专利名称：细菌素诱导者肽的制作方法
技术领域：
本发明涉及在诱导者细菌存在下刺激由生产者细菌产生细菌素的新型的肽以及使用所述肽用于细菌素产生的方法。
背景技术：
正常的肠道细菌对于任何宿主动物的健康都是重要的。宿主通过由天然细菌生物相介导的消化代谢过程而受益。从肠道细菌来看，竞争和随之发生的进化提供营养素和生存空间并增加繁殖潜能，使得某些菌株和菌种获得生存优势。在细菌进化期间，细菌素的产生已经发生。在给定的竞争利基(competitive niche)中，细菌素对于其他生物体是拮抗的并因此提供生态优势。这些生物素一般是低分子量的多肽，并被基于分子量的差异分类 (Klaenhammer, FEMS Microbiol. Rev. , 1993年 12-39-85卷)。这些化合物可以容易地被宿主蛋白酶消化成其组成氨基酸。细菌素可能代表得自竞争性排斥的益处中的重要部分(Nurmi 和 Rantala, Nature (自然)，伦敦，1973 年，第 241 卷，210-211)。
Nurmi和Rantala (1973,同上)最早描述了通过使用得自健康的成年禽粪便的未确定的细菌菌群控制沙门氏菌在新孵化的雏鸡中的定殖中的竞争性排斥的优点。该途径对于目前涉及合成抗生素的耕作方法而言是有吸引力的备选方案。得自粘膜的竞争性排斥菌群被描述为得自健康的成年母鸡的肠粘膜内膜刮屑的厌氧培养物(Stern等，美国专利5，451，400，公布于1995年9月)。此未确定的菌群在鸡中提供良好的对于沙门氏菌的定殖防护，但是仅提供不稳定的弯曲杆菌(Campylobacter)的定殖控制(Stern, Poult. Sci, 1994年，第73卷，402-407)。竞争性排斥出现在野生禽类肠道中并有助于健康的肠道生态。
微生物产生各种显示抗菌性质的化合物。一类这样化合物，细菌素，由具有类似于离子载体抗生素的作用机制的杀菌蛋白质组成。细菌素常具有抵抗与该细菌素的生产者密切相关的菌种的活性。它们在从复杂的微生物群落(例如肠道、口腔或其他的上皮表面)分离出来的细菌菌种中的广泛存在，表明细菌素在细菌生态系统中的种群动态方面可能具有调节作用。细菌素被定义为由细菌产生的具有生物活性的蛋白部分以及杀菌作用的化合物 (Tagg 等,细菌学评论(Bacteriological Reviews), 1976 年,第 40 卷,722-256)。其他的特征可以包括(1)窄谱抑制活性，集中于密切相关的菌种；(2)与特定细胞受体附着；(3) 质粒携带的细菌素产生和具有宿主细胞细菌素免疫性的遗传定子。未完全确定的拮抗物质被称为“细菌素样物质”。一些有效抵抗革兰氏阳性细菌，相反不抵抗革兰氏阴性细菌的细菌素，具有较广谱的活性。已有建议术语细菌素，当被用于描述由革兰氏阳性细菌产生的抑制剂时，应该符合(I)是一种肽，(2)具有杀菌活性(Tagg等人，同上)的最低标准。3
为了经济上可行地在商业上利用细菌素，在产生期间将产量最优化是必要的 (Chen 和 Hoover,食品科学和食品安全综述(Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety), 2003年,第2卷,82-100)。Chen和Hoover宣称发现在生长介质中，针对尼生素(nisin)生产的关键因素是维持最优化的pH以及针对每种产生细菌素的菌株或多种菌株补充具有特定的营养物的介质。
Knutsen 等人(细菌学杂志(Journal of Bacteriology), 2004 年，第 186 卷 (10)，3078-3085)公开了一种27个氨基酸的细菌素诱导肽(BIP)，其诱导肺炎链球菌 (Streptococcus Pneumoniae)中细菌素的产生。Diep等人(分子生物学(Molecular Biology)2003年第47(2)卷，483-494)公开了许多革兰氏阳性细菌，所述细菌已被报道为应用所谓的基于肽信息素的信号转导途径来调节来自为数众多的乳酸菌的，称为细菌素的抗微生物肽的产生。其还公开了诱导细菌素产生的肽信息素，PInA。Van Belkum和Stiles (Nat. Prod. Rep.，2000年，第17卷，323-335)公开了一些细菌素需要调节基因的产物来产生它们。他们宣称这些基因编码一种分泌的诱导肽以及与组氨酸激酶和响应调节因子同源的蛋白质。该参考文献进一步公开了一些由诱导肽诱导的II类细菌素，而其他的例如肉食杆菌素B2 (Carnobacteriocin B2)和乳杆菌素P (Sakacin P)是由诱导肽诱导或者由所合成细菌素自诱导的。
