专利名称：一种富集分离内源转录因子及其复合物的方法及其专用转录因子串联结合序列的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域中目的蛋白的富集分离方法，特别是涉及一种富集分离内源转录因子及其复合物的方法及其专用转录因子串联结合序列。
背景技术：
人类基因组中约6%的基因编码转录因子，是人类基因组编码的第二大类蛋白。转录因子不仅在基因表达调控中扮演重要的角色，而且是细胞内信号转导网络的关键节点， 细胞感受胞内、胞外刺激的各种信号通路通过转录因子相互交联，从而形成一个复杂的信号网络。因此，对转录因子及其复合物的研究一直受到极大的关注。然而，转录因子在细胞内的表达丰度极低(仅占细胞总蛋白的0.01-0. 001% )，使得对转录因子及其形成的复合物的纯化及鉴定非常困难，如通过传统色谱方法进行转录因子的纯化通常需要抽提成百升细胞培养物，通过10，000-100，000倍的富集得到的蛋白也仅够用于化学和功能的分析。采用特异性抗体进行亲和纯化是分离纯化转录因子复合物的有效手段，然而，一方面抗体成本太高，另一方面，目前仅少量的转录因子及其调节分子存在抗体，这大大限制了抗体亲和纯化方法的应用。迄今为止，仅有不到5%的转录因子得以纯化和鉴定，因此，迫切需要发展新的技术方法对转录因子及其复合物进行分离纯化、鉴定、重构，以及对其各个组分进行功能解析。在基因表达调控过程中，转录因子通过与DNA顺式元件结合发挥基因表达调控的作用。转录因子包括通用转录因子(如转录因子II (TF II)复合物的各个组分、TATA-结合蛋白等)和特异转录因子(如Spl、C/EBP、APl等)。在基因转录过程中，特异转录因子与启动子结合，招募通用转录因子结合到转录起始位点上游或下游40-60bp的DNA序列上， 起始RNA的合成。近年来，越来越多的研究发现，DNA结合元件的结构特点会影响转录起始复合物的形成。换言之，当转录因子识别特定靶基因时，转录因子结合位点的核酸组成会影响辅调节子的招募，从而决定转录因子以激活子或抑制子影响靶基因的表达。为此，发展分离鉴定内源转录因子及其复合物的方法为解析与DNA结合后的转录因子复合物，进而了解特异转录因子对靶基因的转录调控至关重要。转录因子的表达水平往往很低，用传统方法在蛋白质组水平上分析转录因子表达谱通常很困难。分析转录因子表达谱或其动态变化时，在样品制备过程中，需要采用特定的试剂(如抗体)及免疫沉淀策略对转录因子进行富集分离，但是由于抗体的成本比较高，同时抗体的种类有限，采用抗体进行免疫沉淀来富集分离转录因子的应用受到很大的限制， 而且这种策略也仅能对个别转录因子进行分析，难以实现对所有转录因子的大规模富集分离和鉴定。
发明内容
本发明提供了一种富集分离内源转录因子及其复合物的方法及其专用转录因子串联结合序列。本发明所提供的转录因子串联结合序列(concatenated transcription factorresponse elements，catTFRE)，是由 3_5bp 的接头序列(Linker)串联的转录因子 API、AR、BRCAl、CEBPA、CREBl、E2F1、ELKl、ELK4、ESRU ETSU EffSRl-FLIU FEV、FOXAl、 FOXCU FOXDU F0XF2、FOXIU FOXLU F0X03、Fra-U GATA2、GATA3、GR、HIF1A: :ARNT、HLF, HNF1B、HNF4A、H0XA5、INSMU IRFU IRF2、JunB, JunD, MAX、MEF2A、MIZF, MYC: :MAX、Myf、 MZF11-4、MZF15-13、NF-kappaB、NFATC2、NFE2L2、NFIC、NFIL3、NFKB1、NFYA、NHLH1、NKX3-1、 NR1H2::RXRA,NR2F1、NR3C1、NR4A2、Pax6、PBXl、PDXl、PLAGl、PPARG, PR、PXR-I:RXR-alpha、 RAR-alpha、RAR-alpha: RXR-gam、RAR-beta: RXR-alpha、REL> RELA> REST、RFX1、RFX2、RFX3、 RFX5:RFXAP:RFXANK、R0RA_1、R0RA_2、RREBU RXR: :RAR DR5、RXRA: :VDR、S0X10、S0X9、 SPl、SPI1、SPIB、SRF, SRY, STATU STAT5A、T3R_betal、TALI: :TCF3、TBP, TEADl、TFAP2A、 TLX1: :NFIC、TP53、USFU WTl_del2、WTl-KTS, WT1I、WTlI_del2、WTlI-KTS, XBP-U YYl 和 ZNF3M⑶NA结合元件中的一个或多个后得到的DNA序列。