专利名称：具有人类主要组织相容性复合物(mhc)表型的转基因小鼠、其实验性使用及用途的制作方法
具有人类主要组织相容性复合物(MHC)表型的转基因小鼠、其实验性使用及用途本申请是申请日为2004年7月5日，申请号为200480028550. 9，发明名称为“具有人类主要组织相容性复合物(MHC)表型的转基因小鼠、其实验性使用及用途”的中国专利申请的分案申请。相关申请相互参考本申请基于2003年7月30日递交的美国临时申请60/490，945 (代理人案卷号03495. 6093)并要求其优先权，在此通过引用将该申请的全部内容并入本申请。
背景技术：
目前人们正在研制许多用于人类癌症免疫疗法及用于治疗传染性疾病(如痕疾、艾滋病、丙肝病毒以及严重急性呼吸道综合症(SARS))的疫苗。考虑到新兴病原体可能出现的迅速程度，对可用于快速、可靠地评估疫苗策略和不同抗原表位的保护能力的动物模型进行改进非常重要。而且，体内研究已经被要求用于评估不易或无法通过体外试验进行评价或测量的疫苗行为的重要变量，如疫苗免疫原性、疫苗组成、给药途径、组织分布以及其中初级和次级淋巴器官的参与。由于其简单性和灵活性，至少在初期疫苗研制中，小动物(如小鼠)是一种很具吸引力的对麻烦并且昂贵的模型系统(如非人类灵长类动物)的替代物。在数例疫苗(这些疫苗已在野生动物研究中证明具有保护作用)的临床试验中观察到的中度有效性(McMichael, A. J. &Hanke, T. Nat Med9，874-880 (2003))，也许可以部分通过由于动物MHC和人类HLA的最佳抗原表位不同而造成的人类和动物MHC对免疫应答结果的不同影响进行解释(Rotzschke, 0. et al. Nature 348, 252-254 (1990)) 因此，除开一些缺陷，具有人类HLA表达的转基因小鼠比野生小鼠更适于作为一种测试候选疫苗、评估疫苗可能诱导自身免疫性疾病的潜在风险，以及设计更好的基于人类限制性元件的治疗方案的临床前模型。细胞毒T淋巴细胞细胞毒T淋巴细胞(CTL)在消除传染性疾病和某些癌症方面具有很关键的作用(P. Aichele, H. Hengartner, R. M. Zinkernagel and M. Schulz, J Exp Med 171(1990),p. 1815 ；L.BenMohamed, H. Gras-Masse, A. Tartar, P. Daubersies, K Brahimi, M. Bossus,
A.Thomas and P.DruhiIe, Eur J TmmunoI 27(1997), p. 1242 ；D.J.Diamond, J.York,J. Sun, C. L. Wright and S. J. Forman, Blood 90 (1997), p. 1751)。重组蛋白疫苗不能可靠地诱导 CTL 应答(Habeshaw JA, Dalgleish AG, Bountiff L, Newell AL, Wilks, D,Walker LC, Manca F. 1990 Nov ；11(11) :418-25 ；Miller SB, Tse H，Rosenspire AJ, KingSR. Virology. 1992Dec ; 191 (2) :973-7)。在一些重要疾病的治疗中，其它一些含有减毒病原体的免疫疫苗的在人体内的使用由于安全方面的顾虑而受到阻碍。在过去几年中，基于抗原表位的方法已被提出作为一种研制新的预防和免疫治疗疫苗的可能性策略(MeliefCJ,Offringa R,Toes RE,Kast WM. Curr Opin Tmmuno1. 19960ct,8(5) :651-7 ；Chesnut Rff,Design testing of peptide based cytotoxic T—cell mediated imrnunotherapeutic totreat infiction disease, cancer, in PpowelI, MF, Newman, MJ(eds. )Vaccine Design 、The Subunit，Adjuvant Approach,Plenum Press，New_Yorkl995，847)。这种方法具有一些优点，如可选择自然处理的抗原表位，使得免疫系统关注于病原体的高度保守和免疫显性表位(R. G. van der Most,A. Sette,C. Oseroff,J. Alexander, K. Murali~Krishna, L. L. Lau,S，Southwood，J. Sidney, R. W. Chesnut，M. Matioubian and R. Ahmed, Jimmune) 157 (1996)，p. 5543)以及诱导多表位应答以阻止如在HIV、乙肝病毒(HBV)和丙肝病毒(HCV)感染中观察到的突变逃逸。它还可以在需要THl应答时，除去可能优先引起TH2应答的抑制性T细胞决定族，相反亦然(Pfeiffer C，Murray J ，Madri J，Bottomly K. Immunol Rev. 1991Oct ；123 :65-84 ；P Chaturvedi，Q Yu, S Southwood, A Sette，and B Singh Int Immunol19968 :745-755) 0最后，它还提供了除去抗原中的可能诱导不良自身免疫性疾病的自身免疫T细胞决定簇的可能。使用CTL抗原表位肽以获得保护性抗病毒或抗肿瘤免疫已在一些实验性模型中得到实现(D. J. Diamond, J. York, J. Sun, C. L. Wright and S. J. Forman, Blood901997，p. 1751 ；J. E. J. Blaney, E. Nobusawa，M. A. Brehm, R. H. Bonneau, L. M. Mylin, T. M. Fu,Y. Kawaoka and S. S. Tevethia, J Virol 72 (1998)，p. 9567)。基于人类淋巴细胞应用的CTL抗原表位定义可能会由于导致不完全结果的环境和遗传异质性以及分离CTL克隆的技术困难而形成误导。目前所述的HLA I类或II类转基因小鼠已被证明是一种能够克服这些缺陷的很有价值的工具，这些带有新CTL和T辅助细胞表位的动物模型(Hill AV. Annu Rev Immunol. 1998 ；16 :593-617 ；Carmon L,EI-ShamiKM,Paz A. ,Pascolo S,Tzehoval E,Tirosb B,Koren R,Feldman M,Fridkin M，LemonnierFA,Eisenbach L Int J Cancer, 2000Feb I ；85(3) :391-7)。这些小鼠还被用于证明i)肽HLA 亲和力与免疫原性间的良好关联(Lustgarten J，Theobald M，Labadie C，LaFace D，Peterson P，Disis ML, Cheaver MA, Sherman LA. Hum Immunol. 1997Feb ；52 (2) :109-18 ；Bakker AB，van der Burg SH, Huijbens RJ, DRijfhout JW, Melief CJ，Adema GJ, FigdorCG. Int JCancer. 1997Jan 27 ；70(3) :302-9), ii)鼠类和人类 CTL 系统在抗原处理(产生相同抗原表位)水平方面的显著重叠，以及，iii)比较针对HLA转基因小鼠和人类中的CTL 组成的大多数抗原的免疫动员(Wentworth, P. A.，A.Vifiello，J. Sidney, E. Keogh,P，W. Chesnut, H. Grey, A. Sette. 1996. Eur. J. Immunol. 26 :97 ;Alexander，J.，C. Oserof，J. Sidney, P. Wentworth, E. Keogh, G. Hermanson, F. V Chisari R. T，Kubo, H. M，Grey, A，Sette, 1997. J. Immunol. 159 :4753)。迄今为止，已研制出合成肽基CTL抗原表位疫苗，用于多种人类疾病的免疫治疗。但是，在数例临床试验中仅观察到了中度的疗效(21)。这可能部分是因为这些疫苗不能引起足够强的CTL应答。实际上，近期的报告提示需要CD4+T辅助细胞，以获得最大的CTL应答(A. J. Zajac, K. Murali-Krishna, J. N. Blattman and R. Ahmed, Curr Opin Immunol10(1998)，p. 444 ；Firat H，Garcia-Pons F，Tourdot S，Pascolo S，Scardino A，GarciaZ，Michel ML，Jack RW, Jung 0，Kosmatopoulos K，Mateo L，SuhrbierA, Lemonnier FA,Langlade-Dernoyen PEur J Irmnunol 29，3112，1999)0CTL是针对病毒感染的保护性免疫的关键因素，但体内激活CTL的条件还没有被完全认识。现在，Th细胞通常是利用合成肽激活CTL的基础的观点已经得到接受。对于合成CTL抗原表位肽，一些研究指出T辅助淋巴细胞剌激是引起最大的CTL应答所必需的(C.Fayolle, E. Deriaudand C. Leclerc, J Immunol 147(1991)，p,4069 ；C. Widmann,P. Romero, J. L. Maryanski, G. Corradin and D. Valmori, J Immunol Meth 155(1992),p. 95 ；M. Shirai, C. D. Pendkton, J. Ahlers, T. Takeshita, M. Newman and J. A. Berzofsky, JImmunol 152(1994), p. 549 ；J. P. Sauet, H. Gras-Masse, J. G. Guillet and E.Gomard, IntImmunol 8 (1996). p. 457)。一些该类研究表明激活⑶8+细胞需要⑶4+T辅助细胞和⑶8+T细胞间同时发生的相互作用依靠同样的抗原呈递细胞呈递它们的同源表位(Ridge JP,DiRosa F,Matzinger P. Nature. 1998Jun 4 ；393(6684) :474-8)。激活 CTL所需的这三种细胞相互作用的关联性在病毒抗原表位和动物模型的研究中得到了确认，因为体内当CTL和Th抗原表位完全连接，而非仅仅以相互分开的混合物存在时，CTL的诱导最为有效(Shirai M，Pendleton CD, Ahlers J, Takeshita T, Newman M, Berzohky JA. J Immunol. 1994Jan 15 ；152(2) :549-56 ;Oseroff C,Sette A,Wentworth P,Celis E,Maewal A,Dahlberg C,FikesJ，Kubo RT,Chesnut Rff, Grey BX Alexander J. Vaccine. 1998May ；16(8) :823-33)。CTL 和Th抗原肽有效诱导CTL应答的能力已在实验模型(C. Fayolle,E. Deriaud and C. Lec I ere,J Immunol 147(1991), p,4069 ；C. ffidmann, P. Romero, J.L. Maryanski, G.Corradin andD. Valmori，JImmunol Meth 155 (1992)，p. 95)和人身上得到证明。而且，有效的Th应答不仅在最大化地引起CTL应答中，而且在维持CTL记忆方面都起着重要的作用(E. A. Walter, P. D. Greenberg, M. J. Gilbert, R. J. Finch, K-S. Watanabe, E. D. Tbomas and S. R. Riddell,N Engt J Med 333(1995)，p.1038 ；Riddell SR, Greenberg PD, In Thomas ED, Blume KG,Forman SJ(eds) Hematopoietic Cell Transplantation,2nd edn. Malden,MA BlackwellSciencelnc.，1999)。最后，早已有文献表明⑶4+T “辅助”细胞对协调针对外源性抗原的分子和体液免疫应答很关键。最近，一种同时表达有HLA-A*0201 I类和HLA-DRl II类分子的转基因(Tg)小鼠模型被建立起来(BenMohamed L, Krishnan R, Longmate J, Auge C, Low L, Primus J,Diamond DJ, Hum, Immunol. 2000Aug ；61 (8) :764-79)。该作者报道说HLA-A*0201 和HLA-DRl转基因在体内均有效，MHC I类和II类分子都被用作限制性元件，HLA-DRl转基因的产物增强了 HLA-A*0201限制性的抗原特异性CTL应答(BenMohamed L，KrishnanR, Longmate J, Auge C, Low L, Primus J, Diamond DJ, Hum, Immunol. 2000Aug ；61 (8) 764-79)。值得注意的是这些HLA-A*0201/DR1 Tg小鼠表达了自身的MHCH-2I类和II类分子。因为具有内源性小鼠MHC I类基因表达的HLA I类转基因小鼠优先并通常专门会引起 H-2 限制性 CTL 应答(C Barra, HGournier, Z Garcia, PN Marche, E Jouvin-Marche,P Briand, P Fillip, and FALemonnier J Immunol 1993150 :3681-3689 ；Epstein H,Hardy F. , May JS, Johnson MH, Holmes N. Eur J Immunol. 1989Sep ；19(9) 1575-83 ；LeAX ；EJ Bernhard, MJHolterman, S Strub, PParham, E Lacy, and VH Engelhard JTmmunoI1989142 1366-1371 ；Vitiello A, Marchesini D, Furze J, Sherman LA, Chesnut Rff. , JExp Med. 1991 Apr I ；173(4) :100715)，而具有内源性小鼠MCH II类基因表达的HLA II类转基因小鼠不能诱导可靠的HLA II类限制性抗原特异性应答(Nishimura Y, Iwanaga T,Inamitsu T, Yanagawa Y, Yasunami M, Kimura A, Hirokawa K, Sasazuki T., J TmmunoI1990Jut I ；145(1) :353-60)，这些HLA-A*0201/DR1 Tg小鼠对评估对抗原的人类特异性应答的作用有限。