尽管已经发现各种在细菌中诱导细菌素产生的肽，本领域中仍存在对于采用在体外增加细菌素产生的量的肽的细菌素商业化生产的需要。本发明提供与现有技术中的肽不同的肽并提供大量生产用于商业化用途的细菌素的方法。发明内容
因此，本发明的一个目的是提供在体外刺激细菌素产生的肽。
本发明的又一目的是提供在体外刺激体外细菌素产生，并且具有VKGLT (SEQ ID NOl)的竣基端序列的妝。本发明提供一种具有SEQ ID NO I的竣基端氣基酸序列的妝。
本发明的另一目的是提供具有MVTKSLVLAWVVALLACGMVKGLT (SEQ ID NO 3)的氨基酸序列的肽。
本发明另一个目的是提供具有TNVTKSWWVLAGCNQVVASNCNCGNVKGLT (SEQ ID NO 5)的氨基酸序列的肽。
本发明再一个目的是提供具有WNKYKTNWVLSVCNTGCACAAVKGLT (SEQ ID N07)的氨基酸序列的妝。
本发明的另一目的是提供体外增加细菌素产生的方法，其中具有VKGLT (SEQ ID NOl)的羧基端序列的肽被加至产细菌素细胞的培养物中。
本发明提供一种用于增加细菌素产生的方法，包括
a.向培养物体系添加产细菌素细菌和诱导者细菌，
b.添加具有SEQ ID NO I的羧基端氨基酸序列的肽，以及
c.培养所述细菌和所述肽一段时间以实现增加的所述细菌素的产生。
本发明提供一种用于刺激具有SEQ ID NO 2的细菌素的产生的方法，包括
a.向培养物体系添加产细菌素细胞系NRRL-B-30514和诱导者细胞系NRRL 30884，
b.添加具有SEQ ID NO 3的肽，以及
c.培养所述细菌和所述肽一段时间以实现增加的所述细菌素的产生。
本发明提供一种用于刺激具有SEQ ID NO 4的细菌素的产生的方法，包括
a.向培养物体系添加产细菌素细胞系NRRL B-30746和诱导者细胞系NRRL B-30510,
b.向所述体系添加具有SEQ ID NO 5的肽，以及
c.培养所述细菌和肽一段时间以实现增加的所述细菌素的产生。
本发明提供一种用于刺激具有SEQ ID NO 6的细菌素的产生的方法，包括
d.向培养物体系添加产细菌素细胞系NRRL B-30745和诱导者细胞系NRRL B-30510,
e.添加具有SEQ ID NO 7的肽，以及
f.培养所述细菌和所述肽一段时间以实现增加的所述细菌素的产生。
本发明提供一种用于刺激具有SEQ ID NO 2的细菌素的产生的方法，包括
a.向培养物体系添加产细菌素细胞系NRRL-B-30514和诱导者细胞系NRRL 30884，
b.添加具有SEQ ID NO I的羧基端氨基酸序列的肽，以及
c.培养所述细菌和所述肽一段时间以实现增加的所述细菌素的产生。
本发明提供一种用于刺激具有SEQ ID NO 4的细菌素的产生的方法，包括
g.向培养物体系添加产细菌素细胞系NRRL B-30746和诱导者细胞系NRRL B-30510,
h.向所述体系添加具有SEQ ID NO I的羧基端氨基酸序列的肽，以及
i.培养所述细菌和所述肽一段时间以实现增加的所述细菌素的产生。
本发明提供一种用于刺激具有SEQ ID NO 6的细菌素的产生的方法，包括
j.向培养物体系添加产细菌素细胞系NRRL B-30745和诱导者细胞系NRRL B-30510,
k.添加具有SEQ ID NO I的羧基端氨基酸序列的肽，以及
I.培养所述细菌和所述肽一段时间以实现增加的所述细菌素的产生。
本发明又一个目的是提供用于体外增加细菌素0R-7的产生的方法，其中具有SEQ ID NO 3 的肽被加至唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius) PVD-32 (NRRL B-30514)细胞的培养物中。
本发明的另一目的是提供用于体外增加细菌素50-52的产生的方法，其中具有 SEQ ID NO 5 的肽被加至屎肠球菌(Enterococcus faecium) LffP 50-52 细胞(NRRL B-30746)的培养物中。