具体来讲，所述转录因子串联结合序列的核苷酸序列如序列表中序列1所示。序列表中的序列1由观00个碱基组成，该序列包含上述100个转录因子的双拷贝核心结合元件，每个转录因子的双拷贝核心结合元件间隔3个碱基对(3个碱基对的核苷酸序列是任意的)。本发明的第二个目的是提供一种富集分离内源转录因子及其复合物的方法。本发明所提供的富集分离内源转录因子及其复合物的方法，包括以下步骤1)将上述转录因子串联结合序列连接入目标载体的多克隆位点中，得到携带有转录因子串联结合序列的重组载体；2)设计并合成一对生物素标记的引物，其正、反向引物可分别与目标载体多克隆位点上游及下游200bp处退火，以步骤1)中携带有转录因子串联结合序列的重组载体为模板，在所述引物对的引导下进行PCR扩增，对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的扩增片段，得到高纯度生物素标记的DNA诱饵；3)将步骤2)获得的高纯度生物素标记的DNA诱饵固定到链亲和素包被的磁珠上；4)内源转录因子的分离纯化提取细胞核蛋白，将步骤3)获得的固定有DNA诱饵的磁珠与细胞核蛋白进行孵育，洗涤，细胞核蛋白中的内源转录因子及其复合物被DNA诱饵捕获到固体磁珠上；在上述富集分离内源转录因子及其复合物的方法中，所述步骤1)中的目标载体可为 pUC57、pET24a+、pGEX4T_2、pGEX4T_l、pCMV-Myc、pGH 或 pcDNA-Myc 等。步骤2)中上游引物的核苷酸序列如序列表中序列2所示，下游引物的核苷酸序列如序列表中序列3所示；所述100μ 1 PCR反应体系为10XExTaq Buffer 10μ 1, dNTPs (2. 5mM/dNTP) 10 μ 1，pUC57_sdTF 1 μ 1 (50ng)，上、下游引物各 1 μ 1 (Inmol)，ExTaq 0. 5 μ 1，H2O 87. 5μ 1 ；PCR 反应条件为先 94°C 2min，然后 94°C 45s, 60 °C 45s, 72 °C 2min, 共；35 个循环，再 72°C 7min,最后 4°C 30min。步骤3)中将高纯度生物素标记的DNA诱饵固定到链亲和素包被的磁珠上的方法为
(1)取120 μ 1磁珠到一干净的EP管内，置于磁力架上吸附磁珠，然后移走上清，用 500 μ 1 IXDNA Binding Buffer 洗涤磁珠；(2)加入 15 pmol(278y g)biotin-sdTF DNA，用 5XDNA Binding Buffer 将结合体系调节到 IXDNA Binding Buffer ；(3) 4°C摇动孵育20分钟；(4)用BC150洗涤两次，吸走所有上清。所述步骤4)中细胞核蛋白的提取采用Doimce勻浆的方法，先用低盐溶液破细胞膜，离心分离得到的细胞核经doimce勻浆及高盐溶液溶解，高速离心分离出核蛋白，经 BC150透析恢复内源蛋白及其复合物的天然属性。具体操作为1000Xg、4°C离心10分钟收集细胞，用IXPBS重悬细胞沉淀，再次1000Xg、4°C离心10分钟收集细胞，用10倍沉淀体积的低渗溶液重悬细胞沉淀，置冰上10分钟，1000Xg、4°C离心10分钟收集细胞，用1/4沉淀体积的低渗溶液重悬细胞沉淀，用Doimce勻浆器勻浆15下，4000Xg、4°C离心15分钟， 用1/2细胞体积的低盐溶液重悬沉淀，4°C用Doimce勻浆器勻浆10次，勻浆后溶液转移到一离心管内，加入搅拌子与搅拌器上轻轻搅动，并逐滴加入1/2细胞体积的高盐溶液，4°C 垂直混勻30分钟，4°C、25，000 X g离心20分钟，上清用BC150溶液4°C透析30分钟，所得核蛋白分装后用液氮速冻，最后存储于-80°C备用；在分离纯化内源转录因子时，取4-8mg核蛋白与步骤幻得到的磁珠孵育，孵育温度为4°C，孵育时间为2小时，用NETN(50mM NaCl, 0. 25%NP-40)洗涤两次，再用PBS洗涤3次，洗涤时间为IOs/次，此时，磁珠上便富集了大量的内源性转录因子。