然而，在HLA I类转基因而H-2I类基因敲除小鼠，或HLA II类转基因而H-2II类基因敲除小鼠中，只出现了 HLA限制性CTL免疫应答(Pascolo S，Bervas N，UreJM,Smith AG,Lemonnier FA,Perarnau,B. ,J Exp Med. 1997Jun 16 ;185(12) 2043-51 ；MadsenL, Labrecque N, Engberg J, Dierich A, SVejgaard A, Benoist C, Mathis D, FuggerL.,Proc Natl Acad SciUSA_1999Aug 31 ;96 (18) :10338-43)。事实上，与仍具内源性鼠H-2I类分子的HLA-A2. I转基因小鼠相比，HLA-A2. I转基因而H-2类基因敲除(KO)小鼠表现出了达到增强HLA-A2. I限制性应答的能力。(Pascolo，S. etal. J Exp Med 185，2043-2051 (1997) ；Ureta-Vidal, A. , Firat, H. , Perarnau, B. &Lemonnier, F. A. J Immunol163,2555-2560(1999) ；Firat, H. etal. , Int Immunol 14,925-934(2002) ；Rohrlich,P. S. etal. ,Int Immunol 15，765-772 (2003))。根据小鼠 是否缺乏H-2II类分子，本发明人对HLA-DRl转基因小鼠进行了类似的观察(八.？&」於，数据尚未发表)。另外，在缺乏鼠MHC分子竞争的情况下，HLA-A2. I转基因而H-2类/-KO小鼠或HLA-DRl转基因而H-2I类/-KO小鼠只发生了 HLA 限制性免疫应答(Pascolo, S. et al. J Exp Medl85，2043-2051 (1997))(A. Pajot，数据尚未发表)，促进了对HLA限制性⑶8+和⑶4+T细胞应答的监控。但是，针对病原体的保护性免疫应答通常需要T辅助细胞和细胞毒性CD8+T细胞的协调合作，因而不能在单独的HLA类或HLA II类转基因小鼠身上进行研究，因为不可能在同一只小鼠身上同时进行HLA I类和II类人类免疫应答的评估。相应地，还需要有一种方便的动物模型系统用来对包含人类CTL抗原表位的候选人体疫苗的免疫原性进行测试，而且，在一些情况下，还需要高效⑶4+Th(辅助T淋巴细胞)抗原表位来支持抗病毒和抗肿瘤CD8+T细胞活性(A. J.Zajac，K. Murali-Krishna，J. N. Blattman and R. Ahmed,Curr Opin Immunol 10(1998), p. 444 ；Firat H,Garcia-Pons
F,Tourdot S, Pascolo S, Scardino A, Garcia Z, Michel ML, Jack Rff, Jung 0,Kosmatopoulos K, Mateo L, Suhrbier A, Lemonnier FA, Langlade-DemoyenP, Eur JIrmnunol 29，3112，1999)。另外，还需要有一种能允许同时对CTL应答、TH应答(尤其是THl或TH2应答)和体液应答之间的相互协调进行评估的系统。发明概述本发明人已通过提供缺乏H-2 I类和II类分子，而具有HLA-A2. I和HLA-DRl分子的转基因小鼠，满足并超过了这种需要。具体地说，本发明提供了小鼠，其包含(I)突变的H-2 I类和II类分子；和(2)表达HLAI类转基因分子，或表达HLA II类转基因分子，或同时表达HLA I类转基因分子和HLA II类转基因分子。这些小鼠为构建对于人类具有最大体内免疫原性的疫苗的研制和优化提供了一种有用的模型。具体地说，这种小鼠使得在一种动物身上对免疫适应性应答的三大因素(抗体、辅助细胞和细胞毒淋巴细胞)的整体分析成为可能，也使得对疫苗针对抗原攻击的保护作用的评估成为可能。本发明中的小鼠缺乏H-2 I类和II类分子，具有HLA I类转基因分子和HLA II类转基因分子表达，代表了一种完全人化的，可用于同时检测抗原特异性抗体、抗原特异性HLA-DRl限制性T细胞应答和抗原特异性HLA-A2限制性T细胞应答的试验小鼠。这些小鼠将有助于研究CTL应答、TH应答(尤其是THl或TH2应答)，以及，任选地，体液应答之间的相互协调是如何进行的。这些小鼠代表了一种基础和应用疫苗学研究的最佳工具。本发明的第一种实施方式提供了一种包含断裂的(disrUpted)H2 I类基因、断裂的H2 II类基因和功能性I类或II类转基因的转基因小鼠。本发明的第二种实施方式提供了一种包含断裂的H2 I类基因、断裂的H2 II类基因、功能性HLA I类转基因和功能性HLA II类转基因的转基因小鼠。在一些实施方式中，HLA I类转基因是HLA-A2转基因，而HLA II类转基因是HLA-DRl转基因。在另一些实施方式中，HLA-A2转基 因包含序列表中提供的HLA-A2序列，而HLA-DRl转基因包含序列表中提供的HLA-DRl序列。本发明的另一实施方式中还提供了缺乏H2 I类和II类分子，但包含功能性HLA I类转基因和功能性HLA II类转基因的转基因小鼠。在一个实施方式中，小鼠具有HLA-A2+HLA-DR1+P2m° IAP °基因型。在一些实施方式中，HLA-A2转基因包含序列表中提供的HLA-A2序列，而HLA-DRl转基因包含序列表中提供的HLA-DRl序列。本发明的另一实施方式提供了一种可同时确定候选抗原或抗原组中存在一种或多种抗原表位的方法，其中所述一种或多种抗原表位可引起特异性体液应答、TH HLA-DRl限制性应答和/或CTRL HLA-A2限制性应答。该方法包括将候选抗原或抗原组施用于包含断裂的H2I类基因、断裂的H2 II类基因、功能性HLA-A2转基因和功能性HLA-DRl转基因的转基因小鼠，或缺乏H2 I类和II类分子，但包含功能性HLA I类转基因和功能性HLAII类转基因，并具有HLA-A2+HLA-DRl+0 2m° IAP °基因型的转基因小鼠中；测定小鼠体内对抗原的特异性体液应答；测定小鼠体内对抗原的TH HLA-DRl限制性应答；并测定小鼠体内对抗原的CTRLHLA-A2限制性应答。如在小鼠体内观察到对抗原的特异性体液反应，说明抗原内存在引起体液应答的抗原表位。如在小鼠体内观察到对抗原的TH HLA-DRl限制性应答，说明抗原中存在引起TH HLA-DRl限制性应答的抗原表位。如小鼠体内观察到对抗原的CTRL HLA-A2限制性应答，说明抗原中存在引起CTRL HLA-A2限制性应答的抗原表位。在一些实施方式中，试验方法包括对小鼠体内的对抗原的Thl-特异性应答和Th2-特异性应答进行测定。在这种情况下，如在小鼠体内观察到对抗原的Thl-特异性应答，说明存在引起小鼠体内对抗原的Thl-特异性应答的抗原表位，而在小鼠体内观察到对抗原的Th2-特异性应答，说明存在引起小鼠体内对抗原的Th2-特异性反应的抗原表位。本发明还提供一种确定在候选抗原或抗原组中存在HLA DRl-限制性T辅助细胞抗原表位的方法，该方法包括将候选抗原或抗原组施用于包含断裂的H2 I类基因、断裂的H2 II类基因、功能性HLA-A2转基因和功能性HLA-DRl转基因的转基因小鼠，或缺乏H2 I类和II类分子，但包含功能性HLA I类转基因和功能性HLA II类转基因，并具有HLA-A2+HLA-DRl+0 2m° IAP °基因型的转基因小鼠；并测定小鼠体内对抗原的THHLA-DRl限制性T辅助细胞抗原表位应答。如在小鼠体内观察到针对抗原TH HLA-DRl限制性T辅助细胞抗原表位应答，说明抗原中存在引起TH HLA-DRl限制性T辅助细胞抗原表位应答的抗原表位。另外，本发明提供了一种包含通过以上段落中的方法确定出的HLADRl-限制性T辅助细胞抗原表位的分离的抗原。在一些实施方式中，该分离的抗原还包括引起体液应答的抗原表位和/或引起CTRL HLA-A2限制性应答的抗原表位。在一些实施方式中，包含HLADRl-限制性T辅助细胞抗原表位的抗原包含多肽。在另一些实施方式中，包含HLA DRl-限制性T辅助细胞抗原表位的抗原包含多核苷酸。在另一些实施方式中，包含HLADRl-限制性T辅助细胞抗原表位的抗原包含DNA、RNA,或DNA和RNA。
另外，本发明提供了一种确定候选抗原或抗原组中是否存在HLA-A2-限制性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)抗原表位的方法，该方法包括将候选抗原或抗原组施用于包含断裂的H2 I类基因、断裂的H2 II基因、功能性HLA-A2转基因的转基因小鼠，或缺乏H2 I类和II类分子，但包含功能性HLA I类转基因和功能性HLA II类转基因，并具有HLA-A2+HLA-DRH2m° IAP °基因型的小鼠中；并测定小鼠体内对该抗原或抗原组的HLA-A2-限制性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答。如在小鼠体内观察到针对该抗原或抗原组的HLA-A2-限制性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答，说明抗原或抗原组中存在引起HLA-A2-限制性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答的抗原表位。本发明提供了一种包含通过以上段落中方法确定的HLA-A2-限制性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)抗原表位的分离的抗原。在一些实施方式中，抗原还包含引起体液应答的抗原表位和/或引起TH HLA-DRl限制性T辅助细胞抗原表位应答的抗原表位。在一些实施方式中，包含HLA-A2-限制性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)抗原表位的抗原包含多肽。在一些实施方式中，包含HLA-A2-限制性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)抗原表位的抗原包含多核苷酸。在另一些实施方式中，包含HLA-A2-限制性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)抗原表位的抗原包含DNA、RNA、或DNA和RNA。该发明还提供了一种比较由两种或两种以上的疫苗引起的T-辅助细胞应答的方法。这种方法包括将第一种候选疫苗施用于包含断裂的H2I类基因、断裂的H2 II类基因、功能性HLA-A2转基因和功能性HLA-DRl转基因的转基因小鼠，或缺乏H2 I类和II类分子，但包含功能性HLA I类转基因和功能性HLA II类转基因，并具有HLA-A2+HLA-DRl+0 2m° IAP °基因型的转基因小鼠中，并测量小鼠体内由该疫苗引起的T-辅助细胞应答；将第二种候选疫苗施用于包含断裂的H2I类基因、断裂的H2 II类基因、功能性HLA-A2转基因和功能性HLA-DRl转基因的转基因小鼠，或缺乏H2 I类和II类分子，但包含功能性HLA I类转基因和功能性HLA II类转基因，并具有HLA-A2+HLA-DRl+0 2m° IAP °基因型的转基因小鼠中，并测量小鼠体内由第二种疫苗引起的T-辅助细胞应答；将每种需要比较的其他候选疫苗分别施用于包含断裂的H2 I类基因、断裂的H2 II类基因、功能性HLA-A2转基因和功能性HLA-DRl转基因的转基因小鼠，或缺乏H2 I类和II类分子，但包含功能性HLA I类转基因和功能性HLA II类转基因，并具有HLA-A2+HLA-DR1+ P 2m° IA P °基因型的转基因小鼠中，测量小鼠体内由该种疫苗引起的T-辅助细胞应答；通过比较每种疫苗所引起的T-辅助细胞应答，确定各种疫苗引起T-辅助细胞应答的能力。在一些实施方式中，T-辅助细胞应答为HLA-DRl限制性应答。另外，本发明提供了一种比较由两种或两种以上疫苗引起的细胞毒性T淋巴细胞应答的方法。该方法包括将第一种候选疫苗施用于包含断裂的H2 I类基因、断裂的H2 II类基因、功能性HLA-A2转基因和功能性HLA-DRl转基因的转基因小鼠，或缺乏H2 I类和II类分子，但包含功能性HLA I类转基因和功能性HLA II类转基因，并具有HLA-A2+HLA-DRl+0 2m° IAP °基因型的转基因小鼠中，并测量小鼠体内由第一种疫苗引起的细胞毒性T淋巴细胞应答；将第二种候选疫苗施用于包含断裂的H2 I类基因、断裂的H2 II类基因、功能性HLA-A2转基因和功能性HLA-DRl转基因的转基因小鼠，或缺乏H2 I类和II类分子，但包含功能性HLA I类转基因和功能性HLA II类转基因，并具有HLA-A2+HLA-DRl+0 2m° IAP °基因型的转基因小鼠中，并测量小鼠体内由第二种疫苗引起、的细胞毒性T淋巴细胞应答；将每种需要比较的其他候选疫苗分别施用于包含断裂的H2 I类基因、断裂的H2 II类基因、功能性HLA-A2转基因和功能性HLA-DRl转基因的转基因小鼠，或缺乏H2 I类和II类分子，但包含功能性HLA I类转基因和功能性HLA II类转基因，并具有HLA-A2+HLA-DRl+0 2m° IA P °基因型的转基因小鼠中，并测量小鼠体内由该种疫苗引起的细胞毒性T淋巴细胞应答；通过比较各种疫苗所引起的T细胞毒性细胞应答确定各种疫苗引起细胞毒性T淋巴细胞应答的能力。在一些实施方式中，T细胞毒性细胞应答为HLA-A2限制性应答。另外，本发明提供了一种可同时比较由两种或两种以上疫苗引起的T-辅助细胞应答和细胞毒性T淋巴细胞应答的方法。该方法包括将第一种候选疫苗施用于包含断裂的H2 I类基因、断裂的H2 II类基因、功能性HLA-A2转基因和功能性HLA-DRl转基因的转 基因小鼠，或缺乏H2 I类和II类分子，但包含功能性HLAI类转基因和功能性HLA II类转基因，并具有HLA-A2+HLA-DRl+0 2m° IA@°基因型的转基因小鼠中，并测量小鼠体内由第一种疫苗引起的T-辅助细胞应答和细胞毒性T淋巴细胞应答；将第二种候选疫苗施用于包含断裂的H2 I类基因、断裂的H2 II类基因、功能性HLA-A2转基因和功能性HLA-DRl转基因的转基因小鼠，或缺乏H2 I类和II类分子，但包含功能性HLA I类转基因和功能性HLAII类转基因，并具有HLA-A2+HLA-DRl+0 2m° IAP °基因型的转基因小鼠中，并测量小鼠体内由第二种疫苗引起的T-辅助细胞应答和细胞毒性T淋巴细胞应答；将每种需要比较的其他候选疫苗分别施用于包含断裂的H2 I类基因、断裂的H2 II类基因、功能性HLA-A2转基因和功能性HLA-DRl转基因的转基因小鼠，或缺乏H2 I类和II类分子，但包含功能性HLA