本发明再一个目的是提供用于体外增加细菌素760的产生的方法，其中具有SEQ ID NO 7 的肽被加至仓鼠链球菌(Streptococcus cricetus)LWP 760 细胞(NRRL B-30745) 的培养物中。
本发明的另一目的是提供通过进一步包括诱导者细胞系而增加由生产者细胞系产生细菌素的方法。
本发明再一个目的是提供通过进一步包括诱导者细胞系卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)LWP 252 (NRRL B-30884)而增加由生产者细胞系唾液乳杆菌 (Lactobacillus salivarius) PVD-32 产生细菌素 0R-7 的方法。
本发明再一个目的是提供通过进一步包括诱导者细胞系嗜酸乳酸杆菌 (Lactobacillus acidophilus)LffP 320 (NRRL B-30510)而增加经生产者细胞系屎肠球菌 (Enterococcus faecium) LffP 50-52 产生细菌素 50-52 的方法。
本发明再一个目的是提供通过进一步包括诱导者细胞系嗜酸乳酸杆菌(Lactobacillus acidophilus) LffP 320而增加经生产者细胞系仓鼠链球菌 (Streptococcus cricetus) LWP-760 产生细菌素 760 的方法。
本发明其他的目的和优势从下述说明中将会变得明显。
微生物的保藏
唾液乳杆菌(Lactobacillussalivarius),标明为NRRL B_30514(菌株PVD32),于 2001年8月3日保藏;仓鼠链球菌(Streptococcus cricetus),标明为NRRL B_30745(菌株 LffP 760)，以及屎肠球菌(Enterococcus faecium)标明为 NRRL B-30746 (菌株 LWP-50-52) 于2004年5月3日保藏；而乳酸菌(Lactobacillus sp·)，标明为NRRL B-30510 (菌株 LffP 320)于 2001 年 8 月 3 日保藏。卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus),标明为 NRRL B-30884(菌株LWP 252)于2005年11月4日保藏。所有上述菌株已按照布达佩斯条约的规定保藏于美国农业部农业研究培养物保藏中心(国家农业应用研究中心(National Center for Agricultural Utilization Research), 1815N. University Street, Peoria, Illinois 61604)。
图IA和IB是显示SDS-PAGE (A)和等电聚焦(B)后对信号肽和细菌素0R-7直接检测的照片。凝胶用空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)覆盖以确定哪个或哪几个条带与抗微生物活性对应，并确定分子量和等电点。在图IA中第I道——2，100-12, 500范围的 LMW 分子量标记(Amersham Pharmacia Biotech)2, 100 ；5, 780 ；8, 400 ； 12, 500Da。包含纯的细菌素0R-7的第2道的条带对应抗菌活性，生长抑制的区域具有约5. 5kDa的质量。 包含纯的来自PVD-32的信号肽的第3道的条带具有约2. 5kDa的质量。在图IB中，包含纯的细菌素0R-7的第I道对应抗菌活性；生长抑制的区域具有约8. 4的pi。包含纯的来自 PVD-32的信号肽的第2道的条带具有约7. 9的pi。第3道包含pi标准物(蛋白质测试混合物，I 标记蛋白，Serva) 10. 0,9. 2,8. 1,6. 9,5. 5,4. 3。
图2A和2B是显示SDS-PAGE (A)和等电聚焦(B)后对信号肽和细菌素50-52直接检测的照片。凝胶用空肠弯曲杆菌覆盖以确定哪个或哪几个条带对应抗菌活性，并确定分子量和等电点。在图IA中第I道——约2，100-12, 500范围的LMW分子量标记(Amersham Pharmacia Biotech)2, 100 ；5, 780 ；8, 400 ；12, 500Da。包含纯的细菌素 50-52 的第 2 道的条带对应抗菌活性，生长抑制的区域具有约3. 9kDa的质量。包含纯的针对LWP-50-52的信号肽的第3道的条带具有约3. IkDa的质量。在图2B中，包含纯的细菌素50-52的第I道对应抗菌活性；生长抑制的区域具有约8. 4的pi。包含纯的来自LWP-50-52的信号肽的第2 道的条带具有约8. I的pi。第3道包含pi标准物(蛋白质测试混合物，I标记蛋白，Serva): 10. 0,8. 1,7. 9,6. 4,5. 5,4. 3,4. I 以及 3. 8。