以上所述方法中，根据不同的应用目的，还进一步包括对步骤4)被DNA诱饵捕获的内源转录因子及其复合物洗脱以从固体磁珠脱离得到蛋白产品的过程；该步骤用于获取内源转录因子及其复合物。或者，包括对步骤4)被DNA诱饵捕获的内源转录因子及其复合物进行后续鉴定的过程，包括将磁珠上富集的内源性转录因子及其复合物用胰酶进行酶解，取上清干燥得到内源转录因子及其复合物的酶解肽段混合物以用于质谱鉴定。酶解方法为向洗涤后的磁珠中加入45 μ 1 50mM NH4HCO3 (ρΗ8· 0)，再加入10 μ 1预先配好的胰酶(Promega公司)工作液(100 μ g/mL)，37°C消化过夜，再加入5 μ 1预先配好的胰酶工作液，37°C消化1小时，加入200 μ 1 50%乙腈和0. 甲酸溶液，剧烈振荡10分钟，用磁力架吸住磁珠，将上清转移到一干净的EP管内，重复一次，合并所得上清，将所得上清置于真空压缩泵内干燥得到内源转录因子及其复合物的酶解肽段；再将干燥好的内源转录因子及其复合物的酶解肽段进行质谱鉴定并搜库确定待测样品中所含的转录因子，用LTQ-Orbitrap-Velos质谱仪检测样品的质谱鉴定条件如下色谱条件色谱柱DionexC18 PePMap300，3um，300A。； ID 75um，Length 15cm ；流动相:八，2%乙腈+98%水+0. 甲酸；B，98%乙腈+2%水+0. 甲酸;流速380nl/min；洗脱条件时间05757637075B%510123080800质谱条件数据采集时间75min，喷雾电压(spray voltage) 1. 8KV ；碰撞能量 (normalized collision energy) 35 ；采集质量范围300_1300Da ；数据库搜索采用Proteome Discovery version 1· 2平台，利用MASCOT搜索，分子量精度设为母离子lOppm，二级碎片离子0. 5Da。当然，还可采用Western、ELISA等方法对特定转录因子或辅调节蛋白进行鉴定。上述的转录因子串联结合序列在富集分离内源转录因子及其复合物中作为生物素标记的DNA诱饵的应用也属于本发明内容。本发明还一目的在于提供一种内源转录因子的检测芯片或ELISA检测试剂盒，其中包装有以上所述的转录因子串联结合序列作为生物素标记的DNA诱饵。以上，本发明富集分离内源转录因子及其复合物的方法利用转录因子与序列特异性DNA元件结合的特点，设计合成串联各种转录因子的多拷贝双链DNA结合元件，然后通过分子克隆技术在DNA结合元件两端各加入生物素标记的双链DNA手臂，形成“DNA诱饵”，在进行内源转录因子及其复合物的分离纯化时，将纯化好的生物素化DNA诱饵偶联到链亲和素包被的磁珠上，然后与预先制备好的核蛋白一起孵育，经过洗涤后从核蛋白中分离纯化内源转录因子及其复合物。最后，根据不同的应用目的后续可进一步进行转录因子的质谱鉴定及功能解析。本发明还包括“DNA诱饵”的设计，通过全基因合成或体外连接等策略，将多拷贝DNA反应元件连接到一目的载体上，然后在该载体多克隆位点两端设计合成一对生物素标记的引物，然后通过PCR扩增及凝胶回收获得生物素标记的“DNA诱饵”。该设计使得“DNA诱饵”在固定到磁珠上时形成更利于转录因子结合的空间结构。本发明采用转录因子能和DNA结合的特性进行内源转录因子及其复合物的分离纯化。由于转录因子与保守结合位点的亲和力要比非特异DNA高几个数量级，因此，使用转录因子保守结合位点的双链寡核苷酸是一个相对直接的纯化特定转录因子及其结合蛋白的方法；另外，DNA比抗体更容易获得，而且能保持转录因子在形成多蛋白复合物时的天然构象，因此，用DNA保守元件对转录因子及其复合物进行亲和纯化具有更大的优势，为解析转录因子复合物的组成及分析转录复合物的动态变化打开了广阔的前景。下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
图1为本发明分离鉴定内源转录因子及其复合物的方法的流程图
