专利名称：焦磷酸测序法检测ApoE基因多态性的试剂盒及方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，具体涉及焦磷酸测序法检测ApoE基因多态性的试剂盒及方法。
背景技术：
阿尔茨海默病(Alzheimi·er，s disease, AD)是一种常见的神经系统退行性疾病，是最常见的痴呆类型，发病隐匿，病情呈进行性。目前发病机制尚不清楚，可能与遗传和环境因素有关。ApoE编码胆固醇代谢的关键载脂蛋E，通过调控和加速AP蛋白代谢、以及直接通过ApoE受体调控脑部脂质代谢和突触功能，在AD的发病中起到重要作用。根据ApoE表型提出ApoE基因模型，认为ApoE的合成是由位于一个基因位点上的三个等位基因所控制，即E2、E3和E4，每一个等位基因对应于一个主要异构体产生三种纯合子(E2/2，E3/3，E4/4)和三种杂合子(E2/3，E2/4，E3/4)共六种常见表型。ApoE3/3型又称野生型。ApoE的氨基酸序列的112位和158位两种氨基酸残基即精氨酸(Arg)和半胱氨酸(Cys)的交换决定了异构体的种类。ApoE4在这两个位置上都是Arg ;E2都是Cys ;112位为Cys和158位是Arg者为ApoE3异构体。自然人群中，基因频率e 3分布最高，ApoE3/3表型分布约70%。ApoE突变后，其与LDL-R的亲和力发生改变。携带一个E4等位基因的个体其发展为AD的可能性高于无E4等位基因的个体约3-4倍。E4等位基因在普通人群中比例大约为15%，而在AD患者中的比例可达40%。ApoE4是AD的重要危险因素。通过检测ApoE的基因型，可了解是否为AD易感人群，继而从病因学延缓AD的发生、发展；并定期检查，以便早诊断、早治疗、最大程度的降低疾病造成的损害。综上所述，ApoE基因多态性与AD发病显著相关，开发快速、高效、准确、便捷、经济的检测ApoE基因多态性的试剂盒将为AD的预测起到积极的推动作用。焦磷酸测序(Pyro sequencing)技术是新一代DNA序列分析技术,该技术无须进行电泳，DNA片段也无须荧光标记，是一种通用型技术平台。该技术具有操作简便、检测成本低、所需样品量小、快捷、准确、高通量等特点，符合临床大样本检测要求。
发明内容
ApoE基因多态性是与AD发病显著相关，ApoE是AD发生的主要易感基因之一。本发明提供一种检测AD易感基因ApoE基因多态性的试剂盒及方法，以实现快速、简便、准确、高效、实用、经济的检测ApoE基因多肽性。为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为
一种焦磷酸测序法检测ApoE基因多态性的试剂盒，包括如下引物
(I)扩增引物
ApoE (rs429358)上游引物 Sr-AGA ACT GGA GGA ACA ACT GAC C_3, (SEQ ID
NO. 3)；ApoE (rs7412)上游引物5、AGA ACT GGA GGA ACA ACT GAC C -3^ (SEQ ID
NO. 3)；
ApoE (rs429358)下游引物:5,-CCC CGG CCT GGT ACA CTG-3, (SEQ ID NO. 4)； ApoE (rs7412)下游引物:5,- CCC CGG CCT GGT ACA CTG-3, (SEQ ID NO. 4)； 其中，下游引物的5'进行生物素标记；
(2)测序引物
ApoE (rs429358)测序引物:5,- GAC ATG GAG GAC GTG -3, (SEQ ID NO. 5)；
ApoE (rs7412)测序引物:5,- CCG ATG ACC TGC AGA -3, (S EQ ID NO. 6)； 试剂盒中其他试剂及溶液为PCR和DNA焦磷酸测序的常规试剂。一种应用上述试剂盒检测ApoE基因多态性的方法，包括如下步骤
(1)DNA 提取；
(2)聚合酶链反应
配制 50 ill PCR 扩增体系，包含10 X PCR buffer 10. Ou I, dNTP 3. Oyl，上游引物l.Ou I,下游引物l.Oiil，1^&91.0111，水30.0111，模板4.0111 ;按照下面的循环参数设置扩增仪95 oC 5min预变性；然后依次在95°C 30S, 52°C 30S, 70°C 30S,进行36个循环；再在72°C保持5min，最终保持在4 °e，得扩增产物；
