异性。同时还设计一对套式PCR外引物C3/C4 根据尖孢镰刀菌的CYP51C序列，使此引物在特异性引物外侧，设计一对外引物C3/C4，序列如下
C3 :5，-GATTCATGGATCAGAAGAGGGCAAG-3，( SEQ ID NO. 13) C4 5' -GTAGATATGGGCTGCTCACAGACTT -3，(SEQ ID N0. 4)。二、建立常规PCR反应体系
PCR反应的混合液总体积为 25 yL，包括IOXPCRbuffer 2.5 μ L5MgCl2 2 mmol/L, 2. 5 mmol/L dNTP 0. 5 μ L，引物 QO μ mol/L) 0. 25 μ L, Taq DNA酶(5U/ μ L ) 0. 25 μ L ，相应浓度的模板DNA，用灭菌水补足体积。所有试剂均购于TaKaRa公司。在TaKaRaPCR扩增仪上进行扩增反应，反应程序为94° C预变性5 min;94° C变性30 s，65° C退火30 s，72° C延伸1 min，共；35个循环；72° C延伸lOmin。取5 μ L扩增产物于1. 0%琼脂糖凝胶中电泳(电压5 V/cm)，在凝胶成像系统上检测并拍照，如果存在分子量约为699bp的 DNA条带，则证明所检样品中含有尖孢镰刀菌。所有试剂均购于TaKaRa公司。三、建立套式PCR反应体系
为提高检测灵敏度，进一步建立了套式PCR反应体系。以C3/C4为第一轮反应引物，反应体系和反应程序同上述PCR常规体系。取1 yL第一轮PCR反应产物为模板进行第二轮PCR扩增，反应体系和反应程序同上述PCR常规体。所有试剂均购于TaKaRa公司。取 5 μ L扩增产物于1. 0%琼脂糖凝胶中电泳(电压5 V/cm)，在凝胶成像系统上检测并拍照， 如果存在分子量约为699bp的DNA条带，则证明所检样品中含有尖孢镰刀菌。四、荧光定量PCR反应
为了对田间土壤样品病原菌进行定量检测，本发明进一步建立了实时定量PCR检测体系。反应混合液总体积为 20 μ L :10. 0 μ L SYBR Premix Ex Taq (2X) ,0. 4 μ L ROX Reference Dye II (50X)，引物(10 μ mol/L)各 0· 4 yL，模板 2 yL，用灭菌水补足体积。优化后的反应程序为95° C预变性30 s ； 95° C变性5 s，65° C退火34 s，40个循环；95° C 15 s, 60° C 1 min，95° C 15 s，60° C 15 s。荧光定量 PCR 仪器为 7500 Real-Time PCR System。实施例2 制备DNA模板
提取各类样品的DNA作为PCR反应的模板，具体过程如下 1.菌丝体的收集及DNA提取
将供试疫霉菌菌株转至V8固体培养基平板，其它菌株转至PDA平板上，25° C黑暗培养3 d后从菌落边缘切取10块2 mmX2 mm菌落块，疫霉菌菌株转至番茄汁液体培养基，其它转至PDB中，25° C振荡培养7天，过滤收集菌丝，经冷冻抽干研磨成菌丝粉，-20° C保
存备用。取少量菌丝粉置于1. 5 mL的Eppendorf管中，加900 μ L 2% CTAB提取液，90 μ L 10% SDS，漩涡混勻，于60° C水浴1 h，期间每10 min上下颠倒几次。12,000 g离心10 min，取上清，加等体积酚/氯仿/异戊醇05 24 :1)，颠倒混勻，12，000 g离心10 min, 将上清液移至新管，加等体积氯仿，轻轻颠倒混勻，12，000 g离心5 min。上清转移至新管中，加2倍体积的无水乙醇和1/10体积的3 mol/L NaAc (pH 5. 2)，-20° C沉淀(>1 h)。 12,000 g离心10 min,倾去上清，沉淀用70%乙醇洗涤两次，室温晾干。加适量灭菌超纯水或TE (pH 8.0)溶解沉淀(含20 yg/mL RNaSe)，37° C处理1 h，利用紫外分光光度计测量OD26tl值，-20° C保存备用。2.分生孢子的收集及其DNA提取
用10 mL灭菌水反复冲洗接种代o^F^or腫黑暗培养10 d的平板表面的分生孢子 (该条件下F. oxysporum仅产生小型分生孢子)，孢子通过4层纱布过滤，除去菌丝，用血球计数板测分生孢子浓度。取100 μ L孢子悬浮液置于Eppendorf管中，冷冻抽干后按从提取菌丝体中提取基因组DNA的方法提取，将其浓度定为IO6个孢子/ μ L DNA,并按10倍稀释到1个孢子/ μ L，分别以1 μ L各浓度的DNA为模板进行PCR扩增。3. 土壤中病原菌DNA的提取