具体实施例方式实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。实施例1、小鼠肝脏细胞核蛋白转录因子及其复合物的分离鉴定用本发明的方法分离鉴定小鼠肝脏细胞核蛋白转录因子及其复合物，如图1所示，具体方法包括以下步骤一、转录因子串联结合序列的获得根据表1所示的100个转录因子及其DNA结合元件设计并合成本发明用于富集分离内源转录因子及其复合物的转录因子串联结合序列(concatenated transcriptionfactor response elements, catTFRE),该序列是由 3_5bp 的接头序列 (Linker)串联转录因子 API、AR、BRCAl、CEBPA、CREBl、E2F1、ELKl、ELK4、ESRl、ETSl、 EffSRl-FLI 1、FEV, FOXAl、FOXCl、FOXDl、F0XF2、FOXI1、FOXLl、F0X03、Fra-I、GATA2、GATA3、 GR、HIF1A: :ARNT、HLF, HNF1B、HNF4A、H0XA5、INSMU IRFU IRF2、JunB, JunD, MAX、MEF2A、 MIZF、MYC: :MAX、Myf, MZFl 1-4, MZF15-13、NF_kappaB、NFATC2、NFE2L2、NFIC、NFIL3、 NFKBl、NFYA, NHLHl、NKX3-1、NR1H2: : RXRA, NR2F1、NR3C1、NR4A2、Pax6、PBXl、PDXl、PLAGl、 PPARG> PR、PXR-I: RXR-alpha、RAR-alpha、RAR-alpha: RXR-gam、RAR-beta: RXR-alpha、REL> RELA, REST、RFXl、RFX2、RFX3、RFX5: RFXAP: RFXANK, R0RA_1、R0RA_2、RREBl、RXR: : RAR DR5、 RXRA: : VDR、S0X10、S0X9、SPl、SPI1、SPIB、SRF、SRY, STATU STAT5A、T3R_betal、TALI: : TCF3、 TBP, TEADU TFAP2A、TLXl: :NFIC、TP53、USFU WTl-del2、WTl-KTS, WT1I、WTlI-del2、 WTlI-KTS,XBP-UYYl和ZNF354C DNA结合元件中的一个或多个后得到的DNA序列，相邻转录因子之间都有34bp的接头序列，各转录因子的串联顺序为任意的。其中，包含有上述 100个转录因子的双拷贝DNA结合元件的转录因子串联结合序列的核苷酸序列如序列表中序列1所示。序列表中的序列1由观00个碱基组成，该序列包含上述100个转录因子的双拷贝核心结合元件，以增加对目的转录因子的亲和力，每个转录因子的双拷贝核心结合元件间隔3个碱基对。表1串联DNA结合元件序列包含的转录因子及其DNA结合元件— 转录因子DNA结合元件
APITGACTCA
ARAGAACACATTGTTCT
BRCAlACAACAC
CEBPATTTCGCAAT
CREBlTGACGTCA
E2F1TTTGGCGC
ELKlGAGCCGGAAG
ELK4ACCGGAAGT ESRlGGCCCAGGTCACCCTGACCT
ETSlTTTCCG
EWSRI-FLIlGGAAGGAAGGAAGGAAGG
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FOXAlTGTTTACTTTG
FOXClGGTMGTA
FOXDlGTAMCAT
F0XF2CAAACGTAAACAAT
FOXIlGGATGTTTGTTT
FOXLlTATACATAF0X03TGTAAACA
Fra-ITTACTGACTCACCACAT
GATA2GGATA
GATA3AGATAG
GRAGAACACATTGTTCT
HIFlA::ARNTGGACGTGC
HLFGGTTACGTAATG
HNFlBTTMTATTTAAC
HNF4AAGGCCAAAGGTCA
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INSMlTGTCAGGGGGCG
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JunBTTACTGACTCACCACAT
JunDCCCCTTTCTGACTCAC
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MYC::MAXGAGCACGTGGTMyfCAGCAGCTGCTG
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MZF1_5-13GTAGGGGGAA
