专利名称：一种采用戊二醛交联固定化修饰脂肪酶Novozyme435的方法
技术领域：
本发明涉及一种采用戊ニ醛交联固定化修饰脂肪酶Novozyme 435的方法，以及采用修饰后的脂肪酶Novozyme 435催化外消旋2，2- ニ甲基环丙烷甲酸乙酯不对称水解合成西司他丁关键手性中间体(S)-(+)_2，2-ニ甲基环丙烷甲酸。
(ニ)
背景技术：
S-(+)_2，2-ニ甲基环丙烷甲酸是合成西司他丁的重要手性中间体。西司他丁 (Cilsatatin)化学名(+) _ (Z) _7_[ QR) - (2_ 氨基 _2_ 羧基乙基)硫]_2_[ (IS) - (2，2-ニ 甲基环丙烷甲酰胺基)]-2-庚烯酸，是第一个应用于临床的肾脱氢ニ肽酶抑制剂。西司他丁与碳青霉烯类抗生素亚胺培南(Imipenem)制成的复合剂泰能 (Tienam)既有极强的广谱抗菌活性，又具内酰胺酶抑制作用，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、需氧菌和厌氧菌均有较强的抗菌作用，特别适用于治疗多种菌联合感染以及需氧菌和厌氧菌的混合感染，是目前临床应用最广泛的抗生素和治疗未知重症感染的王牌药物之一。制备S-(+)_2，2-ニ甲基环丙烷甲酸的方法主要有化学法和生物法。王普等采用脂肪酶Novozyme 435 (即大孔吸附树脂固定化的脂肪酶CAL-B)催化外消旋2，2-ニ甲基环丙烷甲酸乙酯不对称水解合成西司他丁关键手性中间体S-(+)-2，2-ニ甲基环丙烷甲酸， 可获得45. 6%的产率，产物光学纯度为99. 2%。脂肪酶Novozyme 435重复使用4次后，产率下降至25.8%，仅为初次催化产率的56. 5%，ee值为96. 9% (脂肪酶Novozyme 435选择性催化2，2_ ニ甲基环丙烷甲酸乙酯合成S-(+)-2，2-ニ甲基环丙烷甲酸.催化学报.2010， 31 (6) =651-655)。由于Novozyme 435为南极假丝酵母脂肪酶B (即脂肪酶CAL-B)经大孔吸附树脂吸附制得的固定化酶，在反应过程中会出现酶分子脱落现象，从而造成酶回收量的減少，影响酶的重复使用效果，从而影响该生物拆分过程的催化剂成本。
发明内容
本发明目的是进ー步提高脂肪酶Novozyme 435 (即大孔吸附树脂固定化的脂肪酶CAL-B)催化外消旋2，2_ ニ甲基环丙烷甲酸乙酯不对称水解的酶活性和稳定性，通过对脂肪酶Novozyme 435进行戊ニ醛交联的“酶二次修饰”，提高该酶的稳定性，改善其催化活性，提高重复使用次数。本发明采用的技术方案是一种采用戊ニ醛交联固定化修饰脂肪酶Novozyme 435的方法，所述方法包括将脂肪酶Novozyme 435以10g/L 20g/L添加量，加入质量浓度0. 5% 10%的戊ニ醛溶液中，在20 50°C、40 MOrpm下进行化学交联15 120min，交联反应结束后，用蒸馏水充分洗去未反应的戊ニ醛，干燥得到戊ニ醛交联修饰后的脂肪酶Novozyme 435。所述的脂肪酶 Novozyme 435 购自丹麦诺禾ロ诺德公司(Novo Nordisk, Bagsvard, Denmark)。戊ニ醛与酶分子中的氨基结合，使酶分子固定化，从而提高酶的稳定性，但加入过量的戊二醛也会破坏酶分子的结构，引起酶的失活。因此，在进行戊二醛交联反应时，需要选取适当的戊二醛浓度，既保证酶的修饰所需，同时又尽可能减少因过高戊二醛浓度造成的酶分子失活，以提高酶的稳定性。所用戊二醛溶液质量浓度优选为0. 5% 3. 0%。优选的，所述交联反应在30 35 °C、120 MOrpm下进行。采用戊二醛交联后的脂肪酶Novozyme 435为生物催化剂，以外消旋2，2_ 二甲基环丙烷甲酸乙酯为底物，于水相反应体系中，PH 6. 