将8Χ IO7个孢子与1 g灭菌土混勻，然后将土壤样品冷冻抽干M h， 用液氮研磨成粉末状，分装到1.5 mL的Eppendorf管中。用FastDNA
1 SPIN KIT for Soil (MPBio，土壤基因组DNA提取试剂盒)提取土壤基因组DNA，将终产
物以80 μ L灭菌水溶解，即DNA浓度为IO6个孢子/ μ L，按10倍稀释到1个孢子/ μ L，分别以1 μ L各浓度的DNA为模板进行PCR扩增。4.发病组织中病原菌DNA的提取
取一段新发病的植株组织，每毫克组织加入10 μ L 0.5 mol/L NaOH，在研钵中充分研磨后转移至1. 5 mL的Eppendorf管中，12，000 g离心5 min，取5 μ L上清液加入495 μ L 0.1 mmol /L Tris (pH 8.0)，混勻后取1 μ L直接用于PCR反应。为确定植株中无 PCR抑制物存在，用本方法提取健康植株组织DNA作为空白对照。下面用上述实施例1检测引物及方法和实施例2制备的模板进行尖孢镰刀菌的检测。实施例3 检测引物的特异性和灵敏度一、特异性检测
采用本发明所设计的特异性引物C1/C2对所有供试菌株基因组DNA进行PCR扩增， 仅能从代oxysporum菌株中特异性地扩增出一条699 bp左右的条带，而其它供试菌株及空白对照均无扩增条带(图2)。结果表明，所设计的引物具有种的特异性，能够区别代 oxysporum与其它病原真菌。表1 本实施例中用于筛选引物特异性的菌株
权利要求
1.一种用于检测尖孢镰刀菌的引物，其特征在于其上游引物序列如SEQ ID No. 1所述，下游引物序列如SEQ ID No. 2所述。
2.一种检测尖孢镰刀菌的试剂盒，其特征在于该试剂盒包含权利要求1所述的引物。
3.一种尖孢镰刀菌的分子检测方法，其特征在于提取待测样品的DNA作为模板，利用权利要求1所述的引物进行PCR反应，取PCR反应扩增产物进行检测，如果存在分子量约为699 bp的DNA条带，则证明所检样品中含有尖孢镰刀菌。
4.根据权利要求3所述的分子检测方法，其特征在于所述PCR反应的扩增体系为 10. 0 μ L SYBR Premix Ex Taq (2X) ,0. 4 μ L ROX Reference Dye II (50X)，引物(10 μ mol/L)各0. 4 μ L，模板2 μ L，用灭菌水补足体积到20 μ L。
5.根据权利要求4所述的分子检测方法，其特征在于所述PCR反应的反应程序为 95° C 预变性 30 s; 95° C 变性 5 s，65° C 退火；34 s，40 个循环；95° C 15 s，60° C 1 min,95° C 15 s,60° C 15 s。
6.一种用于检测尖孢镰刀菌的引物，其特征在于包括两对引物，第一对引物其上游引物核苷酸序列如SEQ ID No. 1所述，下游引物核苷酸序列如SEQ ID No.2所述，第二对引物其上游引物核苷酸序列如SEQ ID No. 3所述，下游引物核苷酸序列如SEQ ID No. 4所述。
7.—种检测尖孢镰刀菌的试剂盒，其特征在于该试剂盒包含权利要求4所述的引物。
8.一种利用权利要求6所述的引物检测尖孢镰刀菌的方法，其特征在于提取待测样品的DNA作为模板，利用权利要求6所述的引物进行套式PCR反应，第一轮PCR反应的模板为提取待测样品的DNA，引物为所述的第二对引物，第二轮PCR反应的模板为第一轮PCR反应产物，引物为所述的第一对引物，取第二轮PCR反应扩增产物进行凝胶电泳，如果存在分子量约为699 bp的DNA条带，则证明所检样品中含有尖孢镰刀菌。
全文摘要
本发明公开了一种尖孢镰刀菌的分子检测方法及其引物，建立了一套快速、高灵敏度、稳定可靠的检测尖孢镰刀菌的分子检测技术。该检测方法可以在病害侵染初期鉴定出病原物，为枯萎病的防治提供参考。更重要的是，基于新的靶序列CYP51C建立的检测体系为其它病原菌检测新靶标的应用提供了技术指导和理论依据，也为病原菌的分子检测研究奠定了方法基础。
文档编号C12R1/77GK102433387SQ201110444010
公开日2012年5月2日 申请日期2011年12月27日 优先权日2011年12月27日
发明者张正光, 张海峰, 王健生, 王源超, 郑小波 申请人:南京农业大学