NF-kappaBGGGAATTTCC
NFATC2TTTTCCA
NFE2L2ATGACTCAGCA
NFICTTGGCA
NFIL3TTATGTAACGT
NFKB丄GGGGATTCCCC
NFYAACCAGCCAATCAGCG
NHLHlCGCAGCTGCGT
NKX3-1ATACTTA
NR1H2::RXRAAAAGGTCAAAGGTCAAC
NR2F1TGACCTTTGAACCT
NR3C1GGGAACATTATGTCCTGT
NR4A2AAGGTCAC
PaxBTTCACGCATGAGTT
PBXlCCATCAATCAAA
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PLAGlGGGGCCCAAGGGGG
PPARG PR
PXR-I:RXR-alpha
RAR-alpha
RAR-alpha:RXR-gam
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REL
RELA
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SPIl
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TBP
TBADl
TFAP2A
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TP53
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WTl-del 2
WTl-KTS
WTlI
WTlI-del2
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AGAACACATTGTTCT
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TGGAAGGGCAGACCCAGGACACTCTCACCA
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CTTCACCCAGCAACAGATGAGGC
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CTTCACCCAGCAACAGATGAGGC
CTTCACCCAGCAACAGATGAGGC
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CCCCAAACCACCCACAACCA
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XBP-IATGACGYYlGCCATC
ZNF354C_ATCCAC_二、构建携带有转录因子串联结合序列的重组载体将步骤一获得的转录因子串联结合序列连接入目标载体pUC57的多克隆位点中，得到携带有转录因子串联结合序列的重组载体，具体方法为合成2. 81Λ全长 catTFREDNA(序列表中序列1)，用限制性内切酶EcoR I和Hind III将全长DNA构建到 PUC57载体中。最后在大肠杆菌Dffia克隆菌株中扩增表达，质粒提取后作为catTFRE生产 PCR的模板。三、高纯度生物素标记的DNA诱饵的获得设计并合成一对生物素标记的引物，其正、反向引物可分别与目标载体多克隆位点上游及下游200bp处退火，上游引物的核苷酸序列为5，-CATTCAGGCTGCGCAACTGTTG-3’ (序列表中序列2)，下游引物的核苷酸序列为5’-GTGAGTTAGCTCACTCATTAGG-3’ (序列表中序列3)，以步骤二中携带有转录因子串联结合序列的重组载体为模板，在该引物对的引导下进行PCR 扩增，所述 100 μ 1 PCR 反应体系为 JOXExiTaq Buffer 10 μ 1, dNTPs (2. 5mM/dNTP) 10 μ 1， pUC57-sdTF 1μ 1(约 50ng)，上、下游引物各 1μ l(lnmol)，ExTaq 0. 5μ 1, H2O 87. 5 μ 1 ； PCR 反应条件为先 94 °C 2min，然后 94°C 45s, 60 °C 45s, 72 °C 2min,共；35 个循环，再 72°C 7min，最后4°C 30min，反应结束后，对PCR扩增产物进行0. 