专利名称：改良组织块法培养啮齿类动物切牙颈环上皮细胞的方法
技术领域：
本发明涉及细胞生物学领域，特别是涉及一种改良组织块法培养啮齿类动物切牙颈环上皮细胞的方法。
背景技术：
牙外伤，龋病，牙周病，遗传病均可导致牙齿缺失，直接影响患者的咀嚼功能及美观，给患者的心理造成负面影响。目前牙齿修复的方法主要依赖于剩余牙齿及牙周组织，在不同程度上给健康牙齿及牙周造成损害。再生牙齿生物相容性好且不损坏邻牙及牙周组织，因此牙齿再生成为近年研究热点。啮齿类动物切牙由于根尖端颈环干细胞龛的形成，可以终生不断生长，常作为牙齿再生研究的动物模型。颈环干细胞龛为三层上皮细胞结构，内釉上皮紧邻牙乳头，外釉上皮紧邻牙囊，中间为星网状层细胞。分离培养颈环上皮细胞能为牙齿再生及牙齿发育分子机制研究提供细胞模型。目前颈环上皮细胞培养方法主要是酶消化法，该法耗时长，不利于保持细胞活性，可分次收集细胞解决这一问题，使步骤显得繁琐。
发明内容
本发明目的是针对现有技术存在的不足，提供一种改良组织块法培养啮齿类动物切牙颈环上皮细胞的方法，它能使原代细胞培养时酶消化时间缩短，节约时间，既有利于细胞自组织块爬出，也不会对细胞造成损伤。本发明的技术方案是提供一种改良组织块法培养啮齿类动物切牙颈环上皮细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤
1)提取啮齿类动物下颌切牙根尖端唇侧颈环组织并消化酶混合液中消化组织块；酶消化液是浓度为O. 1% dispase II蛋白酶及浓度为O. 1% I型胶原酶混合液，消化温度为37 度，消化时间为15-20min ；
2)接种消化液离心后收集组织块并接种于培养板；
3)纯化去除成纤维细胞，获得纯化的颈环上皮细胞。上述步骤2)所述接种步骤为
a.含组织块消化液离心，离心温度为室温，离心速度为1000-1200r/min，离心时间为 2_3min ；
b.于六孔板滴加培养液使恰好覆盖组织块即可，显微器械均匀分离组织块于培养板培养液中；
C.盖上盖玻片，盖玻片体积为24x24mm，滴加培养基至2. 5ml。所述培养液为含体积百分比为10%胎牛血清的DMEM-F12培养基。所述六孔板为一次性塑料培养板更有利于放置组织块，即表面涂布多聚赖氨酸， 以利于上皮细胞的贴壁。上述步骤3 )所述纯化步骤为
a.胰酶在37度的条件下,预热IOmin;b.弃旧培养基，无血清DMEM-F12培养基清洗细胞2次以去除残余血清；
c.加入胰酶，胰酶量为完全覆盖细胞，高度2-3mm，胰酶消化l_2min；
d.显微镜下观察梭形成纤维细胞收缩，聚集生长的上皮细胞无明显变化时，弃胰酶， 含血清培养基终止消化，枪头吹吸去除成纤维细胞，添加新的完全培养基继续培养；
e.1-2次胰酶消化后，即可得到纯化的上皮细胞。所述胰酶为含O. 02%EDTA的O. 25%胰酶消化液。本发明的有益效果是本发明原代细胞培养时酶消化温度为37度，消化时间缩短，节约时间，既有利于细胞自组织块爬出，也不会对细胞造成损伤，兼具酶消化法及组织块法的优点；用培养板接种，覆盖盖玻片更又有利于组织块贴壁；所用胰酶为含O. 02%EDTA 的O. 25%胰酶消化液，胰酶37度预热IOmin及使用EDTA均可以提高消化效率，缩短消化时间，减少对细胞的损伤。
下面结合实施例附图对本发明做进一步说明
图I :原代培养5— 7天组织块周围可见细胞爬出，上皮细胞及成纤维细胞混杂；200
X ；
图2 :经胰酶差别消化后纯化的上皮细胞；400 X ；
图3 :颈环上皮细胞角蛋白染色阳性；400 X。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明做一说明，以使本领域的研究人员可以更好的利用本技术进行颈环上皮细胞培养，但所举实施例不作为对本发明的限定。实验中操作均在超净台内进行。I)小鼠切牙颈环上皮细胞的原代培养
a.选取出生后5-7天小鼠，75%酒精中浸泡2-3秒，持针器及组织镊脱颈处死小鼠，提取下颌骨，置于无菌PBS中。b.待所有下颌骨提取完成后，维纳斯剪及系结镊分离下颌切牙，根尖端圆形膨大即为颈环，剪取根尖端唇侧颈环组织，置于2ml浓度为0.1% I型胶原酶和浓度为O. 1% dispase II蛋白酶混合液中，消化温度为37度。c.放置消化液于培养箱中，15-20min左右，含10% FBS DMEM-F12培养基终止消化，转移含有组织块的消化液于10 ml离心管中，离心温度为室温，离心速度为1000 r / min,离心2min,收集组织块。离心速度为1000-1200r/min、离心时间为2_3min内均可。d.因颈环组织经消化后较粘，维纳斯剪及系结镊剪开分离组织块，均匀接种于六孔板中，滴加培养液使恰好覆盖组织块即可，待放置所有组织块后，放置高压灭菌后的盖玻片覆盖组织块，盖玻片体积为24x24mm，添加培养基至2. 5ml左右，置于培养箱中培养。所述培养液为含体积百分比为10%胎牛血清的DMEM-F12培养基。所述六孔板为一次性塑料培养板更有利于放置组织块，即表面涂布多聚赖氨酸， 以利于上皮细胞的贴壁。e. 3-5天组织块周围可见细胞迁出，可见梭形成纤维细胞及多角形上皮细胞。梭形成纤维细胞分散生长，上皮细胞似鹅卵石样，细胞连接紧密，聚集生长(附图I )。细胞换液一般3天一次。2)颈环上皮细胞的纯化