图3A和3B是显示SDS-PAGE (A)和等电聚焦(B)后对信号肽和细菌素760直接检测的照片。凝胶用空肠弯曲杆菌覆盖以确定哪个或哪几个条带对应抗菌活性，并确定分子量和等电点。在图3A中，第3道显示约2，100-12，500范围的LMW分子量标记(Amersham Pharmacia Biotech)2, 100 ；5, 780 ；8, 400 ；12, 500Da。包含纯的细菌素 760 的第 I 道的条带对应抗菌活性，生长抑制的区域具有约5. 5kDa的质量。包含纯的来自LWP 760的信号肽的第3道的条带具有约2. IkDa的质量。在图3B中，包含纯的细菌素760的第I道的条带对应抗菌活性；生长抑制的区域具有约9. 5的pi。包含纯的来自LWP-760的信号肽的第2道的条带具有约8. 9的pi。第3道包含pi标准物(蛋白质测试混合物，I标记蛋白，Serva) 10. 0,8. 1,7. 9,6. 4,5. 5,4. 3,4. I 以及 3. 8。
具体实施方式
肠感染在人中的重要性已经被日益充分地认识到，家禽污染和人感染之间的关系也有详尽记载。通过干预家禽加工厂消除这种健康危险的能力也是众所周知的。在肉仔鸡产生和加工过程中，含有病原体的粪便物转移到肉上，并继续存在于加工食品的厨房中。
竞争性生物的代谢物可能有助于控制病原体例如空肠弯曲杆菌和沙门氏菌。唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius),标明为 NRRL B-30514 (菌株 PVD32),仓鼠链球菌(Streptococcus cricetus),标明为 NRRL B-30745 (菌株 LWP 760),以及屎肠球菌 (Enterococcus faecium),标明为 NRRL B-30746 (菌株 LWP-50-52)产生新细菌素,所述新细菌素是2003年8月21日递交的待决美国专利申请10/644,927以及2003年5月I日递交的待决美国专利申请10/426，688的主题，所述专利均通过引用整体包括在本文中。这些菌株还产生体外刺激所述菌株产生更高量的细菌素的新肽。
本发明提供新信号肽以及产生所述肽的菌株，新诱导者菌株、氨基酸序列以及使用所述的新肽和诱导者菌株的方法。
唾液乳杆菌，PVD-32(NRRL B-30514)产生信号肽SEQ ID NO 3。它是一种好氧且革兰氏阳性的杆菌，并且能够在约37° C生长。所述菌株在营养琼脂或平板计数琼脂(Plate Count Agar)上生长产生不规则形状的边缘。在约37° C需氧培养约24小时后，所述的菌落是白色的且直径约3mm。
屎肠球菌，LWP 50-52 (NRRL B-30746)产生信号肽SEQ ID NO 5。它是一种兼性好氧菌和革兰氏阳性球菌，并且能够在约37°C生长。所述菌株在营养琼脂或平板计数琼脂上生长产生不规则形状的边缘。在约37° C微需氧培养约24小时后，所述的菌落是灰色的且直径约2mm。
仓鼠链球菌，LWP-760 (NRRL B-30745)产生信号肽SEQ ID NO 7。它是一种兼性好氧菌和革兰氏阳性球菌，并且能够在约37°C生长。所述菌株在营养琼脂或平板计数琼脂上生长产生规则形状的边缘。在约37° C微需氧培养约24小时后，所述的菌落是灰色的且直径约1mm。
嗜酸乳酸杆菌，LffP 320 (NRRL B-30510)，是这样的诱导者菌株，它是兼性好氧菌和革兰氏阳性球菌，并且能够在约37°C生长。所述菌株在营养琼脂或平板计数琼脂上生长产生不规则形状的边缘。在约37° C微需氧培养约24小时后，所述的菌落是白色的且直径约 3mm。
卷曲乳杆菌LWP 252 (NRRL B-30884)是这样的诱导者菌株，它是好氧菌和革兰氏阳性球菌，并且能够在约37°C生长。所述菌株在营养琼脂或平板计数琼脂上生长产生规则形状的边缘。在约37° C需氧培养约24小时后，所述的菌落是灰色的且直径约1mm。