I类转基因和功能性HLA II类转基因，并具有HLA-A2+HLA-DRl+e2m° IA@°基因型的转基 因小鼠中，测量小鼠体内由该种疫苗引起的T-辅助细胞应答和细胞毒性T淋巴细胞应答；通过比较每种疫苗所引起的T-辅助细胞应答和T细胞毒性细胞应答确定各种候选疫苗引起T-辅助细胞应答和细胞毒性T淋巴细胞应答的能力。在一些实施方式中，T-辅助细胞应答为HLA-DRl限制性应答，而T细胞毒性细胞应答为HLA-A2限制性应答。本发明还提供了一种可同时确定在施用一种抗原或包含一种或多种抗原的疫苗后，小鼠体内的体液应答、T-辅助细胞应答和细胞毒性T淋巴细胞应答的方法。该方法包括将抗原或包含一种或多种抗原的疫苗施用于包含断裂的H2 I类基因、断裂的H2 II类基因、功能性HLA-A2转基因和功能性HLA-DRl转基因的转基因小鼠，或缺乏H2 I类和II类分子，但包含功能性HLA I类转基因和功能性HLA II类转基因，并具有HLA-A2+HLA-DRl+0 2m° IAP °基因型的转基因小鼠中，测定小鼠体内对该抗原或包含一种或多种抗原的疫苗的特异性体液应答，测定小鼠体内对该抗原或包含一种或多种抗原的疫苗的T-辅助细胞应答，测定小鼠体内对该抗原或包含一种或多种抗原的疫苗的细胞毒性T淋巴细胞应答。在一些实施方式中，T-辅助细胞应答为TH HLA-DRl限制性应答。在一些实施方式中，T细胞毒性细胞应答为CTRL HLA-A2限制性应答。基于预先选择的标准，本发明还提供了一种优化两种或两种以上用于人类的候选疫苗组合的方法。该方法包括同时确定小鼠在施用两种或两种以上候选疫苗组合后的体液应答、T-辅助细胞应答和细胞毒性T淋巴细胞应答。通过向包含断裂的H2 I类基因、断裂的H2 II类基因、功能性HLA-A2转基因和功能性HLA-DRl转基因的转基因小鼠，或缺乏H2 I类和II类分子，但包含功能性HLA I类转基因和功能性HLA II类转基因，并具有HLA-A2+HLA-DRl+0 2m° IAP °基因型的转基因小鼠中施用抗原或包含一种或多种抗原的疫苗，测定小鼠体内对抗原或包含一种或多种抗原的疫苗的特异性体液应答，测定小鼠体内对抗原或包含一种或多种抗原的疫苗的T-辅助细胞应答，测定小鼠体内对抗原或包含一种或多种抗原的疫苗的细胞毒性T淋巴细胞应答，并按照预先选择的标准根据测定结果选择最优疫苗。在一些实施方式中，两种或两种以上候选疫苗的不同之处仅在于疫苗中的抗原与佐剂的比例不同。在一些实施方式中，两种或两种以上候选疫苗的不同之处仅在于疫苗中佐剂的类型不同。另一方面，本发明提供了一种确定疫苗在施用于人体后是否存在引起自身免疫疾病风险的方法。该方法包括将疫苗施用于包含断裂的H2I类基因、断裂的H2 II类基因、功能性HLA-A2转基因和功能性HLA-DRl转基因的转基因小鼠，或缺乏H2 I类和II类分子，但包含功能性HLA I类转基因和功能性HLA II类转基因，并具有HLA-A2+HLA-DRl+0 2m° IAP °基因型的转基因小鼠中，并测定小鼠体内的自身免疫应答。 如观察到小鼠体内出现自身免疫应答，表明疫苗在施用于人体后存在引起自身免疫疾病的 风险。本发明还提供了一种包含断裂的H2 I类基因、断裂的H2 II类基因和功能性HLAI类或II类转基因的分离的转基因小鼠细胞。另外，本发明提供了一种包含断裂的H2 I类基因、断裂的H2 II类基因、功能性HLA I类转基因和功能性HLA II类转基因的分离的转基因小鼠细胞。在一些实施方式中，HLA I类转基因为HLA-A2转基因，而HLA II类转基因为HLA-DRl转基因。在另一些实施方式中，HLA-A2转基因包含序列表中提供的HLA-A2序列，而HLA-DRl转基因包含序列表中提供的HLA-DRl序列。另外，本发明提供了一种缺乏H2 I类和II类分子，但包含功能性HLA I类转基因和功能性HLA II类转基因的分离的转基因小鼠细胞。在一些实施方式中，转基因小鼠细胞具有HLA-A2+HLA-DR1+P2m° IAP °基因型。在另一些实施方式中，HLA-A2转基因包含序列表中提供的HLA-A2序列，而HLA-DRl转基因包含序列表中提供的HLA-DRl序列。
本发明将结合以下图示进行更详细的描述图I所示为转基因分子在细胞表面表达的流式细胞检测分析。(a)取自HLA-DRl-转基因 H-2 II 类-KO (DR1+CII-，左侧)、HLA_A2. 1-/HLA-DR1-转基因 H-2 I 类-/II 类-K0(A2+DR1+CI-CII-，中)和 HLA-A2. I-转基因 H-2 I 类/-KO(A2+CI-，右侧)小鼠的脾细胞，使用FITC-标记W6/32 (抗-HLA-ABC，横坐标)或生物素化的28-8-6S (抗_H_2Kb/Db，纵坐标)m. Ab染色，后者以PE-标记抗-小鼠Ig G显色。(b)从同种小鼠身上取得的B220+脾B淋巴细胞，使用FITC-标记L243 (抗-HLA-DRl，上)和PE-标记AF6-120. I (抗H-2IAPb，下)m. Ab 染色。图2显示了具有指定基因型的小鼠体内⑶8+和⑶4+脾T细胞数量和BV片段的用途(基于免疫扫描分析)。(a)取自HLA-DRl-转基因H-2II类-KO(DR1+CII-，左侧)、HLA-A2. 1-/HLA-DR1-转基因 H-2 I 类-/II 类-KO(A2+DR1+CI-CII-，中)和 HLA-A2. I-转基因H-2类/-KO (A2+CI-,右侧)小鼠的脾细胞，使用PE-标记CT-⑶4 (抗-小鼠⑶4，纵坐标)和FITC-标记53-6. 7(抗-小鼠⑶8，横坐标)m. Ab染色。数字与⑶4+(左上部分)或CD8+(右下部分)T细胞在总的脾细胞中的百分比相对应。(b和c)用于BV片段家族(1-20)的提纯脾⑶8+(b)和⑶4+(c) T细胞进行免疫扫描TR-PCR分析，采用正向BV家族(1_20)特异的和反向BC引物。有效重排的BV片段家族的典型图像包括一系列相差3个核苷酸的带高斯分布的波峰。该图示说明了使用具有HLA-A2. 1-/HLA-DR1-转基因H-2 I类-/II类-KO代表性小鼠的结果。图3所示为HBs-特异性抗体、细胞溶解及增殖应答。对HLA-A2. 1-/HLA-DR1-转基因H-2 I类/11类-KO小鼠进行HBs Ag-编码质体-DNA肌肉注射免疫，并对进行和未进行免疫的小鼠分别进行测验。(a)体液(上)，细胞溶解(中)和增殖(下)应答及对典型性HBsAg-DNA-免疫小鼠的特异性对照组。对含有中小HBV包膜蛋白的HBsAg分子及preS21(l9_134肽进行的抗体(IgG)滴度在ELISA分析中得到确定。使用相关(HBsAg348_357，HLA-A2. I-限制性 )或对照(HBsAg371.，H-2Kb-限制性 A ;和 MAGE_3271_279，HLA-A2. I-限制性d)肽脉冲的RMAS-HHD靶细胞对不同效应器与靶器官(E/T)比率下的细胞溶解活 动进行评估。使用相关(HBsAg180_195, HLA-DRl-限制性)或对照(HBsAg 8，H-2IAb-限制性和HIV I Gag263_278，HLA-DRl-限制性)肽对增殖应答进行测定。(b)将6只(1_6)HBsAg-DNA-免疫小鼠进行的抗体(IgG，上)、细胞溶解(中)和增殖(下)应答与6只初次接受试验的小鼠的平均应答(0)比较进行了类似评估。在以HBsAg348_357，免疫显性(填充条带)或HBsAg335_343,亚显性(subdominant)(灰色条带)肽脉冲的RMAS-HHD祀细胞上检测到E/T比率为30/1的细胞溶解活性。图4显示了保护分析的结果。使用编码HBsAg的质粒DNA对HLA-A2. I-/HLA-DRl-转基因H-2I类/11类-KO小鼠进行(对照组不进行)两次免疫。最后一次免疫完成15天后，使用表达HBsAg或HBx蛋白的IO7PFU的rVV对小鼠进行腹膜内攻击。4天后，对这些小鼠分别进行卵巢内病毒滴度测试。给出了 rVV-HBsAg(I，n = 10)攻击的HBsAg-DNA-免疫小鼠，rVV-HBsAg(N, n = 6)攻击的初次试验的小鼠、rVV-HBx(Ix, n = 6)攻击的HbsAg-免疫小鼠和rVV-HBx(Nx，n = 6)攻击的初次试验小鼠的结果(rVV PFU/卵巢，以log 10表不)。图5 显示了 pcmv S2/S 免疫后的 HLA-A2+DR1+CI-CII-小鼠的 AC 抗-pre S2 应答。图6显示了 pcmv S2-S免疫后的HLA-A2+DR1+CI-CII-小鼠对HLA-A2限制性抗原表位的T CD4增殖应答。图7 显示了 pcmvS2/S 免疫后的 HLA-A2+DR1+CI-CII-小鼠对 HLA-A2 限制性HBS (348-357)抗原表位的CD8T细胞的细胞毒性应答。序列SEQ ID NO :1包含以下部分核苷酸1-1205包含HLA-A2启动子；核苷酸1206-1265 HLA-A2引导序列；核苷酸1266-1565为人P2微球蛋白cDNA ;核苷酸1566-1610 (Gly4Ser) 3接头；核苷酸2441-4547，为含有HLA-A2外显子2和部分内含子3的节段；核苷酸2441-4547，为含有部分内含子3、外显子4_8和部分H2Db基因3'非编码区域的节段。SEQ ID NO 2是DRA*0101基因的核苷酸序列。核苷酸1-15279是定位于HLA-DRalpha基因5’的启动子，核苷酸15280-15425是外显子1，核苷酸15344-15346是ATG起始密码字，核苷酸17838-18083是外显子2，核苷酸18575-18866是外显子3，核苷酸19146-19311是外显子4，核苷酸20008-20340是外显子5。SEQ ID N0:3是DRB1*010101基因的核苷酸序列。核苷酸7391-7552是外显子I，核苷酸7453-7455是ATG起始密码子，核苷酸15809-16079是外显子2，核苷酸19536-19817是外显子3，核苷酸20515-20624是外显子4，核苷酸21097-21121是外显子5，核苷酸21750-22085 是外显子 6。 发明详述除非特别说明，本发明的实践将采取细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的传统技术。这些技术在以下文献中进行了详细的解释。例如Molecular Cloning ALaboratory Manual, 2nd Ed. , ed. By Sambrook,Fritsch and Maniatis(Cold Spring Harbor Laboratory Press :1989) ；DNA Cloning,Volumes I and II (D.N. Glover ed. , 1985) ；01igonucleotide Synthesis(M. J. Gaited. ,1984) ；Mullis etal. U. S.Pat.No. 4,683, 195 ；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames&S. J. Higgins eds. 1984) !Transcription And Translation (B.D. Hames&S.J. Higgins eds. 1984) ；Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc.,1987) !Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press, 1986) ；B.Perbal,APractical GuideTo Molecular Cloning (1984) ；the series, Methods In ENZYM0L0GY(J. Abelson andM. Simon, eds. -in-chief, Academic Press, Inc. , New York), specifically, Vols.154and155(ffu et al. eds. ) and Vol. 185, " Gene Expression Technology " (D. Goeddel,ed. ) ；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J.H. Miller and M. P. Caloseds. ,1987, Cold Spring Harbor Laboratory) ；Immunochemical Methods In Cell AndMolecular Biology(Mayer and Walker, eds. ,Academic Press,London,1987) ；HandbookOf Experimental Immunology,Volumes V(D. M. Weir and C. C. Blackwell,eds. ,1986) ；andManipulating the Mouse Embryo,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor, N. Y.，1986)。本发明提供了包含⑴突变型H-2 I类和II类分子和⑵表达HLAI类转基因分子、或HLA II类转基因分子、或HLA I类转基因分子和HLAII类转基因分子的小鼠。本发明中的缺乏H-2 I类和II类分子，并具有HLA I类和II类转基因分子表达的小鼠代表了一种完全人化的实验性小鼠，可用于同时检测是否存在抗原-特异性抗体、抗原-特异性HLA-DRI限制性T细胞应答及抗原-特异性HLA-A2限制性T细胞应答。这些小鼠有助于研究CTL应答、TH应答(尤其是THl或TH2应答)和，任选地，体液应答之间的相互协调是如何进行的。这些小鼠为基础以及应用疫苗学研究提供了最佳工具。