(3)焦磷酸测序单链样本纯化；
(4)焦磷酸测序及结果分析。本发明的试剂盒对ApoE (rs429358) (SEQ ID NO. I)和 ApoE (rs7412)(SEQ ID NO. 2)目标序列进行分析和检测；其中，rs429358目标序列包括野生型TGCGGCCGCCTGGTGC (SEQ ID NO. 7)和突变型 CGCGGCCGCCTGGTGC (SEQ ID NO. 8)，扩增出的片段长度为185bp ；rs7412目标序列包括野生型AGCGCCTGGCAGTGT (SEQ ID NO. 9)和突变型 AGTGCCTGGCAGTGT (SEQ ID NO. 10)，扩增出的片段长为 185bp。由于设计了特异性高的引物，并且选择了合适的方法，本发明的试剂盒适用于对ApoE基因多态性进行快速检测，可广泛应用于临床上AD易感基因ApoE基因检测。与现有技术相比，其应用焦磷酸测序技术可以快速、准确地进行短DNA序列分析，便于构建标准化操作流程；具有高通量、低成本等特点；PCR产物即可直接用于测序，不需进行产物纯化等二次处理，操作极为简便，所需样品量小。
图I为本发明ApoE (rs429358) TT焦磷酸测序结果；
图2为本发明ApoE (rs7412) CC焦磷酸测序结果。
具体实施例方式下面结合实施例对上述试剂盒及检测方法进行详细描述。实施例I :
ApoE (rs429358)上游引物:5,-AGA ACT GGA GGA ACA ACT GAC C_3, (SEQ ID NO. 3)；ApoE (rs7412)上游引物5r- AGA ACT GGA GGA ACA ACT GAC C -3, (SEQ ID NO. 3)；ApoE (rs429358)下游引物:5,-CCC CGG CCT GGT ACA CTG-3, (SEQ ID NO. 4)；ApoE (rs7412)下游引物:5,- CCC CGG CCT GGT ACA CTG-3, (SEQ ID NO. 4)；
ApoE (rs429358)测序引物:5,- GAC ATG GAG GAC GTG -3, (SEQ ID NO. 5)；
ApoE (rs7412)测序引物:5,- CCG ATG ACC TGC AGA -3, (SEQ ID NO. 6)；
I. DNA提取
I. I实验前试剂材料准备与检查工作如下
(I)检查试剂盒保质期以及确保Wash Buffer I和2中已添加乙醇，并在瓶上相应标识处打勾V ; (2)异丙醇(如无，可用无水乙醇替代)和75%乙醇；(3)高压灭菌有效期内的I. 5mL Eppendorf管和各类移液枪头。 I. 2从4°C冰箱中取出装有全血的EDTA抗凝管，上下颠倒数次混匀；
I. 3在I. 5mL Eppendorf管对应标本唯一性标识做好标记；
I. 4 分别移取 900uL Cell Lysis Solution 加至灭菌的 I. 5mL Eppendorf 管；
I. 5小心移取300uL全血转移至上述加有Cell Lysis Solution的I. 5mL EP管；
I. 6盖上Eppendorf管盖，室温孵育IOmin ；
I. 713, OOOrpm室温离心20秒；
I. 8取出Eppendorf管,观察白色沉淀；
I. 9开Eppendorf管盖，手持管底部，倾斜EP管口弃去部分红色上清，尽量将红色上清吸尽；
I. 10盖上Eppendorf管,用手指弹击EP管底部,使白色沉淀重悬；
1.11移取30011]^ Nuclei Lysis Solution入上述Eppendorf管中，盖上管，上下颠倒数次混匀；
I. 12 打开 Eppendorf 管，移取 IOOuL Protein Precipitation Solution 入上述Eppendorf管中，盖上管管,振荡器上剧烈振荡20秒；13，OOOrpm室温离心3min ；
I. 13移取上清转移到新的已灭菌I. 5mL Eppendorf管；
I. 14移取300uL异丙醇入EP管，盖上管盖，上下颠倒数次混匀，可见白色絮状gDNA析