来自产细菌素菌株的信号肽被分离并纯化。生产者细胞主要通过ABC转运系统分泌 II 类细菌素(Haverstein 等,Mol. Microbiol.,第 16 卷，229-240，1995 ；Gajic 等,J. Biol. Chem.,第36卷，34291-34298，2003)。这类细菌素中的一些的分泌是由于由位于细胞质膜上的Sec转位酶激活的信号肽发生的(Cintas等，Appl. Environ. Microbiol.,第 63 卷，4321-4330，1997 ；Doi 等，J. Biosci. Bioeng.，第 93 卷，434-436，2002 ；Leer 等， 微生物学(Microbiology),第 141 卷,1629-1635，1995 ；Martinez 等，微生物学，第 145 卷，3155-3161，1999 ;Tomita 等，J. Bacteriol.，第 178 卷，3585-3593，1999 ；fforobo 等，J. Bacteriol.，第 177 卷，3143-3149,1995;以及 Herranz 等，J. Appl. Environ. Microbiol.,第71卷(4)，1959-1963，2005)。信号肽的另一功能可能与细菌现象“群体感应(quorum sensing)，，有关(De Kievit 等，感染与免疫(Infection and Immunity), 第68卷(9)，4839-4849，2000 ；Dunny等，在微生物信号传递与通信(Microbial Signaling and Communication)中，England 等编，英国剑桥大学出版社(University Press, Cambridge, United Kingdom) , 117-138, 1999 ；Dunning 和 Leonard, Annu.Rev. Microbiol.,第 51 卷，527-564，1997 ；以及 Kleerebezem 等，Mol. Microbiol.,第 24 卷，895-904，1997)。信号肽单独或与诱导菌株的代谢物一起激活生产者中的组氨酸蛋白，由此增加细菌素的产生。为了获得最大化的肽产生，产生信号肽的细胞，例如PVD 32， LWP50-52以及LWP 760，在选自由苯丙氨酸、色氨酸、丙氨酸及其混合物所组成的组的氨基酸所补充的M9肉汤中培养约2-10小时。对于包括在所述组合物中的每种氨基酸，本发明优选的实施方案包括在约O. 01%到约O. 1%范围内的氨基酸的量。约10%的布氏肉汤介质导致产生较低浓度的信号肽。
采用硫酸铵沉淀，随后(I)采用Superose 12的高分辨色谱的凝胶过滤；和(2)辛基-琼脂糖凝胶6B Fast Flow (快速流动)疏水作用色谱而将信号肽从培养物上清液中分离出来。
本发明的信号肽被用于在诱导者细菌存在时体外增加由生产者细胞的细菌素产生。所述的信号肽可以在诱导者和生产者细菌的培养期间的任何时刻添加。若给予本文的发明的详细说明，本领域的普通技术人员可以容易地确定何时添加所述信号肽以获得与仅含所述的肽和生产者、或仅含生产者和诱导者细菌的培养物的细菌素产生相比高水平的细菌素产生。
当使用信号肽和抵抗空肠弯曲杆菌(C. jejuni)和肠炎沙门氏菌 (S. enteritidis)的诱导者细菌菌株时产生的细菌素的拮抗活性采用斑点试验来评定。 所述步骤包括取约10微升体积的各种浓度(yg/ml)的平板接种在预先接种有靶细菌细胞的血补给弯曲菌琼脂(Campylobacter Agar)或营养琼脂(MPA或后蛋白胨琼脂(Meta Peptone Agar))上的纯细菌素制备物。含空肠弯曲杆菌培养物的平板于约42° C在微需氧条件下生长。含肠炎沙门氏菌的平板于约37° C在需氧条件下生长。细菌素的活性以每I毫升制备物任意单位(AU)在其上出现可见的培养物生长抑制区域表示(Henderson 等，生物化学和生物物理存档(Archives of Biochemistry and Biophysics),第 295卷，5-12，1992，通过引用并入本文)。比活也可以以每毫克纯细菌素任意单位表示。
本发明的信号肽包括由细菌素分泌细菌产生的任何具有VKGLT(SEQ ID NO I)的羧基端序列的肽，当被加至包括生产者细菌或生产者细菌和诱导者细菌的培养物时，所述肽增加细菌素的产生。