本发明提供了一种包含断裂的H2 I类基因、断裂的H2 II类基因和功能性HLA I类或II类转基因的小鼠。在一些实施方式中，转基因小鼠包含断裂的H2 I类基因、断裂的H2 II类基因、功能性HLA I类转基因和功能性HLA II类转基因。这种小鼠可以说是一种完全人化的试验小鼠，因为它可被用于同时检测抗原-特异性抗体，抗原-特异性HLA-DRI限制性T细胞应答和抗原-特异性HLA-A2限制性T细胞应答是否存在。部分如此处提供的实施例所示，并且每个专业人士通常都能从本发明中清楚看到的是HLA-A2. 1-/HLA-DRI-转基因H2-I/II类-KO小鼠具有通过DNA免疫产生HBsAg-特异性抗体、CD4+辅助细胞和CD8+溶细胞T细胞应答的能力。这些在每个单独受试小鼠身上观察到的应答指向的是和人类应答一样的免疫显性表位，并且表现为免疫动物对HBsAg重组体疫苗病毒的特异性保护。T辅助细胞对于抗体应答的完全成熟(Katz, D. H. &Benacerraf, B. , AdvImmunol 15，1-94 (1972))，细胞毒性T淋巴细胞(CTL)激发的针对很多表位的应答(von Boehmer, H.&Haas, ff. , J Exp Med 150,1134-1142 (1979) ；Keene, J. A. &Forman,J.，J ExpMed 155,768-782(1982)),以及 CTL 长期维护都很至关重要(Matloubian, M.，Concepcion, R. J. Mhmed, R.，JVirol 68,8056-8063 (1994))。两种抗体(Lefrancois, L.，JVirol 51,208-214(1984))以及 CTL(Zinkernagel，R.M.&Welsh，R.M.，J Immunol 117，1495-1502(1976))都是抵抗病毒感染的保护性免疫的关键成分。实际中，有效的HBsAg-特异性抗体和CTL应答在HLA-A2. 1/HLA-DR1-双转基因、H-2 I类/11类-KO小鼠身上观察到，而并没有在HLA-A2. I-单转基因H-2I/II = KO小鼠身上观察到。因此，HBsAg-特 异⑶4+T辅助细胞对于产生有效的HBsAg-特异性CTL和抗体应答很重要。这些结果与在HBsAg-免疫小鼠(Milich, D. R.，Semin LiverDis 11,93-112(1991))及 HBsAg-接种的人上(Celis, E. , Kung, P. C. &Chang, T. ff. , J Immunol 132，1511-1516 (1984))进行的研究相符，提示抗-HBs抗体应答的产生取决于CD4+T细胞。表达HLA-A2. I I类和HLA-DR1 II类分子的转基因小鼠已经产生(BenMohamed，L.et al. Hum Immunol 61，764-779 (2000))。作者提出 HLA-A2. I 和 HLA-DR1 分子都是体内功能性限制性元件，HLA-DRl转基因的产物能增强HLA-A2. I限制性抗原-特异性CTL应答。但是，发生在小鼠上的这些免疫应答，其于人类的关联性被以下事实削弱了 这些小鼠仍然表达出它们自身的H-2 I类和II类分子，通常这些被优先并常常是专门作为对抗原的限制性兀件使用(Ureta-Vidal,A. ,Firat,H. ,Perarnau, B. &Lemonnier,F. A. , J Immunol 163,2555-2560(1999) ；Rohrlich,P. S. etal. , Int Immunol 15，765-772 (2003)) (A. Pajot，数据尚未发表)。此处描述的发明通过提供HLA-A2. 1/HLA-DR1-转基因、H-2 I类/11类-KO小鼠克服了该限制。在一些实施方式中，HLA-A2. 1-/HLA-DR1-转基因、H_2 I类/11类-KO小鼠在^ 2m-K0背景下表达HLA-A2. I单链，其中的人类P 2m通过肽键与HLA-A2. I重链通过共价键相连。^从^^基因失活，使得它们还缺乏在细胞表面传统表达的H-2 IA和IE II类分子，因为在H-2b单倍体中H-2IEa是假基因。此处提供的结果说明这种小鼠不具有H-2 I类和II类分子的细胞表面表达。但是，在一例报告中指出，自由I类重链，尤其是H-2Db，可能存在于P2m-K0小鼠细胞表面，并可能引起同种异体反应性应答。即便如此，由于这种小鼠缺乏多肽，它们不会干扰抗原-特异性免疫应答(Bix，M. &Raulet, D.，J Exp Med 176，829-834(1992))。这一点在 Allen et al 的报告中得到了支持(Alien，H.，Fraser, J.，Flyer, D. , Calvin, S. &Flavell, R. , ProcNatl Acad Sci U S A 83，7447-7451 (1986))，该报告确认即使细胞内不呈现P 2m表达，细胞表面也存在H-2Db表达，但这种Db抗原不会被Db-异种特异性或Db-限制性细胞毒性T淋巴细胞识别。另外，Db抗原不能被大多数天然Db的单克隆抗体识别。尽管如此，在HLA-DR a单转基因小鼠中，非传统HLA-DR a/H_2IE P b杂交复合体可某种程度地在细胞表面进行表达，至少在缺乏HLA-DRP链时(Lawrance，S. K. etal.，Cell 58,583-594(1989))。除开这些发现，即使使用会同这些杂交分子发生反应的mAb(17-3-3S)，采用血清学的方法也未在HLA-A2. 1-/HLA-DR1-转基因、H-2 I类-/II类-KO小鼠的细胞表面测出这些非传统分子(0zato,K. ,Mayer,N. &Sachs,D. H. , J Immunol124，533-540(1980))(图la和数据未被显示)。另外，对这些小鼠的HBsAg-特异性和HIV I-Gag-特异性T细胞应答的研究结果均表明HLA-A2. I和HLA-DRl分子作为限制性元件的专门用途。这说明非传统HLA-DR a /H-21E P b杂交分子不如传统HLA-DR a /HLA-DRP分子稳定，而且它们可能只存在于缺少HLA-DRP链的情况中。采用整个(H-2IA^\ IA a \ IE@b)H-2II类基因区域以及H-2Db基因被删除的小鼠菌株进行分析，以完全排除此可能性。对取自第一种动物的脾细胞的初步分析显示出与在HLA-DRl-转基因H-2II类-K0(la ^bo)小鼠身上所观察到的类似的⑶4+T细胞池再生，提示这些小鼠的HLA-DRl-限制性 CD4+T 细胞应答与 HLA-A2. 1-/HLA-DR1-转基因、H-2 I 类-/II 类-KO 小
鼠的等同。与亲代HLA-A2. I-转基因H_2 I类-KO小鼠相比，HLA-A2. 1-/HLA-DR1-转基因，H-2 I类-/II类-KO小鼠的外周⑶8+T淋巴细胞从数量和质量上都与完全多样化类似，至少在T细胞受体(TCR)BV基因片段的利用方面。与野生动物相比，部分恢复，尤其是CD8+T细胞池的部分恢复，一直是对具有嵌合(原小鼠的0 3结构域)111^42.1分子表达的单HLA-转基因小鼠的一个观察对象。不管a 3结构域的置换，小鼠的⑶8与HLA-A2. 2分子之间也具有次最优的相互作用，因为Co-晶体分析表明人类⑶8也与HLA-A2. I重链a 2结构域相互接触(Gao, G.F. etal.，Nature 387，630-634(1997))。次最优的协同作用还可能在内质网中发生，在内质网中，许多分子(TAP，tapasine，ERp 57)参与MHC I类分子的生物合成。但是，在这个阶段，文献唯一报道的这些小鼠和人类内质网分子的功能性差异(即人类的有效转运，而不是羧基末端带有正电荷的小鼠细胞溶质肽TAP) (Momburg,F. ,Neef jes,J. J. &Hammerling, G. J.，Curr Opin Immunol 6, 32-37 (1994))与通过疏水的 C-末端结合肽的HLA-A2. I分子无关，既然这些肽被小鼠和人类TAP有效地转运。尽管⑶8+T淋巴细胞的数目在单HLA-A2. I转基因，H-2类/-KO小鼠和HLA-A2. 1-/HLA-DR1-转基因H-2 I类-/II类-KO小鼠中较低，然而它们在抗HBsAg方面起着有效的作用，并且，重要的是，后一种小鼠可产生与人类类似的抗体、辅助细胞和细胞溶解等淋巴细胞应答。妨碍基于T抗原表位的针对T淋巴细胞的疫苗设计的困难之一是HLA I类/11类分子多态性。HLA-A2. I和HLA-DRl分子在人类个体中具有显著比例的表达(HLA-A2. I 30-50%, HLA-DRl 6-18% )。尽管已知HLAI类分子超家族中功能簇是基于呈递的肽34组的显著重复，但对由各种HLAI类同型或等位变体引起的应答的个体分析中，确定其最佳抗原表型仍然是迫切期望的。这对于设计新的监控免疫应答的试剂，例如四聚体fHLA-I类或HLA-II类)尤其重要。由于同样的原因，获取具有HLA-A2. I和其它HLA II类分子共同表达的小鼠菌株很有帮助，即使肽与HLA II类分子的连接比与I类分子的连接限制少。基于此处的结论，更多的HLAI类/11类转基因H-2 I类-/II类-KO小鼠可被设计作为这些以及其它目的。尽管HLA-转基因H-2-K0小鼠使得进行可很好的可移置于人的抗原肽的免疫原性的详细分析和优化成为可能(Rohrlich, P. S. et al.，Int Immunol 15，765-772 (2003)；Loirat, D. , Lemonnier, F.A.&Michel, M. L. , JTmmunoI 165,4748-4755 (2000) ；Scardino,A.etal.，Eur J Immunol 31，3261-3270 (2001))，但这对于疫苗佐剂组成的研究的作用并不明显。这可能是由于两种物种之间在抗原激发的反应早期多种启动的效应器的不同引起的。将来，不断增加对先天免疫方面的基础知识的认识，可能有助于更加完善小鼠免疫系统的人类化。总之，本发明描述了一种优化的、人类化转基因小鼠模型，小鼠中的H-2I类(小鼠@ 2m)和II类(H-2 IA ^b)基因被删除并被相应的人类基因HHD(HLA-A*0201)，HLA-DRA*0101 和 HLA_DRB1*0101 替代。HLA-A2. 1-/HLA-DR1-转基因 H-2I 类-/II 类-KO 小鼠的细胞免疫完全由人类HLA分子所限制，完全不具备鼠MHC分子所限制的免疫应答。缺少鼠类MHC和人类(转基因)HLA免疫应答之间的竞争使得可以用这种小鼠来确定人类疫苗的表位，人类疫苗需要HLA-限制性CD4+T辅助细胞和HLA-限制性CD8+T溶细胞性细胞之间的合作。“HLA”是人类MHC复合物，而“H_2”是小鼠MHC复合物。人类复合物包括三种I类a -链基因，HLA-A、HLA-B 和 HLA-C，和三对 MHC II 类 a-和 0 链基因HLA_DR、_DP 和-DQ。在许多单倍体中，HLA-DR簇包含一种额外的P链基因，其产物可与DRa链配对，因此这三组基因可生成四种MHC II类分子。在小鼠中，这三种I类a-链基因为H-2-L、H-2-D和H-2-K。小鼠 MHC II 类基因为 H-2-A 和 H-2-E。已知，作为多态性HLA抗原和不同HLA等位基因的结果，不同个体的HLA基因之间存在遗传差异。相应地，本发明所述的实施方式中的多态性HLA抗原或HLA等位基因可能会从一种换为另一种。HLA多态现象和等位基因的例子可在以下地方找到例如http://www. anthonynolan. org. uk/HIG/data. Html、http://www. ebi. ac. uk/imgt/hla、Geneticdiversity of HLA !Functional and Medical Implication,Dominique Charon(Ed. ),EDKMedical and Scientific International Publisher, and The HLA FactsBook, Steven
G.E. Marsh, Peter Parham and Linda Barber, AP Academic Press,2000。“断裂的(disrupted) ”基因是一种通过同源重组或其它已知方法进行突变的基因。断裂的基因可能是基因的下效等位基因或基因的无效等位基因。专业人员将发现将要使用的等位基因的类型，并根据任何特定的环境进行选择。在本发明的许多实施方式中，优选的是无效等位基因。“同源重组”是一种通用的对预先选中的、需要的细胞基因序列进行靶向突变，以得到转基因动物的方法(Mansour, S. L. et al.，Nature 336 :348-352(1988) ；Capecchi,M. R. , Trends Genet. 5 :70-76(1989) ；Capecchi, M. R. , Science 244 1288-1292(1989)；Capecchi, M. R. etal. , In Current Communications in Molecular Biology, Capecchi,M.R. (ed.)，Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989)，pp.45-52 ；Frohman, M. A. etal.，Cell56 :145-147 (1989))。现在，想要改变小鼠的任何基因都是可行的(Capecchi, M. R. , Trends Genet. 5 70-76(1989) ；Frohman, M. A. etal.，Cell 56 :145-147 (1989))。基因打靶涉及到标准 DNA重组技术的使用，以将所需的突变引入到选中的基因座中的克隆DNA序列。随后，这种突变再通过同源重组传入多能胚胎源性干细胞(ES)的基因组中。改变后的干细胞通过显微注射进入小鼠胚泡中并成为发育中的小鼠胚胎的一部分，最终形成嵌合体动物。在有的情况下，该嵌合体动物的生殖谱系细胞将从遗传改变的ES细胞分化而来，于是突变的基因型可、以通过生育来进行传递。基因打靶已被用于培育将nptll基因嵌入￠2-微球蛋白基因座的嵌合体和转基因小鼠(Koller, B. H. etal. , Proc. Natl. Acad. Sci. (U. S. A.) 86 =8932-8935 (1989)；Zijistra, M. et al. , Nature 342 :435-438(1989) ；Zijfstra, M. et al. , Nature 344 742-746(1989) ；DeChiaba etal. ,Nature 345 :78-80 (1990))。