出；
I. 15 13, OOOrpm 室温离心 Imin ；
I. 16打开Eppendorf管，手捏管底部，倾斜管口弃去上清；
I. 17移取300uL 75%乙醇加入Eppendorf管，盖上管盖，轻柔上下颠倒洗涤沉淀；
I. 18 13, OOOrpm 室温离心 Imin ；
I. 19打开Eppendorf管，手持管底部，倾斜管口弃去上清；
I.20在实验台上放置新滤纸,倒扣Eppendorf管，吸干液体,将Eppendorf管开盖侧放风干；
I.21目测沉淀大小，加入50 IOOul DNA Rehydration Solution至沉淀；
1.22过夜溶解后用Nano-Space紫外分光光度计进行核酸浓度测定，核酸浓度大于50ng/ul视为合格，如浓度不够，加入乙醇再次沉淀DNA，然后重新加适量的DNARehydration Solution 溶解 DNA。I. 23在管壁和管盖上再次标清样本唯一性编号，并用透明胶带缠绕保护；
1.24保存核酸标本至4°C冰箱；
2.聚合酶链反应2.I在试剂准备区配制50 Ul PCR扩增体系(模板添加除外)，各组分及添加量如下表
10 <PCR buffer10_0ul
dNTP3 JDui
LOul
上游引物‘
(毎种引物加C.50)
LOul
下游引物'
(每种引物加
rTaqLOul
水30..0jil
注上游引物和下游引物各有两种，这里的I. Oiil是指每种上游引物各加0. 5iU，以及每种下游引物各加0.5U1。2. 2在标本制备区对盛有gDNA模板短暂离心后添加4. 0 U I至扩增体系中，在PCR管壁上标记标本唯一丨丨生标识，管盖上标记检测项目代号。PCR管震荡混勻,桌面离心机上短暂离心；
2.3在扩增区进行PCR扩增反应，按照下面的循环参数设置扩增仪
UIPJUiI处禪时间IWWfi
195—C丨 5mill 5
295 TI 30s I
352T30s1
4701'30s 丨for
I丨Mcyde
amiw i
372 C丨I
618.C丨 iioitiiiig 丨
__I_；_
2.4设置程序后在随后的下拉菜单中选择“tube”；
2.5点击“ start ”开始仪器运行。3.焦磷酸测序单链样本纯化
3.I纯化前试剂和仪器准备
进行样本纯化前，确保所有溶液都达到室温；打开精密控温加热炉，使温度达到80°C。3. 2单链样本纯化操作
3.2. I 在 PSQ 96 板中先加 40 u IAnnealing Buffer 和 2 3 U I 测序引物(IOuM)；
3.2. 2在振荡器上充分混勻Sepharose Beads ；
3.2. 3将所需Sepharose Beads量(每样本3 U I计算)转移到I. 5mL Eppendorf管；3. 2. 4在Sepharose Beads中加入Binding Buffer,使得平均每个样品约有和PCR体系一样的体积，在振荡器上将混合物充分混勻；
3. 2. 5将Sepharose Beads混合物加至约40 U I PCR产物中，每样本加40 U I ；
3. 2. 6常温下、在振荡器上将PCR板混匀10分钟；
3. 2. 7在Vacuum prep workstation中，四个液体槽中依次加入180ml纯水、120ml70% 乙醇、Denaturation Buffer 和 Washing Buffer ；
3. 2. 8倒掉与真空泵相连的废液收集桶中的废液；
3. 2. 9 打开 Vacuum Prep Workstation 的真空泵和阀门，将 Vacuum Prep Tool 在纯水中清洗30秒；
3. 2. 10将Vacuum prep Tool移到PCR板孔中，抓取结合了生物素标记核酸的·Sepharose Beads ；
3. 2. 11拿起PCR板,检查Beads是否都被吸附在了 Vacuum Prep Tool上；
3. 2. 12 将 Vacuum Prep Tool 放入 70% 乙醇中 5 秒；
3. 2. 13 将 Vacuum Prep Tool 移到 Denatureation Buffer 中 5 秒；
3. 2. 14 再将 Vacuum Prep Tool 移到 Washing Buffer 中清洗 10 秒；