0 8. 0、20 50°C下进行酶催化不对称水解反应，反应结束后，反应液经分离得到产物(S)-(+)_2，2-二甲基环丙烷甲酸。该水相反应体系通常可以是pH 6. 0 8. 0的磷酸盐缓冲液，即所述的反应是将2， 2-二甲基环丙烷甲酸乙酯与戊二醛交联修饰后的脂肪酶Novozyme 435加入pH值为6. 0 8. 0的磷酸缓冲液中进行水解反应，通常反应条件为摇床转速为40 240rpm，pH 6. 0 8. 0,20 50°C，反应时间为0 80h，所述的2，2- 二甲基环丙烷甲酸乙酯的添加量为5g/ L 20g/L磷酸缓冲液，所述的交联修饰脂肪酶Novozyme 435添加量为10g/L 20g/L磷酸缓冲液。所述的产物产率和产物e. e.值测定采用气相色谱法。反应结束后，反应液用两倍体积乙酸乙酯萃取，定容后采用气相色谱分析。本发明中所用色谱柱为Chirasil-Dex CB毛细管柱Q5mmX0· 25mm ；Varian Co.， Palo Alto, CA, USA)。色谱条件为载气为氮气；检测器为氢火焰离子检测器；进样口温度和检测器温度为250°C ；柱温为程序升温80°C保留3min，然后以8°C /min升温至180°C，保留^iin ；流速为2ml/min ； 分流比为15 1。底物和产物标准品的气相色谱图见
图1。酶活力的定义为在30°C下，每分钟催化2，2_ 二甲基环丙烷甲酸乙酯不对称水解生成1微克 S-(+)-2，2-二甲基环丙烷甲酸所需的酶量，为一个酶活力单位(U)。酶活力用每克脂肪酶 Novozyme 435所含的酶活力单位数(U/g)表示。生物催化2，2_ 二甲基环丙烷甲酸乙酯不对称水解的反应过程如下
权利要求
1.一种采用戊二醛交联固定化修饰脂肪酶Novozyme 435的方法，所述方法包括将脂肪酶Novozyme 435以10g/L 20g/L添加量，加入质量浓度0. 5% 10%的戊二醛溶液中， 在20°C 50°C、40rpm MOrpm下进行化学交联反应15min 120min，反应结束后，用蒸馏水充分洗去未反应的戊二醛，干燥得到戊二醛交联修饰后的脂肪酶NOVOZyme435。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所用戊二醛溶液质量浓度为0.5% 3. 0%。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述交联反应在30°C 35°C、120rpm 240rpm下进行。
全文摘要
本发明提供了一种采用戊二醛交联修饰脂肪酶Novozyme 435的方法，所述方法包括将脂肪酶Novozyme 435以10g/L～20g/L添加量，加入质量浓度0.5％～10％的戊二醛溶液中，在20℃～50℃、40rpm～240rpm下进行交联反应15min～120min，反应结束后，用蒸馏水充分洗去未反应的戊二醛，干燥得到戊二醛交联修饰后的脂肪酶Novozyme 435。本发明采用戊二醛对脂肪酶Novozyme 435进行化学交联后，得到的二次修饰后脂肪酶Novozyme 435的稳定性得到了提高，经考察重复5次用于催化2，2-二甲基环丙烷甲酸乙酯不对称水解的催化性能，经二次修饰后的Novozyme 435重复使用5次后所得产率较未交联修饰的脂肪酶Novozyme 435提高了49.3％。
文档编号C12N11/08GK102533710SQ20111046047
公开日2012年7月4日 申请日期2011年12月31日 优先权日2011年12月31日
发明者何军邀, 梁法勇, 王普, 黄金 申请人:浙江工业大学