待细胞融合70-80%时，根据成纤维细胞及上皮细胞对胰酶的敏感性不同，利用胰酶消化去除成纤维细胞。胰酶在37度的条件下放置于培养箱中预热lOmin，所述胰酶为含
O.02%EDTA的O. 25%胰酶消化液；去除旧培养基，无血清DMEM-F12清洗细胞2次以去除残留血清，加入胰酶，以完全覆盖细胞，高出细胞平面2-3mm为宜。胰酶作用l_2min左右，镜下见成纤维细胞收缩,细胞间隙增大,弃胰酶,含血清培养基终止消化。枪头吹吸去除成纤维细胞，添加新的完全培养基，继续培养。经过1-2次胰酶消化后，即可得到纯化的上皮细胞(附图2)。组织块周围细胞密集时，可将组织块重新接种于新的培养板，仍可有细胞爬出。3)颈环上皮细胞鉴定
对纯化的颈环上皮细胞常规进行角蛋白免疫化学染色(附图3)。以上所述实施例是为充分说明本发明所列举的实施例，本发明中没有具体说明的属本技术领域的研究人员公知常识和常用技术手段。本实施例没有详细叙述的部分和英文缩写属本行业的公知常识，在网上都可以搜索到，这里不一一叙述。
权利要求
1.改良组织块法培养啮齿类动物切牙颈环上皮细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤1)提取啮齿类动物下颌切牙根尖端唇侧颈环组织并消化酶混合液中消化组织块；酶消化液是浓度为O. 1% dispase II蛋白酶及浓度为O. 1% I型胶原酶混合液，消化温度为37 度，消化时间为15-20min ；2)接种消化液离心后收集组织块并接种于培养板；3)纯化去除成纤维细胞，获得纯化的颈环上皮细胞。
2.根据权利要求I所述的改良组织块法培养啮齿类动物切牙颈环上皮细胞的方法，其特征在于，步骤2)所述接种步骤为a.含组织块消化液离心，离心温度为室温，离心速度为1000-1200r/min，离心时间为 2_3min ；b.于六孔板滴加培养液使恰好覆盖组织块即可，显微器械均匀分离组织块于培养板培养液中；C.盖上盖玻片，盖玻片体积为24x24mm，滴加培养基至2. 5ml。
3.根据权利要求2所述的改良组织块法培养啮齿类动物切牙颈环上皮细胞的方法，其特征在于，所述培养液为含体积百分比为10%胎牛血清的DMEM-F12培养基。
4.根据权利要求2所述的改良组织块法培养啮齿类动物切牙颈环上皮细胞的方法，其特征在于，所述六孔板为一次性塑料培养板更有利于放置组织块，即表面涂布多聚赖氨酸， 以利于上皮细胞的贴壁。
5.根据权利要求I所述的改良组织块法培养啮齿类动物切牙颈环上皮细胞的方法，其特征在于，步骤3)所述纯化步骤为a.胰酶在37度的条件下,预热IOmin;b.弃旧培养基，无血清DMEM-F12培养基清洗细胞2次以去除残余血清；c.加入胰酶，胰酶量为完全覆盖细胞，高度2-3mm，胰酶消化l_2min；d.显微镜下观察梭形成纤维细胞收缩，聚集生长的上皮细胞无明显变化时，弃胰酶， 含血清培养基终止消化，枪头吹吸去除成纤维细胞，添加新的完全培养基继续培养；e.1-2次胰酶消化后，即可得到纯化的上皮细胞。
6.根据权利要求5所述的改良组织块法培养啮齿类动物切牙颈环上皮细胞的方法，其特征在于，所述胰酶为含O. 02%EDTA的O. 25%胰酶消化液。
全文摘要
本发明涉及细胞生物学领域，特别是涉及一种改良组织块法培养啮齿类动物切牙颈环上皮细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤1)取材提取啮齿类动物下颌切牙根尖端唇侧颈环组织；2)消化酶混合液中消化组织块；酶消化液是浓度为0.1%dispaseⅡ蛋白酶及浓度为0.1%Ⅰ型胶原酶混合液，消化温度为37度，消化时间为15-20min；3)接种消化液离心后收集组织块并接种于培养板；4)纯化去除成纤维细胞，获得纯化的颈环上皮细胞。本发明原代细胞培养时酶消化温度为37度，消化时间缩短，节约时间，既有利于细胞自组织块爬出，也不会对细胞造成损伤。
文档编号C12N5/071GK102604888SQ20121010004
公开日2012年7月25日 申请日期2012年4月9日 优先权日2011年12月25日
发明者张陶涛, 王小竞, 邢向辉 申请人:中国人民解放军第四军医大学