3. 2. 15把Tool悬放在Pyro反应板；
3. 2. 16 Vacuum Prep Tool放入含有测序引物的反应板中，旋转摇动，以释放Sepharose Beads ；
3. 2. 17放有纯化样本的PSQ 96板放在Thermo Plate上，置于80°C加热炉中加热2min,取出后自然冷却到室温,进行下游Pyrosequencing反应。3. 3纯化完毕后清洗
3. 3. I不开真空泵和阀门，使用少量纯水清洗Vacuum Prep Tool,使少量未脱落的Beads洗脱下来；
3. 3. 2更换纯水后再打开真空泵和阀门，用约300mL纯水清洗Tool ；
3.3. 3关掉真空泵和阀门，将Vacuum Prep Tool侧放,室温晾干；
3.3. 4清洗所有盛装试剂溶液的塑料槽，自然晾干；
3.3. 5用湿布擦拭纯化设备表面。4.焦磷酸测序
4.I调入前述设定的运行程序文件，点击“View”的下拉键，选择“Run”，按照软件自动计算本次实验的各试剂使用量，添加各试剂成分至试剂仓；
4.2把准备好的样本和试剂舱放入仪器相应的位置，点击屏幕右下端的“Run”开始焦磷酸测序；
4.3检测完成后，首先点击软件进程状态窗口的“close”键以保存测序结果。5.焦磷酸测序结果分析
在“SNP Runs”文件夹中双击鼠标，打开上述运行文件，选择“SNP mode”，点击“AnalyzeAll”键，对所有检测标本进行基因型分析；选择“AQ mode”，点击“Analyze All”键，对所有检测标本进行等位基因频率分析。对样本检测ApoE (rs429358)和ApoE (rs7412)基因多态性，焦磷酸检测结果如图f 2。可以看出，采用本发明的试剂盒及方法，能够简捷、直观、准确的对ApoE (rs429358)和ApoE (rs7412)基因多态性进行检测和判读。图I提示ApoE(rs429358)为野生型纯合子，图2提示ApoE (rs7412)为野生型纯合子。临床医生可根据ApoE (rs429358)和ApoE (rs7412)基因多态性，判断出不同基因型患者使用AD发生的风险。综上，本发明所选取的靶序列，以及应用本发明的试剂盒能够实现快速、简便、准确、高效、实·用、经济的检测ApoE (rs429358)和ApoE (rs7412)基因多态性，能够满足临床检验实际工作的要求，利于AD发生风险的预测。
权利要求
1.一种焦磷酸测序法检测ApoE基因多态性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如下引物 (1)扩增引物上游引物5 ^AGA ACT GGA GGA ACA ACT GAC C-3^ ；下游引物5'-CCC CGG CCT GGT ACA CTG-3'；其中，下游引物的5'进行生物素标记； (2)测序引物:5,-GACATG GAG GAC GTG-3,； 5,- CCG ATG ACC TGC AGA -3,。
2.一种应用权利要求I所述的试剂盒检测ApoE基因多态性的方法，包括如下步骤 (1)DNA 提取； (2)聚合酶链反应 配制 50 ill PCR 扩增体系，包含10 X PCR buffer 10. Ou I, dNTP 3. Oyl，上游引物l.Oul,下游引物 l.Oul, rTaql. OiU，水 30. OiU，模板 4. OiU ;循环程序为95 oC 5min预变性；依次在95°C 30S,52°C 30S,70°C 30S，进行36个循环;72°C保持5min，最终保持在4 °e，得扩增产物； (3)焦磷酸测序单链样本纯化； (4)焦磷酸测序及结果分析。
全文摘要
本发明公开了一种焦磷酸测序法检测ApoE基因多态性试剂盒及方法。具体是指ApoE(rs429358)和ApoE(rs7412)单核苷酸多态性。试剂盒包含如SEQ ID NO.3—6所示的引物。本发明的试剂盒，可以实现准确、快捷、高通量ApoE(rs429358)和ApoE(rs7412)的检测，从而达到对AD发生风险的预测。
文档编号C12Q1/68GK102676669SQ20121013538
公开日2012年9月19日 申请日期2012年5月4日 优先权日2012年5月4日
发明者周宏灏 申请人:周宏灏