类似的试验可用于培育包含被嵌入nptll基因破坏的ac-abl基因的嵌合体和转基因动物(Schwartzberg,P. L. etal.,Science 246 :799-803 (1989))。这种技术被用于培育en_2基因被嵌入的nptll基因打断的嵌合体小鼠(Joyner, A. L. etal.，Nature 338 :153-155 (1989))。采用“基因打靶”方法，必须对兴趣基因预先进行克隆，并确定内含子及外显子边界。这种方法的结果是将标志基因(如nptll基因)嵌入感兴趣的特定基因的转译区。这、样，使用基因打靶方法就造成了对感兴趣的基因的破坏。使用基因打靶来改变细胞的基因显著地引起了该基因序列结构的变化。基因打靶的效果取决于一系列的可变因素，并且根据结构不同而不同。本发明中的嵌合体或转基因动物细胞通过向细胞(可能是前体多能细胞，如ES细胞，或者同等细胞)中引入一种或多种DNA分子制备的(Robertson, E. J. , In CurrentCommunications in Molecular Biology, Capecchi, M. R. (ed.), Cold Spring HarborPress, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989)，pp. 39-44)。“前体”只是表明多能细胞是所需要的(转染的)多能细胞的前体，是按照本发明的指导来培育的。多能(前体或转换后的)细胞可以按照已知的方法(Evans,M. J. etal. , Nature 292 :154-156(1981))在体内进行培育以形成嵌合体或转基因动物。任何ES细胞都可以按照本发明的指导使用。但是，优先选择ES细胞的原代分离株。这种初期分离细胞可直接从胚胎中获得，如CCE细胞株(Robertson, E. J. , In CurrentCommunications in Molecular Biology, Capecchi, M. R. (ed.), Cold Spring HarborPress, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989)，pp. 39-44)，或从 CCE 细胞株中的 ES 细胞克隆分离株中得来(Schwartzberg, P. A. etal.，Science 246 :799-803 (1989),将该文通过引用并入本文)。这种克隆分离株可根据E. J. Robertson的方法(In Teratocarcinomas andEmbryonic Stem Cells A Practical Approach, (E.J. Robertson, Ed.), IRL Press,Oxford, 1987)来实现，该参考和方法均在此引用作为参考。这种克隆繁殖的目的是为了获得能够高效分化形成动物的ES细胞。同源选择的ES细胞形成转基因动物的效率是CCE祖细胞株的约10倍。对于本发明中重组方法的目的，克隆选择不具有优势。从胚胎中克隆获得的ES细胞株的一个例子是ES细胞株，ABl(hprt+)或AB2. I (hprt-)。ES细胞最好是在基质细胞(如STO细胞(尤其是SNC4ST0细胞)和/或原代胚胎成纤维细胞)上进行培育。如E. J. Robertson所描述的那样(In Teratocarcinomasand Embryonic Stem Cells A Practical Approach, (E.J. Robertson, Ed. , IRL Press,Oxford, 1987, pp 71-112)，在此引用作为参考。嵌合小鼠的培育和分析方法在Bradley，A的文献中进行了介绍(In Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells A PracticalApproach, (E. J. Robertson, Ed. ), IRL Press, Oxford, 1987, pp 113-151),在此引用作为参考。基质(和/或成纤维)细胞的作用是消灭异常ES细胞的克隆性生长。最好是在存在白细胞抑制因子("Iif")的环境中培育细胞(Gough，N.M. etal.，Reprod. FertiI.Dev. I :281-288(1989) ；Yamamori, Y. et al.，Science 246 :1412-1416 (1989)，在此引用作为参考)。既然基因编码Iif已被克隆(Gough, N. M. et al. , Reprod. Fertig. Dev. I 281-288 (1989))，特别建议根据已知的方法，用这种基因来转化基质细胞，然后在转化后的可分泌Iif入培养基的基质细胞上培育ES细胞。本处使用的“转基因”指的是部分或完全异源的核酸序列，S卩，与它所引入的转基因动物或细胞完全异质，或与被引入的转基因动物或细胞的内源基因同源，但将被或已被嵌入动物基因组以改变被嵌入细胞的基因组的核酸序列(如被嵌入与自然基因不同的部位或其嵌入造成基因缺失)。转基因可以通过操作与一种或多种转录调节序列和任何其它能最佳表达所选核酸而所需的核酸(如内含子)相连。本发明的示范转基因编码含有H-2多肽。其它示范转基因被用于通过与HLA基因的基因组序列同源重组来破坏一种或多种HLA基因。“功能性转基因”是产生mRNA转录物，这种转录物又能在包含转基因的小鼠的至少一个细胞中生成适当处理的蛋白质的基因。专业人员将发现到各种已知转录调节元件和指导转录后处理的序列提供了很多指导宿主小鼠表达转基因的选择。在本发明的许多实施方 式中，在H-2基因调节元件控制下进行HLA转基因表达可被优先考虑。在一些实施方式中，HLA I类转基因是HLA-A2转基因，而HLA II类转基因是HLA-DRl转基因。HLA-A2转基因的一个例子是一种包含序列表中提供的HLA-A2序列的基因。HLA-DRl转基因的一个例子是一种包含序列表中提供的HLA-DRl序列的基因。在一个实施方式中，本发明提供了一种缺乏H2I类和II类分子，但包含功能性HLA I类转基因和功能性HLA II类转基因的转基因小鼠。在一些实施方式中，小鼠具有HLA-A2+HLA-DR1+P2m° IAP °基因型。在其它实施方式中，HLA-A2转基因包含序列表中提供的HLA-A2序列，而HLA-DRl转基因包含序列表中提供的HLA-DRl序列。本发明还提供了分离的转基因小鼠细胞。在有的情况中的细胞包含断裂的H2 I类基因、断裂的H2 II类基因和功能性HLA I或II类转基因。在另一些情况中，细胞包含断裂的H2 I类基因，断裂的H2 II类基因、功能性HLA I类转基因和功能性HLA II类转基因。HLA I类转基因可以是HLA-A2转基因，而HLA II类转基因可以是HLA-DRl转基因。在一些情况中，HLA-A2转基因包含序列表中提供的HLA-A2序列，而HLA-DRl转基因包含序列表中提供的HLA-DRl序列。在一个实施方式中，本发明提供了一种缺乏H2 I类和II类分子，但包含功能性HLA I类转基因和功能性HLA II类转基因的分离的转基因小鼠细胞。这种分离的转基因小鼠细胞包含HLA-A2+HLA-DR1+P2m° IAP °基因型。HLA-A2转基因可包含序列表中提供的HLA-A2序列，而HLA-DRl转基因可包含序列表中提供的HLA-DRl序列。本发明中的分离的转基因小鼠细胞可具有本发明中的任何小鼠的基因型。但是，本发明中的分离的小鼠细胞的基因型和本发明中小鼠的基因型不需要完全重叠。本发明中的分离的小鼠细胞可以从小鼠或小鼠胚胎中获得。在一个实施方式中，小鼠或小鼠胚胎具有与将要获取的细胞一样的基因型。在另一个实施方式中，小鼠或小鼠胚胎具有与将要获得的细胞不同的基因型。当细胞从小鼠或小鼠胚胎中获得后，细胞的基因可以通过如同源重组的方法破坏。另外，功能性转基因可通过，如转染的方法被引入细胞的基因组中。专业人员将发现任何已知的适当的方法都可被用于修改细胞的基因组，并由此获得具有理想基因型的分离的小鼠细胞。本发明的另一个目标是缺乏H2 I类和II类分子，但包含功能性HLAI类转基因和功能性HLA II类转基因的分离的转基因小鼠细胞。在一些实施方式中，转基因小鼠细胞具有HLA-A2+HLA-DR1+P2m° IAP °基因型。在其它实施方式中，HLA-A2转基因包含序列表中提供的HLA-A2序列，而HLA-DRl转基因包含序列表中提供的HLA-DRl序列。T细胞在获得性免疫的很多方 面都具有重要的作用，实现了多种调节和防御功能。当有的T细胞遇到感染或癌性细胞，它们会将其视为外来物并发挥杀手细胞的作用，作为细胞性免疫应答的一部分，杀死宿主本身的细胞。其它T细胞，如T辅助细胞，将通过刺激B细胞产生抗体或者抑制体液或细胞免疫应答的某些方面，而对外来抗原作出应答。T辅助细胞(Th)通过产生细胞因子协调多数免疫应答。尽管通常可根据携带⑶4细胞表面标记物识别，这些细胞根据它们生成的细胞因子和它们对于免疫系统的其它细胞的影响，从功能上被分为Thl或Th2亚群。Thl细胞通过被称为T细胞抗原受体的识别系统检测入侵的病原体或癌性宿主细胞。被称为细胞免疫的Thl-相关免疫过程通常涉及非-B细胞的激活作用，并常常以生成IFN-Y作为特征。但是，尽管Thl系统基本上独立于体液性抗体的生成，Thl细胞因子确实促进了向lgG2a同种型的免疫球蛋白转换。检测到外来抗原后，大多数成熟的Thl细胞将指导释放出IL-2、IL-3、IFN-Y、TNF-^、GM-CSF、高水平的TNF-a ,MIP-I a、MIP_1 ^和RANTES。这些细胞因子将促进迟发型超敏反应和普通细胞介导免疫。例如IL_2是一种细胞生长因子，它可促进对初期检测出来的特定的抗原敏感的T细胞克隆的生成。致敏T细胞附在细胞上并攻击带有这种抗原的细胞或病菌。相反，成熟的Th2 细胞可促进 IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、GM-CSF和低水平TNF- a的分泌。另外，Th2应答通过激活B细胞、刺激抗体的生成和分泌、以及引导向IgA、IgG1和IgE同种型的类型转换来促进体液免疫。此处使用的“抗原”包含1)至少一种HTL抗原表位、或2)至少一种CTL抗原表位、或3)至少一种B细胞抗原表位、或4)至少一种HTL抗原表位和至少一种CTL抗原表位、或5)至少一种HTL抗原表位和至少一种B细胞抗原表位、或6)至少一种CTL抗原表位和至少一种B细胞抗原表位、或7)至少一种HTL抗原表位和至少一种CTL抗原表位和至少一种B细胞抗原表位。“候选抗原”是一种处于调查阶段，确定其是否能作为抗原的分子。“体液免疫应答”是一种抗体-介导的特异性免疫。“抗原表位”是被免疫系统识别出来的抗原上的一个位点。抗体抗原表位是被抗体识别出来的抗原上的一个位点。T-细胞抗原表位是抗原上与MHC分子相连的一个位点。TH抗原表位是与MHC II类分子相连的位点。CTL抗原表位是与MHC I类分子相连的位点。抗原可以包含多肽序列或多核苷酸序列(可含有RNA、DNA、或RNA和DNA)。在一个实施方式中，抗原至少包含一种编码包含一种或多种抗原多肽的多核苷酸序列。在本文中，“包含”指的是宿主细胞的转录和/翻译工具通过与编码至少一种抗原多肽的外源多核苷酸提供了至少一种抗原多肽。如以下专利中所描述U. S.专利No. 6，194，389and 6，214,808。本发明中的抗原可以是任何抗原分子。抗原分子包括蛋白质、脂蛋白、糖蛋白(包括病毒的、细菌的、寄生的、动物)和真菌蛋白(如白蛋白、破伤风毒素、破伤风毒素、百日咳菌、细菌外膜蛋白(包括脑膜炎球菌外膜蛋白)、RSV-F蛋白、疟疾衍生肽、B-乳球蛋白
B、抑酞酶、卵白蛋白、溶菌酶和肿瘤相关抗原(如癌胚抗原(CEA)、CA 15-3、CA125、CA19-9、前列腺特异性抗原(PSA)和TAA复合物(U.S.专利No. 5，478，556，在此全文引用作为参考)；碳水化合物(包括天然的和合成多糖以及其它聚合物，如聚蔗糖、葡聚糖、羧甲基纤维素、琼脂糖、聚丙烯酰胺和其它丙烯酸树脂、丙交酯-乙交酯共聚物、聚乙烯醇、局部水解聚醋酸乙烯酯、polyvinyl pryrolidine、B类葡萄球菌和肺炎球菌荚膜多糖(包括III型)、铜绿假单胞菌胞外粘液多糖和荚膜多糖(包括fisher type I)和流感(嗜血)杆菌多糖(包括PRP);半抗原和其它包含低分子重量分子，如TNP、糖、低聚糖、多糖、肽、毒素、药物、化学药品和变应原；以及从细菌、立克次(氏)体、真菌、病毒、寄生虫中衍生出来的半抗原和抗原，包括白喉、百日咳、破伤风、乙型流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、大肠杆菌、克雷白(氏)杆菌属、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、脑膜炎双球菌、脊髓灰质炎、腮腺炎、麻疹、风疹、呼吸道合胞病毒、狂犬病、伊波拉出血症、炭疽、李斯特菌属、甲/乙/丙型肝炎、I类/II类人免疫缺陷症病毒、1/2型单纯性疱疹、巨细胞病毒、EB病毒(非洲淋巴细胞瘤病毒)、 水痘带状疱疹、疟疾、结核、白色念珠菌和其它念珠菌属、卡氏肺孢子虫，支原菌、A/B流行感冒病毒，腺病毒、A组链球菌属、B组链球菌属、假单胞菌aeryinosa、鼻病毒属、利什曼原虫属、1/2/3型副流感、冠形病毒、门(氏)菌、志贺(氏)杆菌、轮状病毒、弓形体属、肠道病毒，和沙眼衣原体和肺炎衣原体。此处的药物合剂或疫苗包含至少一种免疫组分，这种组分能溶解、悬浮或与药学上可接受的载体相结合。任何药学上可采用的载体都能被用于给药。合适的药物载体在下文中进行了描述Remington, s Pharmaceutical Sciences, 18th Edition (A. Gennaro,ed. , 1990)Mack Pub. , Easton, Pa.,在此将其全文通过引用并入本文。载体可以是无菌液体，如水、聚乙二醇、二甲基亚砜(DMSO)J (包括石油、动物油、植物油、花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等)。载体可以以雾状、喷雾剂、粉状、蜡状、膏状、栓剂、埋植剂、对氧水杨酸钠、软膏、片状、敷剂、膜状或化妆品制剂的形态存在。药物合剂或疫苗的适当组成取决于所选择的给药途径。例如当通过单次快速静脉注射或连续输注进行静脉给药时，药物最好是水溶性的，并且最好选择盐水作为载体。对于经皮、鼻内、口腔、胃、阴道内、直肠内或其它通过粘膜给药，可选择适当的能透过屏障的渗透剂作为药物成分。