8%琼脂糖凝胶电泳，回收 3000bp的目的扩增片段，得到高纯度生物素标记的DNA诱饵(biotin-sdTF)。四、将高纯度生物素标记的DNA诱饵固定到链亲和素包被的磁珠上将步骤三获得的高纯度生物素标记的DNA诱饵固定到链亲和素包被的磁珠 Dynabeads M-280streptavodin (Invitrogen)上，具体操作为1)取120 μ 1磁珠到一干净的EP管内，置于磁力架上吸附磁珠，然后移走上清；2)用 500 μ 1 IXDNA Binding Buffer 洗涤磁珠；3)加入 15pmol 078 μ g)biotin-sdTF DNA，用 5XDNA Binding Buffer 将结合体系调节到 IXDNA Binding Buffer ；4) 4°C摇动孵育20分钟；5)用BC150洗涤两次，吸走所有上清。五、内源转录因子的分离纯化提取小鼠肝脏细胞核蛋白，具体方法为1000Xg、4°C离心10分钟收集细胞，用 IXPBS重悬细胞沉淀，再次1000Xg、4°C离心10分钟收集细胞，用10倍沉淀体积的低渗溶液(IOmM Tris · HCl ρΗ7· 3，1. 5mM MgCl2, IOmM KCl，用前加入 IOmM β -ME 和 ImMPMSF)重悬细胞沉淀，置冰上10分钟，1000Xg、4°C离心10分钟收集细胞，用1/4沉淀体积的低渗溶液重悬细胞沉淀，用Doimce勻浆器勻浆15下，4000Xg、4°C离心15分钟，用1/2细胞体积的低盐溶液(20mM Tris · HCl pH7. 3,1. 5mM MgCl2, 20mM KC1,0. 2mM EDTA,25% glycerol, 用前加入IOmM β -ME和ImM PMSF)重悬沉淀，4°C用Dounce勻浆器勻浆10次，勻浆后溶液转移到一离心管内，加入搅拌子与搅拌器上轻轻搅动，并逐滴加入1/2细胞体积的高盐溶液 QOmM Tris ‘ HCl pH7. 3,1. 5mM MgCl2,1. 2M KC1,0. 2mM EDTA，25 % glycerol,使用前加 IOmM β-mercaptoethanol，0. 5XProteininhibitors)，4°C 垂直混勻 30 分钟，4°C、 25，OOOXg 离心 20 分钟，上清用 BC150 溶液 QOmM Tris · HCl pH7. 3,0. 15mM KC1,0. 2mM EDTA,20% glycerol，使用前加IOmMβ -ME，ImM PMSF)4°C透析30分钟，所得核蛋白分装后用液氮速冻，最后存储于-80°C备用。取200-800 μ 1 上述备用 NE (4-8mg), 4°C > 100, OOOXg 离心 20 分钟；将 NE 上清移入一干净EP管内，加入ImM EDTA、50mM NaCl和0. 5mmol PMSF，待用。用Bradford法测定 H印G2/小鼠肝细胞核蛋白提取物(NE)的浓度，结果浓度大于10mg/mL。然后，将准备好的待用NE加入步骤四获得的固定有DNA诱饵的磁珠中进行共孵育取与15pmol Biotin-DNA (生物素标记DNA)等量的str印avidin-coated beads (亲合素包被磁珠)，用磁力架吸附，移走上清，加入500μ 1 IXDNA Binding Buffer洗一次，再加入 15pmol Biotin-DNA，用 5XDNA Binding Buffer 将结合体系调至 1 XDNABinding Buffer。 于4°C摇动孵育20分钟，孵育后用BC150溶液进行洗涤，洗涤时间为IOs/次，共洗涤2次， 小鼠肝脏细胞核蛋白中内源转录因子及其复合物被DNA诱饵捕获到固体磁珠上。六、对被DNA诱饵捕获的内源转录因子及其复合物进行酶解及质谱鉴定为了评价该发明技术对内源性转录因子的富集分离能力，对被DNA诱饵捕获的内源转录因子及其复合物进行酶解及质谱鉴定，方法为向洗涤后的磁珠中加入45μ 150mM NH4HCO3 (pH8. 0)，再加入10 μ 1预先配好的胰酶(ftOmega)工作液(100 μ g/mL)，37°C消化过夜，再加入5μ 1预先配好的胰酶工作液，37°C消化1小时，加入200 μ 1 50%乙腈和0. 1% FA溶液，剧烈振荡10分钟，用磁力架吸住磁珠，将上清转移到一干净的EP管内，重复一次， 合并所得上清，将所得上清置于真空压缩泵内干燥样品，最后将干燥好的样品进行质谱鉴定并搜库确定，其中质谱鉴定条件如下色谱条件色谱柱DionexC18 PePMap300，3um，300Α。； ID 75um, Length 15cm ； 流动相A，2%乙腈+98%水+0. 甲酸；B，98%乙腈+2%水+0. 甲酸；流速380nl/ min ；洗脱条件