对于口服给药，活性成分可与适于加入片剂、丸剂、糖衣片、胶囊、液体、凝胶剂、糖浆剂、混悬液的载体结合使用。时间敏感的给药系统也可用于本发明的合剂给药。代表系统包括聚合物基材系统，如聚(丙交酯糖苷)、copolyoxalates、聚已酸内酯、聚酯酰胺、多正酯类、聚-3-羟基丁酸和聚酐。这些及类似聚合物可根据已知的方法(如U. S.专利No. 5，075，109中的方法，在此全文引用作为参考)制成微包囊。适于本发明中的免疫刺激复合物的多选择给药系统包括在以下专利中提到的方法U. S.专利 No. 6，194，389，6，024，983 5，817，637，6，228，621，5，804，212，5，709，879，5，703，055，5，643，605，5，643，574，5，580，563，5，239，660，5，204，253，4，748，043，4，667，014，4，452，775，3，854，480，和3，832，252 (在此均全文应用作为参考)。葡萄糖水溶液和甘油溶液也可被作为液体载体使用，尤其是用于注射液和气溶胶溶液。对于通过气溶胶(使用自动喷雾罐或喷雾器)给药，专业人员可酌情加入适当的喷射剂。免疫复合物中还可以加入增溶剂、乳化剂、稳定剂；分散剂、调味剂；佐剂；载体；局麻剂(如赛鲁卡因、利多卡因等)；抗生素或其它已知或可疑的抗病毒、抗真菌、抗寄生物或抗肿瘤复合物进行配置。“佐剂”是一种可促进或增强对目标抗原的免疫应答的复合物。专业人员能选择适当的佐剂进行本发明中的实践。本发明包括通过施用本发明中的一种或多种抗原，对需要免疫刺激的病人进行治疗的方法。本处的治疗包括与任何疾病、状况、异常或症状相关的矫正、滋补、改善和预防方法。治疗还进一步包括在试验动物或体外引起或抑制免疫应答。因此，治疗包括通过任何普通专业人员所熟知的方法(通常包括口服或鼻内途径、以及静脉、肌肉和皮下注射，但也包括腹膜内、体内、关节间、心室内、鞘内、表面、扁桃体、粘膜、经皮、阴道内及管饲法途径)给予免疫刺激量的本发明中的任何免疫刺激复合物。熟练的专业人员都知道，选择适当的给药方法对治疗的效果有帮助，对一些应用应优先选择局部给药。可采用的局部给药途径包括皮下、皮内、腹膜内、玻璃体内、吸入或灌洗、口服、鼻内给药以及向预先确定的组织、器官、关节、肿块或细胞群的定向注射。例如，粘膜应用或向粘膜淋巴节或派伊尔(氏)淋巴集结中注射可以促进体液免疫应答，引起实质性的IgA类转换。或者，向伤口、病灶或身体感染部位进行靶注射可以用于治疗实体瘤、局限性感染或其它需要免疫刺激的部位。或者，免疫系统细胞(如T细胞、B细胞、NK细胞或少突胶质细胞)可以从宿主中取出，并在体外进行处理。处理过的细胞可进一步进行培养或重新输入病人体内(或输入异源宿主中)以提供对病人或宿主的免疫刺激。例如，骨髓细胞可以被从病人身上抽出，并使用HDR进行处理以刺激全身或特异性免疫。高剂量辐射或类似处理可被用于毁坏病人体内剩余的免疫细胞。在重新植入后，自体刺激细胞在病人体内将恢复正常的免疫功能。或者，从癌症病人体内分离NK和/或T细胞可在体外暴露于一种或多种病人癌症的特异性抗原中。在被重新植入病人体内后，抗原刺激细胞将对癌症细胞产生强大的分子免疫应答。免疫刺激(有效)量指的是能在病人体内引起免疫应答，足以阻止、改善或治疗致病攻击、过敏症、或免疫异常的疫苗的量。免疫刺激量指的是，与将抗原施用于未预先使用疫苗治疗病人所获得的应答相比，能提供可测定的对抗原的至少一种抗原表位的体液或分子免疫应答提高的量。因此，举例来说，免疫刺激量指的是能促进针对感兴趣的抗原表位的抗体的生成，或能激发可测定的对致病或致敏刺激的保护作用，或能促进针对感兴趣的抗原表位的CTL应答的含抗原药物的量。使用本发明中的免疫刺激量的含抗原药物进行治疗包括引起宿主(尤其是包含至少一种免疫系统细胞或细胞株衍生物的体外组织培养宿主细胞)内免疫应答的任何直接、间接或统计学上可见或可测量的增长或其它想要的变化。宿主细胞可以从人类或动物外周血、淋巴结或类似物中衍生出来。优先选择的组织培养宿主细胞包括新提取的T细胞、B细胞、巨噬细胞、少突胶质细胞、NK细胞和单核细胞。每种都可以使用标准技术分离或提纯出来。可见的或可测的应答包括B或T细胞增殖或激活；抗体分泌增加；同型体转换；细胞因子释放增多，尤其是一种或多种IL-I，IL-2，IL-3，IL-4，IL_5，IL_6，IL_9，IL-10，IL-12, IL-13, GM-CSF, IFN- y，TNF- a，TNF- ^，GM-CSF, MIP-I a，MIP-I ^，或 RANTES 释放增多；对特异性抗原的抗体滴度或亲和力增加；与致病感染相关的发病或死亡率降低；促进、引起、维持或延长病毒潜伏期；抑制或改善恶性和良性肿瘤的生长、转移或作用；以及提供对疾病或疾病效应的预防性保护。当需要抑制免疫应答时，如，在自身免疫性疾病或过敏症的治疗中，有效剂量还包括足以引起可测量或可观察的与待治疗的病况或病理有关的应答降低。含抗原药物的剂量及给药频率可以按经验来确定，并考虑到所治疗病人的年龄和身材，以及病情或所治疗的疾病。适当的剂量在0.01微克至100微克/次接种范围内，但也可略高于或低于这个量。第二次加强免疫可在间隔一周至数月后进行。以下实施例对本发明中的某些实施方式进行了说明。普通的专业人员将识别出在不改变本发明本质和范围的前提下进行的各种修改和变动。这些修改和变动被认为属于本发明的范围以内。这些实施例不对本发明造成限制。实施例以下实验技术和试剂被用于说明本发明中的某些非限制性实施方式。转基因小鼠HLA-DRl-转基因 H-2II 类-KO(IAP b° )小鼠由 HLA-DR1-转基因小鼠(Altmann，
D.M. et al.，J Exp Med 181,867-875(1995))和 H-2II 类-KO(IA3 b。)小鼠(Rohrlich,P. S. etal. , Int TmmunoI 15, 765-772 (2003))在 Institute Pasteur of Lille 杂交得来。培育表达嵌合体单链(HHD分子HLA_A2. I的a I-a 2结构域、H_2Db的胞浆区的a 3，依靠15个氨基酸的肽接头以其N末端与人0 2m C末端相连)的HLA-A21-转基因小鼠。将HLA-A2. I (HHD)-转基因 H-2 I 类-KO 和 HLA-DR1-转基因 H2 II 类-KO(IA ^ b° )小鼠进行杂交筛选直到得到 HLA-A2. rA/HLA-DRl+l转基因 H-2-I 类(P 2m°) -/II 类(IA ^ °) -KO 小鼠，用于此处所述的试验。使用HLA-A2. 1+/_单转基因H-2-I(02m°)-/II(IAP°)-KO小鼠作为保护性测定中的对照组。在Institut Pasteur巴黎的动物实验室中培育小鼠；所有实验设计经过Institut Pasteur权威机构评估,符合法国和欧洲关于动物福利的法规和公共卫生服务建议。基因分型使用PCR 检测 HLA-DRB 1*0101、HLA-DRA*0101 和 HLA_A*0201 转基因。在 56 °C，IOOmMNaCl、50mM Tris-HCI pH7. 2, IOOmM EDTA，I % SDS 和 0. 5mg/ml 蛋白酶 K 孵育过夜，再加入250微升饱和NaCl溶液和异丙醇沉淀提取尾DNA。将样品在70%的酒精中洗三次，并在 150 微升 IOmM Tris-HCI, ImM EDTA pH8 中重悬起来。PCR 条件为I. 5mMMgCl2、I. 25U 的Taq聚合酶、生产商(InVitrogen, Carisbad, CA)提供的缓冲液、I个循环(7min, 94°C ), 40个循环(30sec，94°C;30sec，60°C;lmin，72°C )，1 个循环(4min，72°C )，使用正向引物和反向引物，对 HHD :5，CATTGA GAC AGA GCG GTT GGC CAC GAA GCA G 3，和 5，GGA TGACGT GAGTAA ACC TGA ATC TTT GGA GTA CGC 3’和对HLA_DRB1*0101 :5’TTC TTC AAC GGG ACG GAGCGG GTG 3’ 和 5’ CTG CAC TGT GAA GCT ACC AAC 3’，和对 HLA_DRA*0101 :5’ CTCCAA GCCCTC TCC CAG AG 3，和 5，ATG TGC CTT ACA GAG GCC CC3，。FACS 分析使用、FITC-结合 W6/32(anti-HLA-ABC，Sigma, St Louis, MO)和生物素化抗-28-8-6S(anti-H-2Kb/Db，BD Biosciences, San Diego, CA)m. Ab 在去除了红细胞的、淋巴细胞M-提纯(Tebu-bio, Le Perray en Yvelines, France)的脾细胞上进行流式细胞分析研究。使用 PE-标记的 CT-CD4 抗-小鼠 CD4(CALTAG，South San Francisco, CA)和FITC-标记的 53-6. 7 抗-小鼠 CD8m. Ab (BD Biosciences)对 CD4+ 和 CD8+T 淋巴细胞进行染色。MHCII类分子表达的分析通过质谱柱阳性选择B220+B淋巴细胞实现(MiltenylBiotec, Bergisch Gladbach, Germany)。用 2. 4G2 m. Ab 与 Fe 受体饱和结合，HLA-DRl 和H-2 IAb的表达可以用FITC标记的L243 (抗HLA-DR)和PE标记的AF6-120. I (抗H-IA ^ b)(BD Bioscciences)进行分析。使用 FACS Calibur (Becton Dickinson,Bedford,MA)对多聚甲醛固定细胞进行分析。免疫扫描分析在自动-Macs (Miltenyi Biotec)上阳性选择来自未经免疫处理的小鼠的⑶4+和Q)8+T细胞,使用RNA简易工具包(Qiagen, Hilden, Germany)处理RNA,并用于cDNA合成。使用BV片段家族特异性正向引物和两个BC片段共享的反向引物对cDNA进行PCR-扩增。PCR产物为从属于内在的BC FAM-标记引物的延续产物。延续产物加入6%丙烯酰胺/8M尿素凝胶中电泳(7h,35w)分离，使用 373A DNA测序仪(PerkinElmer Applied Biosystem,Foster City, CA)检测。使用免疫扫描软件(Pannetier, C. etal. , ProcNatlAcad Sci U S A 90,4319-4323(1993))进行数据分析。肽HLA-A2 结合肽 HBsAg348_357GLSPTVWLSV 和 HBsAg335_343WLSLLVPFV，H_2Kb 结合肽 HBsAg371_378ILSPFLPL，HLA-DRl 结合肽 HBsAg18(l_195QAGFFLLTRILTIPQS，H-2 IAb 结合肽HBsAg126^138REGLYFPAGGSSSG 以及 preS2 肽 HBsAg1(l9_134MQWNSTTFHQTLQDPRVRGLYFPAGG 是通过Neo系统(Strasbourg, France)合成的，并溶解于浓度为lmg/ml的PBS-10% DMSO中。妝的氨基酸序列编号从HBV ayw亚型preSl域的第一个甲硫氨酸开始。使用编码HBV的S2-S蛋白的DNA进行免疫在人类CMV早期快反应基因控制下表达preS2和S HBV表面抗原的pCMV_S2. S质粒载体(Michel, M. L. etal. , ProcNatlAcad Sci U S A 92,5307-5311 (1995))编码通过质粒Giga Kit柱在没有内毒素的条件下提纯。如前所述，对小鼠的再生胫骨前肌进行注射普鲁卡因麻醉(50 微克每侧)(Davis, H. L.，Michel, M. L. &ffhalen, R. G.，Hum Mol Genet 2，1847-1851(1993))。T细胞增殖测定最后免疫的12天后，在加入10% FCSUOmM HEPES，ImM丙酮酸钠、5x1 (T5M 2-巯基乙醇、100I.U/ml青霉素和100微克链霉素的RPMI培养基中同时培养去除了红血细胞的、聚鹿糖提纯脾细胞(5. 106细胞/25cm2培养瓶(Techno Plastic Products (TPP),Trasadingen, Switzerland))和肽-脉冲(20,微克/ml)、福射(180Gy) LPS-胚细胞(5. IO6细胞/培养瓶)。第七天，用于增殖分析细胞分于平底96孔板中，每孔5xl05细胞，含3% FCS不完全RPMI培养基中肽冲击、放射线照射并用内毒素(每孔2xl05细胞)处理细胞72小时。每孔细胞用ICi 3H标记的胸腺嘧啶处理16小时，然后用带滤膜的TOMTEC收集器(Perkin Elmer Applied Biosystem)收集细胞，用micro-0 计数器(Perkin ElmerApplied Biosystem)检测参入的放射性。结果以刺激指数(SI)形式给出，SI =特异性肽的cpm/不相关肽的cpm。CTL活动测量
对进行增殖测定的同一免疫脾细胞群进行细胞毒性测定。使用与增殖测定相同的补充RPMI培养基同时培养应答细胞(5. 106细胞/25cm2培养瓶，TPP)和刺激性肽-脉冲(20，微克/ml) y -辐射(180Gy) LPS-胚细胞(5. 106细胞/培养瓶)7天。在针对10微克/ml试验或对照肽脉冲的RMA-S HHD靶细胞的标准4h51Cr测定中检测溶细胞活动。特异性溶解，以％为单位，被重复计算，依据[试验性-自发释放]/[最高自发性释放]xlOO，减去使用对照肽观察到的非特异性溶解。体内抗体产生测量在DNA注射前后的不同时间，使用加肝素的玻璃吸管对小数进行眼球后穿刺，采集血样，并通过特异性ELISA对离心法恢复的血清进行抗HBs和抗-preS2测定。使用带HBV小S蛋白(I微克/ml)或preS2 (120-145)合成肽(I微克/ml)的提纯重组体颗粒作为固相。在使用追加了 10% FCS的PBST(含有0. 1% Tween 20的PBS)进行阻断后，加入系列稀释剂。在广泛冲洗后，使用辣根过氧化物酶(Amersham,LittleChalfont,UK)标记的抗小鼠Ig(总IgG)对联结抗体进行检测。使用系列终点稀释法确定抗体滴度。单独检测小 鼠血清，滴度是进行至少三次测定的平均值。血清稀释在1/100以下被视为阴性。抗体滴度使用ELISA (Michel, M. L. etal) ，Proc Natl Acad Sci U S A92,5307-5311 (1995))在提纯的HBV中、小蛋白或preS2合成HBs1(l9_134肽上对免疫小鼠血清分别进行了测定。在使用含有0. I % Tween 20，10% FCS的PBS进行封闭并冲洗三次后，使用辣根过氧化物酶-标记的抗-小鼠IgG (Amersham, Little Chalfont, UK)对连接抗体进行检测。抗体滴度(至少三次测定的平均值)由系列终点稀释法确定。滴度在1/100以下被视为阴性。痘苗攻击及噬菌斑测定在最后一次注射12 天后，以 IO7PFU 表达 HBsAg(Smith, G. L. , Mackett, M. &Moss,
B., Nature 302,490-495 (1983))或 HBx 蛋白(Schek, N. , Bartenschlager, R. , Kuhn,
C.&Schaller,H. ,Oncogene 6,1735-1744. (1991))(分别由 Dr B. Moss和Dr H. SchalIer提供)的重组体痘苗病毒(Western Reserve strain)对DNA-注射小鼠进行腹膜内攻击。四天后，采用BHK 21细胞的噬菌斑测定分析卵巢的rVV滴度(Buller，R. M. &ffallace, G. D.，Lab Anim Sci 35,473-476(1985)。实施例I :细胞表面MHC分子表达通过流式细胞术评估在脾细胞表面的HLA-A2. I、H_2Kb/Db、HLA-DRl和H_2 IAb分子的表达。如图Ia所示，在HLA-A2. 1-/HLA-DR1-转基因，H-2 I类/11类-KO小鼠和HLA-A2. I-转基因，H-2 I类-KO小鼠身上观察到相近水平的HLA-A2. I表达，但未观察到HLA-A2. Ib表达，而且只在HLA-DRl-转基因、H_2 II类-KO小鼠身上观察到了 H_2Kb/Db表达。在B220+-浓缩B细胞上对细胞表面的HLA-DRl和H_2 IAb表达进行测量。如图Ib所示，在 HLA-A2. 1-/HLA-DR1-转基因、H-2 I 类-/II 类-KO 小鼠和 HLA-DR1-转基因、H_2 II类-KO小鼠身上观察到相近水平的HLA-DRl表达，但在HLA-A2. I-转基因、H-2 I类-KO类小鼠身上未观察到该表达。但是，细胞表面的转基因分子(尤其是HLA-DR1)表达低于内源性H-2 I类和II类分子表达。实施例2 :⑶4+和⑶8外周淋巴细胞
如图2a所示，通过免疫染色和流式细胞术分析对⑶4+和⑶8+外周脾淋巴细胞的
数量进行确定。HLA-A2. 1-/HLA-DR1-转基因、H-2 I 类-/II 类-KO 小鼠和 HLA-DR1-转基因、H-2II类-KO小鼠身上的⑶4+T淋巴细胞占了脾细胞总数的13-14%。相反，H-2 II类-KO小鼠身上的⑶4+细胞只占脾细胞总数的2-3% (数据未显示)，符合关于缺乏MHC II类分子小鼠的初期报告(Cosgrove, D. etal. , Cell 66,1051-1066(1991))。与预想的一样，转基因HLA-A2. I分子表达导致了⑶8+外周淋巴细胞数量的增加，在HLA-A2. 1-/HLA-DR1-转基因、H-2 I类-/II类-KO小鼠和HLA-A2. I-转基因、H-2 I类-KO类小鼠中均达到了脾细胞总数的2-3%，而在P 2微球蛋白2m)-KO MHC I类-缺失的小鼠身上只占了 0. 6_1 %(Pascolo, S.etal. ,J ExpMed 185,2043-2051(1997))。实施例I和2中的结果表明(1)HLA-A2+HLA-DR1+P 2m。IAP。小鼠的 HLA-A2 分子表达、H2_Kb 分子缺失、CD8+外周淋巴细胞数量以及⑶8+T组成成分的多样性，通常与HLA-A2+P 2m°小鼠相当；(2)在 HLA-A2+HLA-DRl+@ 2m° IAP ° 小鼠中，HLA-DR1 分子表达、H2_IAb 缺失、⑶4+T淋巴细胞的数量以及⑶4+组成成分的多样性，通常与HLA-DR1+IAP °小鼠相当；(3) HLA-A2+HLA-DR1+3 2m。IAP 。小鼠具有 HLA_A2+P2m。小鼠和HLA-DR1+IAP。小鼠身上的所有优点。实施例3 T淋巴细胞受体(TCR)BV片段使用由于单MHC I类分子和单MHC II类分子的存在会减少TCR组成成分的数量和多样性，按先前所述(Cochet, M. et al.，EurJ Immunol 22，2639-2647 (1992))，通过 RT-PCR免疫扫描技术在提纯CD4+或CD8+脾淋巴细胞上对各BV家族和CDR3长度多样性的表达进行研究。在CD8+(图2b)和CD4+(图2c)淋巴细胞中，大多数BV家族(15/20)都表现出了高斯分布的显著强度高峰。在外周T淋巴细胞观察到的这种分布图形，每一个波峰都是BV片段与3个核苷酸长度变化的⑶R3亚区的功能性重排的典型表现(Cochet，M. etal.，EurJ Immunol 22,2639-2647(1992))。观察到缺乏BV 5. 3和17分布(或者说其完全改变的分布趋势)是意料中的，因为这两个 BV 片段在 C57BL/6 小鼠中是假基因(Wade, T.，Bill, J.，Marrack, P. C.，Palmer,
E.&Kappler,J. ff. ,J Immunol 141,2165-2167(1988)) ；Chou,H. S. et al. ,Proc Natl AcadSci U S A 84,1992-1996 (1987) o而BV 5. 1、5. 2和11片段的改变的图形是由于对应的BV-表达T淋巴细胞亚群小而引起的(它们在C57BL/6小鼠中小于5%，在HLA-DRl-转基因H-2 II类-KO小鼠中占约2% )(数据未显示)。除了这些情况，HLA-A2. 1/HLA-DR1-转基因，H-2 I类/11类-KO小鼠的⑶4+和⑶8+淋巴细胞均分别显示出TCR BV链使用和⑶R3多样性，这与非-转基因C57BL/6小鼠的情况类似。实施例4 :功能表征对Ag HBs (乙肝病毒包膜蛋白)免疫的HLA-A2+HLA-DR1+P 2m° IAP °小鼠进行分析。图5显示了特异性体液应答，即如HBs S2抗体的生成所示。图6显示了 HBS348_357的特异性DRl-限制性CD4+T增殖应答。图7显示了 HBS348_357或HBS335_343的特异性HLA-A2-限制性CD8+细胞溶解T细胞应答。这些结果表明HLA-A2+HLA-DR1+P2m° IAP。小鼠可用于对免疫个体中的特异性体液应答、⑶4+T辅助细胞的Ag-特异性HLA-DRl-限制性应答以及Ag-特异性HLA-A2-限制性CD8+T细胞的细胞溶解应答进行同时分析。表1-3中提供了从小鼠身上获得的其它信息。表I.注射了 pcmv S2-S的HLA-A2+DR1+H-2 CI-CII-转基因小鼠中的对HBV病毒包膜HLA-DRl抗原表位的T⑶4+增殖应答
位置氨基酸序列应答者/试验小鼠刺激指数
109-134 MQWNSTTFHQTLQDPRVRGLYFPAGG (12/12)3-4
200-214 TSLNFLGGTTVCLGQ(6/12)3-4
16/31 QAGFFLLTRILTIPQS(12/12)3-6
337/357 SLLVPFVQWFVGLSPTVWLSV(5/12)4-5表2.注射了 pcmv S2-S的HLA-A2+DR1+H-2 CI-CII-转基因小鼠中的细胞溶解应答位置氨基酸序列应答者/试验小鼠最大溶解348-357 GLSPTVffLS (12/12)20-70%335-343 WLSLLVPVF (4/12)30%表3.注射pcmv S2-S的HLA-A2+DR1+H-2CI-CII转基因小鼠中的抗_PreS2抗体应答位置氨基酸序列应答者/试验小鼠preS2 MQWNSTTFHQTLQDPRVRGLYFPAGG(9/12)实施例5 :对HBsAg-DNA-疫苗的免疫应答为评估HLA-A2. 1-/HLA-DR1-转基因、H-2 I类/11类-KO小鼠的免疫能力，以及为将它们的体液、⑶4+和⑶8+T淋巴细胞应答与人类的这些应答相比较，使用HBsAg-DNA质体对小鼠进行免疫。这些质粒编码两种乙肝病毒包膜蛋白(preS2/S中蛋白和S/小蛋白)，所述蛋白在带有乙肝病毒表面抗原的颗粒内自组装。目前使用的乙肝病毒疫苗包含这两种蛋白。如图3a中的代表性小鼠所示，HBsAg-特异性抗体在注射HBsAg-DNA-疫苗(图3a，上)后第12天被首次测出，而这些抗体的滴度一直增加到第24天(第二次DNA免疫后的12天后，数据未显示)。这种早期的抗体应答对中HBV包膜蛋白所携带的preS2-B细胞抗原表位(HBsl09 134)和HBsAg颗粒具有特异性，与HBsAg-DNA-免疫小鼠(Michel，M. L. etal. ,ProcNatl Acad Sci U S A 92,5307-5311 (1995))和 HBsAg 免疫人类的类似应答(Mou Iia-Pe I at, J. P. etal. , Vaccine 12,499-502(1994))相符。检查对HBsAg 的 CD8+CTL 应答，确定 HLA-A2. 1-/HLA-DR1-转基因、H-2 I 类-/II类-KO类小鼠的CD8+外周淋巴细胞是否从功能上受到了转基因人类I类分子的限制。在HBV-感染HLA-A2. 1+人群中，免疫显性HLA-A2. I-限制性HBsAg-特异性CTL应答指向 HBsAg348_357 (Maini, M. K. etal. , Gastroenterology 117,1386-1396 (1999))和HBsAg335-343 (Nayersina,R. etal. ,J Immunol 150,4659-4671 (1993))月太(S卩，观察到了多抗原表位应答)。在C57BL/6小鼠中，H-2Kb-限制性HBsAg-特异性CTL应答指向HBsAg371_378
肽(Schirmbeck, R.，Wild, J. &Reimann, J.，Eur J Immunol 28,4149-4161(1998))。为评估人化小鼠是否可作出与人一样的应答，按照此处所描述的那样，使用相关的(HBsAg348_357，HLA-A2. I-限制性)、或对照的(HBsAg37卜378，H_2Kb_ 限制性；MAGE_3271_279，HLA-A2. I-限制性)肽对脾淋巴细胞进行7天的再刺激。图3a(中)表明HBsAg-DNA-免疫引起了强HBsAg348^357-特异 CTL 应答，但未引起对 HBsAg371_378 或 MAGE_3271_279 肽的应答。为确定HLA-A2. 1-/HLA-DR1-转基因、H-2 I类-/II类-KO小鼠中的外周CD4+T淋巴细胞是否会从功能上受到转基因人类II分子的限制，对针对HBsAg蛋白的CD4+T淋巴细胞应答进行检查。在HBs Ag-接种或HBV-感染HLA-DRl+人群中，免疫显性HLA-DRl-限制性 HBsAg-特异性 Q)4+T 淋巴细胞应答指向 HBsAg18(l_195 肽(Mm, ff. P. etal. , HumImmunol46，93-99 (1996))。在C57BL/6小鼠中，H_2IAb-限制性HBsAg-特异性CD4+T淋巴细胞应答指向 HBsAg126_138 肽(Milich, D. R.，Semin LiverDis 11,93-112(1991))。为将人化小鼠和人以及野生小鼠进行比较，使用相关(HBsAg18CI_195，HLA-DRl-限制性)或对照(HBsAg126.，H-21Ab-限制性；HIV IGag263^278, HLA-DRl-限制性)肽对脾T淋巴细胞进行体外再激活。图3a (下)显示了针对HLA-DRl-限制性HBsAg18(l_195肽的强增殖应答，而如预期那样，、H-2IAP-限制性肽未能有效的激发应答。同样，HIV I Gag263_278肽未能激发应答。另外，体外使用HBsAg18(l_195多肽增加一次免疫复活可使特异性增殖指数增加数倍(数据未显示)。在第一种HBsAg-DNA-免疫 HLA-A2. 1-/HLA-DR1-转基因 H-2 I 类-/II 类-KO 小鼠中已记录到HBsAg-特异性抗体、增殖应答及细胞溶解T细胞应答的发展和特异性，6只额外的HBsAg-DNA-免疫和6只未免疫对照组HLA-A2. 1-/HLA-DR1-转基因H-2 I类-/II类-KO小鼠也被分别作了针对以上三种应答的检测。如图3b所示，这三种应答同时出现在6只受试免疫动物身上，但未出现在对照组未免疫小鼠中。有趣的是，2只免疫小鼠能引起针对 HBsAg348^357 和 HBsAg335_343HLA-A2. I 限制性肽的 CTL 应答(图 3b，中)。实施例6:保护测定以上实施例记录了在HLA-A2. 1-/HLA-DR1-转基因、H-2 I类/11类-KO小鼠体内诱导的HBsAg-特异性体液、CD4+和CD8+T细胞应答，并表明它们是指向与自然感染或HBsAg-接种的人体的相同的免疫显性表位。本实施例测试了这些免疫应答能否给接种动物带来保护。因为小鼠并不感染HBV，这些试验采用了 HBsAg-重组体痘苗病毒(rVV-HBsAg)。两次通过肌肉注射100微克HBsAgDNA对小鼠进行免疫。免疫12天后，使用IO7PFU的rVV-HBsAg对小鼠进行腹膜内攻击。四天后，根据公布的方法确定病毒滴度并记录为“rVVPFU/卵巢”的形式(Buller, R. M. &ffallace, G. D. , Lab AnimSci 35,473-476 (1985)) 图4显示了试验结果。未经过HBsAg-DNA免疫的动物在攻击后显示出了 rVV_HBsAg复制。相反，HBsAg-DNA免疫小鼠的病毒滴度则要低超过4个数量级。这些结果强烈表明使用HBsAg-DNA进行免疫诱导了控制rVV-HBsAg感染的保护性HBsAg-特异性免疫应答。HBsAg-DNA免疫小鼠接受另一种HBx-重组痘苗病毒(rVV，编码乙型肝炎病毒x蛋白)的攻击的研究证实了 HBsAg-DNA免疫引起的特异性保护。与未免疫的对照组相比，HBsAg-DNA-免疫小鼠中未观察到rVV-HBx复制减少。实施例7 =HLA-DRl-限制性⑶4+T淋巴细胞对于抗体和CTL应答以及抵抗病毒感染的保护很关键为评估HLA-DRl-限制性T辅助淋巴细胞是否有助于人化小鼠中的抗体和CTL应答，对单(HLA-A2. I)和双(HLA-A2. 1/HLA-DR1)转基因H-2I类/11类-KO小鼠中的免疫应答和病毒感染的效力进行比较。如表4所示，在HLA-A2. 1-/HLA-DR1-双转基因、H-2 I类-/II类-KO小鼠中观察到了有力的HBsAg348357-特异性CTL应答，但在HLA-A2. I单转基因H-2 I类/11类-KO小鼠身上未发现。另外，在HBsAg-DNA-接种HLA-A2. I-单转基因H-2 I类-/II类-KO小鼠身上检测不到抗-HBs抗体。作为结果，HBsAg-DNA-免疫HLA-A2. I-单转基因H-2I类-/II类-KO小鼠未能得到抗rVV-HBsAg感染保护。表4HBsAg-DNA免疫小鼠的抗体、细胞溶解、增殖应答和抗rVV-HBsAg-攻击保护