时间05757637075B%510123080800质谱条件数据采集时间75min，喷雾电压(spray voltage) 1. 8KV ；碰撞能量 (normalized collision energy) 35 ；采集质量范围300_1300Da ；数据库搜索采用Proteome Discovery version 1. 2平台，利用MASCOT搜索，分子量精度设为母离子lOppm，二级碎片离子0. 5Da。结果在本次实验中，样品中共鉴定到多达391个内源转录因子(表2)。表明小鼠肝脏细胞核蛋白中大量的内源转录因子被DNA诱饵捕获。因此，该发明技术可广泛应用于样品中大规模转录因子鉴定、特定转录因子确证和定量。更重要的是，转录因子特别是其中的核受体家族(nuclear receptor)是目前药物设计的热门靶点，现有的药物也往往通过激活/抑制转录因子来发挥其药效。另一方面，药物以其机理的复杂性和靶点的多样性为特点。药物因多靶点性，其真正效果往往和当初设计思想不一致，或者带来毒副作用，或者具有治疗其它疾病的“意外”效果。全景式扫描转录因子动态变化在药物机理和副作用研究中格外重要。本发明技术平台利用转录因子应答元件(TFRE)大规模富集分离细胞中内源性转录因子，结合后续鉴定和定量手段可检测在药物刺激下细胞内源性转录因子动态变化， 发现⑴药物发挥作用的靶点和药理机制⑵药物潜在的应答靶标，预测药物的副作用。需要说明的是，由于转录因子的各家族成员往往识别较为相似的DNA序列，如核受体家族(共48个成员)偏向于结合序列为AGGTCA的DNA单元，因此单个转录因子DNA 结合元件往往可以富集某转录因子家族的多个成员。这也解释了为何上述实验在肝脏中检测到的391个转录因子数目要多于catTFRE的设计富集转录因子数。本发明所提供的转录因子串联结合序列除了可用于富集分离内源性转录因子以检测生物机体、组织或细胞内所有内源性转录因子的表达谱外，还可用于开发内源性转录因子筛查用的检测试剂盒或检测芯片，如将结合序列包被到96孔板上或固体片基表面，与待检样品细胞裂解液孵育，可开发内源性转录因子的ELISA检测试剂盒或检测芯片。表2对被DNA诱饵捕获的内源转录因子及其复合物进行酶解及质谱鉴定结果
权利要求
1.一种转录因子串联结合序列，是由3^bp的接头序列(Linker)串联的转录因子 API、AR、BRCAl、CEBPA, CREBl、E2F1、ELKl、ELK4、ESRl、ETSl、EffSRl-FLIU FEV, FOXAl、 FOXCU FOXDU F0XF2、FOXIU FOXLU F0X03、Fra-U GATA2、GATA3、GR、HIF1A: :ARNT、HLF, HNF1B、HNF4A、H0XA5、INSMU IRFU IRF2、JunB, JunD, MAX、MEF2A、MIZF, MYC: :MAX、Myf、 MZFl 1-4、MZF15-13、NF-kappaB、NFATC2、NFE2L2、NFIC、NFIL3、NFKB1、NFYA、NHLHl、NKX3-1、 NR1H2::RXRA,NR2F1、NR3C1、NR4A2、Pax6、PBXl、PDXl、PLAGl、PPARG, PR、PXR-I:RXR-alpha、 RAR-alpha、RAR-alpha: RXR-gam、RAR-beta: RXR-alpha、REL> RELA> REST、RFX1、RFX2、RFX3、 RFX5:RFXAP:RFXANK、R0RA_1、R0RA_2、RREBU RXR: :RAR DR5、RXRA: :VDR、S0X10、S0X9、 SPl、SPI1、SPIB、SRF, SRY, STATU STAT5A、T3R_betal、TALI: :TCF3、TBP, TEADl、TFAP2A、 TLX1: :NFIC、TP53、USFU WTl_del2、WTl-KTS, WT1I、WTlI_del2、WTlI-KTS, XBP-U YYl 和 ZNF354C等DNA结合元件中的一个或多个后得到的DNA序列。