.^ 特异性溶解(％) 增殖(SI) 抗体滴度 rVV-HBsAg
小鼠
348-357 335-343 179-194PFU/卵巢(IoglO) Al00I02.5.IO8
200I02.5.IO8
300I0IO8
400I02.5.IO8
500I0IO8
600I01.5.IO8
BI30154.72000IO4
21403.930003.IO3
33011475004.103
4502.565007.5.IO3
550306.3130007.5.IO2
640184160005.IO2
7672.915002.104
855325001.5.IO4
924364.53000< IO2
1023145150005.IO3
Cl00I0IO8
200I02.108
300I01.5.IO8
400I0IO8
500I02.5.IO8
600I0IO8使用IO7PFU 的 rVV-HBsAg 对未免疫的 HLA-A2. 1-/HLA-DR1-双转基因 H-2 I 类-/II 类-KO 小鼠(Al-6)、HBsAg-DNA-免疫的 IHLA-A2. 1-/HLA-DR1-双转基因 H-2 I 类-/II类-KO小鼠(B1-10)和HBsAg-DNA-免疫的HLA-A2. I-单转基因H-2 I类-/II类-KO小鼠(C 1-6)进行腹膜内攻击。四天后，使用HBsAg348_357 (免疫显性表位)或HBsAg335_343 (亚显性表位)对每个卵巢的噬菌斑形成单位数(PFU/卵巢)、细胞溶解、增殖脾T细胞应答和血清抗体滴度分别进行评估，加载了 HLA-A2. I-限制性肽的RMAS-HHD靶细胞(E/T比为30/1)用于细胞溶解测定，HBsAg179^194HLA-DRl-限制性肽用于增殖测定,preS2109_134肽用于确定抗体(IgG)滴度。
本申请中所引用的参考文献的全部内容、专利和公布的专利申请在此全文弓I用作为参考。
权利要求
1.ー种同时确定候选抗原或抗原组中是否存在ー种或多种抗原表位的方法，其中所述抗原表位可引起特异性体液应答、TH HLA-DRl限制性应答和/或CTRL HLA-A2限制性应答，该方法包括 a)给包含断裂的H2I类基因、断裂的H2 II类基因、功能性HLA-A2转基因和功能性HLA-DRl转基因的转基因小鼠或缺乏H2 I类和II类分子、但包含功能性HLA I类转基因和功能性HLA II类转基因、并具有HLA-A2+HLA-DRl+e2m° IA @。基因型的转基因小鼠施用候选抗原或抗原组； b)測定小鼠体内对该抗原的特异性体液应答； c)測定小鼠体内对该抗原的THHLA-DRl限制性应答；并 d)測定小鼠体内对该抗原的CTRLHLA-A2限制性应答； 其中，如在小鼠体内观察到对抗原的特异性体液应答，可确定抗原中存在引起体液应答的抗原表位； 如在小鼠体内观察到对抗原的TH HLA-DRl限制性应答，可确定抗原中存在引起THHLA-DRl限制性应答的抗原表位；而 如在小鼠体内观察到对抗原的CTRL HLA-A2限制性应答，可确定抗原中存在引起CTRLHLA-A2限制性应答的抗原表位。
2.权利要求I的方法，进ー步包括測定小鼠体内对抗原的Thl-特异性应答和測定小鼠体内对抗原的Th2-特异性应答； 其中，如在小鼠体内观察到对抗原的Thl-特异性应答，可确定抗原中存在引起小鼠体内Thl-特异性应答的抗原表位； 如在小鼠体内观察到对抗原的Th2-特异性应答，可确定抗原中存在引起小鼠体内Th2-特异性应答的抗原表位。
3.ー种确定候选抗原或抗原组中是否存在HLA DRl-限制性T辅助细胞抗原表位的方法，该方法包括 a)给包含断裂的H2I类基因、断裂的H2 II类基因、功能性HLA-A2转基因和功能性HLA-DRl转基因的转基因小鼠或缺乏H2 I类和II类分子、但包含功能性HLA I类转基因和功能性HLA II类转基因、并具有HLA-A2+HLA-DRl+e2m° IA @。基因型的转基因小鼠施用候选抗原或抗原组；并 b)測定小鼠体内对抗原的THHLA-DRl限制性T辅助细胞抗原表位应答； 其中，如在小鼠体内观察到对抗原的TH HLA-DRl限制性T辅助细胞抗原表位应答，可确定抗原中存在引起TH HLA-DRl限制性T辅助细胞抗原表位应答的抗原表位。
4.ー种确定候选抗原或候选抗原组中是否存在HLA-A2-限制性T细胞毒性(CTL)抗原表位的方法，该方法包括 a)给包含断裂的H2I类基因、断裂的H2 II类基因、功能性HLA-A2转基因和功能性HLA-DRl转基因的转基因小鼠或缺乏H2I类和II类分子、但包含功能性HLA I类转基因和功能性HLA II类转基因、并具有HLA-A2+HLA-DRl+e2m° IA @。基因型的转基因小鼠中施用候选抗原或候选抗原组；并 b)測定小鼠体内对抗原或抗原组的HLA-A2-限制性T细胞毒性(CTL)应答； 其中，如在小鼠体内观察到对抗原或抗原组的HLA-A2-限制性T细胞毒性(CTL)应答，可确定在抗原或抗原组中存在引起HLA-A2限制性T细胞毒性(CTL)应答的抗原表位。
5.一种比较由两种或两种以上疫苗诱导的T-辅助细胞应答的效カ的方法，该方法包括 a)给包含断裂的H2I类基因、断裂的H2 II类基因、功能性HLA-A2转基因和功能性HLA-DRl转基因的转基因小鼠或缺乏H2 I类和II类分子、但包含功能性HLA I类转基因和功能性HLA II类转基因、并具有HLA-A2+HLA-DRl+e2m° IA @。基因型的转基因小鼠施用第一种候选疫苗，并测量小鼠体内由第一种候选疫苗诱导的T-辅助细胞应答； b)给包含断裂的H2I类基因、断裂的H2 II类基因、功能性HLA-A2转基因和功能性HLA-DRl转基因的转基因小鼠或缺乏H2 I类和II类分子、但包含功能性HLA I类转基因和功能性HLA II类转基因、并具有HLA-A2+HLA-DRl+e2m° IA @。基因型的转基因小鼠施用第二种候选疫苗，并测量小鼠体内由第二种候选疫苗诱导的T-辅助细胞应答； c)将每种待比较的其他候选疫苗分别施用于包含断裂的H2I类基因、断裂的H2 II类基因、功能性HLA-A2转基因和功能性HLA-DRl转基因的转基因小鼠或缺乏H2 I类和II类分子、但包含功能性HLAI类转基因和功能性HLA II类转基因、并具有HLA-A2+HLA-DRl+0 2m° IA3 °基因型的转基因小鼠，并测量小鼠体内由各种待比较的其他候选疫苗诱导的T-辅助细胞应答；和 d)通过比较针对各种待比较的疫苗的T-辅助细胞应答来确定各种候选疫苗诱导T-辅助细胞应答的效力。
6.权利要求5的方法，其中T-辅助细胞应答为HLA-DRl限制性应答。
7.—种比较由两种或两种以上疫苗诱导的T细胞毒性细胞应答的效カ的方法，该方法包括 a)给包含断裂的H2I类基因、断裂的H2 II类基因、功能性HLA-A2转基因和功能性HLA-DRl转基因的转基因小鼠或缺乏H2 I类和II类分子、但包含功能性HLA I类转基因和功能性HLA II类转基因、并具有HLA-A2+HLA-DRl+e2m° IA @。基因型的转基因小鼠施用第一种候选疫苗，并测量小鼠体内由第一种疫苗诱导的T细胞毒性细胞应答； b)给包含断裂的H2I类基因、断裂的H2 II类基因、功能性HLA-A2转基因和功能性HLA-DRl转基因的转基因小鼠或缺乏H2 I类和II类分子、但包含功能性HLA I类转基因和功能性HLA II类转基因、并具有HLA-A2+HLA-DRl+e2m° IA @。基因型的转基因小鼠施用第二种候选疫苗，并测量小鼠体内由第二种候选疫苗诱导的T细胞毒性细胞应答； c)将每种待比较的其他候选疫苗分别施用于包含断裂的H2I类基因、断裂的H2 II类基因、功能性HLA-A2转基因和功能性HLA-DRl转基因的转基因小鼠或缺乏H2 I类和II类分子、但包含功能性HLA I类转基因和功能性HLA II类转基因、并具有HLA-A2+HLA-DRl+0 2m° IA3 °基因型的转基因小鼠，并测量小鼠体内由每种待比较的其他候选疫苗所诱导的T细胞毒性细胞应答；和 d)通过比较针对各种待比较的疫苗的T细胞毒性细胞应答来确定各种候选疫苗诱导T细胞毒性细胞应答的效力。
8.权利要求7的方法，其中T细胞毒性细胞应答为HLA-A2限制性应答。
9.ー种同时比较由两种或两种以上疫苗引起的T-辅助细胞应答和T细胞毒性细胞应答的效カ的方法，该方法包括a)给包含断裂的H2I类基因、断裂的H2 II类基因、功能性HLA-A2转基因和功能性HLA-DRl转基因的转基因小鼠或缺乏H2 I类和II类分子、但包含功能性HLA I类转基因和功能性HLA II类转基因、并具有HLA-A2+HLA-DRl+e2m° IA @。基因型的转基因小鼠施用第一种候选疫苗，并测量小鼠体内由第一种候选疫苗所诱导的T-辅助细胞应答和T细胞毒性细胞应答； b)给包含断裂的H2I类基因、断裂的H2 II类基因、功能性HLA-A2转基因和功能性HLA-DRl转基因的转基因小鼠或缺乏H2 I类和II类分子、但包含功能性HLA I类转基因和功能性HLA II类转基因、并具有HLA-A2+HLA-DRl+e2m° IA @。基因型的转基因小鼠施用第二种候选疫苗，并测量小鼠体内由第二种候选疫苗所诱导的T-辅助细胞应答和T细胞毒性细胞应答； c)将每种待比较的其他候选疫苗分别施用于包含断裂的H2I类基因、断裂的H2 II类基因、功能性HLA-A2转基因和功能性HLA-DRl转基因的转基因小鼠或缺乏H2 I类和II类分子、但包含功能性HLA I类转基因和功能性HLA II类转基因、并具有HLA-A2+HLA-DRl+0 2m° IA3 °基因型的转基因小鼠，并测量小鼠体内由各种待比较的候选 疫苗所诱导的T-辅助细胞应答和T细胞毒性细胞应答；并 d)通过比较针对各种待比较的疫苗的T-细胞辅助细胞应答和T细胞毒性细胞应答，确定各种候选疫苗诱导T-辅助细胞应答和T细胞毒性细胞应答的效力。
10.权利要求9的方法，其中T-辅助细胞应答为HLA-DRl限制性应答，且其中T细胞毒性细胞应答为HLA-A2限制性应答。
11.ー种同时确定在以抗原或以包含ー种或多种抗原的疫苗进行免疫后，小鼠体内的体液应答、T辅助细胞应答和T细胞毒性细胞应答的方法，该方法包括 a)将抗原或包含ー种或多种抗原的疫苗施用于包含断裂的H2I类基因、断裂的H2 II类基因、功能性HLA-A2转基因和功能性HLA-DRl转基因的转基因小鼠或缺乏H2I类和II类分子、但包含功能性HLA I类转基因和功能性HLA II类转基因、并具有HLA-A2+HLA-DR1+P 2m。IAP。基因型的转基因小鼠； b)測定小鼠体内对抗原或包含ー种或多种抗原的疫苗的特异性体液应答； c)測定小鼠体内对抗原或包含ー种或多种抗原的疫苗的T-辅助细胞应答；并 d)測定小鼠体内对抗原或包含ー种或多种抗原的疫苗的T细胞毒性细胞应答。
12.权利要求11的方法，其中T-辅助细胞应答为THHLA-DRl限制性应答。
13.权利要求12的方法，其中T细胞毒性细胞应答为CTRLHLA-Al限制性应答。
14.ー种基于预先选定的标准对施用于人体的两种或两种以上候选疫苗组合物进行优化的方法，该方法包括 根据权利要求11，同时确定小鼠在使用两种或两种以上候选疫苗组合物进行免疫后的体液应答、T-辅助细胞应答和T细胞毒性应答；并 通过将预先选定的标准应用于测定結果，选择最优的疫苗。
15.权利要求14的方法，其中两种或两种以上候选疫苗的区别仅在于疫苗中的抗原与佐剂的比例不同。
16.权利要求14的方法，其中两种或两种以上候选疫苗的区别仅在于疫苗中的佐剂类型不同。
17.一种确定疫苗在施用于人体后是否存在引起自身免疫性疾病的风险的方法，该方法包括 a)给包含断裂的H2I类基因、断裂的H2 II类基因、功能性HLA-A2转基因和功能性HLA-DRl转基因的转基因小鼠或缺乏H2 I类和II类分子、但包含功能性HLA I类转基因和功能性HLA II类转基因、并具有HLA-A2+HLA-DRl+e2m° IA @。基因型的转基因小鼠施用疫苗；并 b)測定小鼠体内的自身免疫应答； 其中，如观察到小鼠体内出现自身免疫应答，表明疫苗在施用于人体后存在引起自身免疫性疾病的风险。
18.ー种分离的转基因小鼠非胚胎细胞，其包含 a)断裂的H2I类基因； b)断裂的H2II类基因；和 c)功能性HLAI类或II类转基因。
19.ー种分离的转基因小鼠非胚胎细胞，其包含 a)断裂的H2I类基因； b)断裂的H2II类基因； c)功能性HLAI类转基因；和 c)功能性HLA II类转基因。
20.权利要求19的转基因小鼠非胚胎细胞，其中HLAI类转基因为HLA-A2转基因，而HLA II类转基因为HLA-DRl转基因。
21.权利要求20的转基因小鼠非胚胎细胞，其中HLA-A2转基因包含序列表中提供的HLA-A2序列，而HLA-DRl转基因包含序列表中提供的HLA-DRl序列。
22.—种分离的缺乏H2 I类和II类分子的转基因小鼠非胚胎细胞，其中所述转基因小鼠非胚胎细胞包含功能性HLA I类转基因和功能性HLA II类转基因。
23.权利要求22的转基因小鼠非胚胎细胞，其具有HLA-A2+HLA-DR1+P2m°IAP °基因型。
24.权利要求23的转基因小鼠非胚胎细胞，其中HLA-A2转基因包含序列表中提供的HLA-A2序列，而HLA-DRl转基因包含序列表中提供的HLA-DRl序列。
全文摘要
具有人类主要组织相容性复合物(MHC)表型的转基因小鼠、其实验性使用及用途，本发明涉及转基因小鼠和分离的转基因小鼠细胞，小鼠和小鼠细胞包含断裂的H2 I类基因、断裂的H2 II类基因、功能性HLA I类转基因和功能性HLA II类转基因。在实施方式中，转基因小鼠或小鼠细胞缺乏H2I类和II类分子，但包含功能性HLA I类转基因和功能性HLA II类转基因。在实施方式中，转基因小鼠或小鼠细胞包含HLA-A2+HLA-DR1+β2m°IAβ°基因型。本发明还涉及使用本发明的转基因小鼠的方法。
文档编号C12N15/85GK102727875SQ20121013483
公开日2012年10月17日 申请日期2004年7月5日 优先权日2003年7月30日
发明者克洛德·奥里欧, 安东尼·帕诺, 弗朗索瓦·莱蒙尼尔, 韦罗尼克·潘克里, 龙玉春 申请人:巴斯德研究院