2.根据权利要求1所述的转录因子串联结合序列，其特征在于所述转录因子串联结合序列的核苷酸序列如序列表中序列1所示。
3.权利要求1或2所述的转录因子串联结合序列在富集分离内源转录因子及其复合物中作为生物素标记的DNA诱饵的应用。
4.一种富集分离内源转录因子及其复合物的方法，包括以下步骤1)将权利要求1或2所述的转录因子串联结合序列连接入目标载体的多克隆位点中， 得到携带有转录因子串联结合序列的重组载体；2)设计并合成一对生物素标记的引物，其正、反向引物可分别与目标载体多克隆位点上游及下游200bp处退火，以步骤1)中携带有转录因子串联结合序列的重组载体为模板， 在所述引物对的引导下进行PCR扩增，对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的扩增片段，得到高纯度生物素标记的DNA诱饵；3)将步骤幻获得的高纯度生物素标记的DNA诱饵固定到链亲和素包被的磁珠上；4)内源转录因子的分离纯化提取细胞核蛋白，将步骤3)获得的固定有DNA诱饵的磁珠与细胞核蛋白进行孵育，洗涤，细胞核蛋白中内源转录因子及其复合物被DNA诱饵捕获到固体磁珠上。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述步骤1)中的目标载体为PUC57、 pET24a+、pGEX4T-2、pGEX4T_l、pCMV-Myc、pGH 或 pcDNA-Myc。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于所述步骤幻中上游引物的核苷酸序列如序列表中序列2所示，下游引物的核苷酸序列如序列表中序列3所示。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于步骤2)中ΙΟΟμΙPCR反应体系为 IOXExTaq Buffer 10 μ 1，dNTPs (2. 5mM/dNTP) 10 μ 1，pUC57_sdTF 1 μ 1 (50ng)，上、下游引物各 1 μ I(Inmol)，ExTaq 0. 5μ 1, H2O 87. 5 μ 1 ;PCR 反应条件为先 94°C aiiin，然后 94°C 45s, 60°C 45s, 72°C 2min,共；35 个循环，再 72°C 7min,最后 4°C 30min。
8.根据权利要求4至7任一所述的方法，其特征在于所述步骤4)中细胞核蛋白的提取采用Doimce勻浆的方法，先用低盐溶液破细胞膜，离心分离得到的细胞核经doimce勻浆及高盐溶液溶解，高速离心分离出核蛋白，经BC150透析恢复内源蛋白及其复合物的天然属性。
9.根据权利要求4至8任一所述的方法，其特征在于所述方法中还进一步包括对步骤4)被DNA诱饵捕获的内源转录因子及其复合物洗脱以从固体磁珠脱离得到蛋白产品的过程；或对步骤4)被DNA诱饵捕获的内源转录因子及其复合物进行后续鉴定的过程，包括用胰酶进行酶解，取上清干燥得到内源转录因子及其复合物的酶解肽段混合物以用于质谱鉴定。
10. 一种内源转录因子的检测芯片或ELISA检测试剂盒，其特征在于，含有权利要求1 或2所述的转录因子串联结合序列DNA。
全文摘要
本发明公开了一种富集分离内源转录因子及其复合物的方法及其专用转录因子串联结合序列。该方法利用转录因子与序列特异性DNA元件结合的特点，设计合成串联各种转录因子的多拷贝双链DNA结合元件，然后通过分子克隆技术在DNA结合元件两端各加入生物素标记的双链DNA手臂，形成“DNA诱饵”，在进行内源转录因子及其复合物的分离纯化时，将纯化好的生物素化DNA诱饵偶联到链亲和素包被的磁珠上，然后与预先制备好的核蛋白一起孵育，从而从核蛋白中分离纯化内源转录因子及其复合物，后续可进一步进行转录因子的质谱鉴定及功能解析。
文档编号C12N15/10GK102517282SQ201110457108
公开日2012年6月27日 申请日期2011年12月30日 优先权日2011年12月30日
发明者丁琛, 刘万霖, 刘明伟, 刘琼明, 宋雷, 秦钧 申请人:中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所, 美国贝勒医学院