为了本发明的目的，诱导者细菌被定义为任何这样的细菌，所述细菌当与产细菌素细菌——生产者细菌一起——连同与生产者的信号肽一起培养时，将细菌素的产生增加到超过仅含所述生产者细菌和其信号肽的培养物的细菌素的产生。
为了本发明的目的，术语“肽”意为至少两个或更多个氨基酸或氨基酸类似物的化合物。所述氨基酸或氨基酸类似物可以通过肽键相连。在另一个实施方案中，氨基酸可以通过其他键，例如酯，醚等相连。肽可以是任何结构构型，包括线性，分支，或环状构型。本文所用的术语“氨基酸”指天然或合成的氨基酸，包括D或L光学异构体，以及氨基酸类似物两者。
本发明的肽衍生物和类似物包括但不限于包含作为一级氨基酸序列的的那些，所述肽的所述氨基酸序列的全部或部分包括改变的序列，其中，功能上等同的氨基酸残基替代所述序列中的残基导致保守氨基酸替代。
例如，序列中的一个或更多个氨基酸残基可以由具有相似极性的另外的氨基酸替代，所述具有相似极性的另外的氨基酸起功能等同物的作用，导致沉默改变。序列中氨基酸的替代物可以选自该氨基酸所属类别的其他成员。例如，非极性(疏水)氨基酸包括丙氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，缬氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，和甲硫氨酸。含有芳香环结构的氨基酸是苯丙氨酸，色氨酸和酪氨酸。极性中性氨基酸包括甘氨酸，丝氨酸，苏氨酸，半胱氨酸，酪氨酸，天门冬酰胺，和谷氨酰胺。带正电荷的(碱性)氨基酸包括精氨酸，赖氨酸，和组氨酸。带负电荷的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。预期这种改变不会显著影响聚丙酰胺凝胶电泳确定的分子量或等电点。非保守氨基酸替代也可以被引入以替换氨基酸，使之具有特别偏好的性质。例如，Cys可以被引入到可能的位置以与另一个Cys形成二硫桥。 Pro可以因其特别平面的结构而被引入。
本发明的肽可以被化学合成。合成肽可以用熟知的固相、液相，或肽缩合(peptide condensation)技术,或任何其组合制备，并且可以包括天然的和/或合成的氨基酸。用于肽合成的氨基酸可以是使用Merrifield的原创的固相程序的标准去保护、中和、耦联和洗涤方法(J. Am. Chem. Soc,第85卷，2149-2154，1963)的标准Boc (N°-氨基保护的 N°-t-丁基氧羰基)氨基酸树脂，或碱敏感的N°-氨基保护的9-芴基甲氧羰基(Fmoc)氨基酸(Carpino 和 Han, J. Org. Chem.，第 37 卷，3403-3409，1972)。此外，本发明的方法可以使用本领域技术人员熟知的其他Na-保护的基团。固相肽合成可以用本领域的普通技术(参见例如 Stewart 和 Young, Solid Phase Synthesis (固相合成)，第二版，Pierce Chemical Company, Rockford, 111. , 1984;Fields和Noble, Int. J. Pept. Protein Res.,第 35卷，161-214，1990)，或用自动合成仪完成。
下述实施例仅仅是为了进一步举例说明本发明，并非要限制由权利要求确定的本发明的范围。
实施例I
屎肠球菌LWP50-52、仓鼠链球菌LWP-760以及唾液乳杆菌PVD-32菌株的细胞被平板接种在含有约300mL下列介质的烧瓶中布氏肉汤，10%布氏肉汤或如下表I所不的由氨基酸补充的M9。在约37° C振荡培养约2、4、6和8小时。旋转速度约为120rpm。约-4° C 下将培养液的等分试样在约6000Xg离心约15分钟。通过用约40%的(NH4)2SO4溶液在约 4° C沉降蛋白大约24小时，随后通过使用SupeiOse-12高分辨色谱凝胶过滤并选择低分子量级份而将蛋白分离。这些级份被施于辛基-琼脂糖凝胶6B Fast Flow (快速流动)疏水作用色谱柱并用约O. IM Tris缓冲液中，pH 5. I的O. 4-0. 9M的K2HPO梯度洗脱。结果在下面示于表I中。从表I可见，从生产者PVD 32,LffP 50-52以及LWP 760分离的肽是低分子量的并且主要在含饥饿法介质的培养物中积累(M9+指明的氨基酸)。
表I来自菌株PVD-32、LWP-50_52以及LWP-760的诱导者狀的分离和钝化
权利要求
1.一种具有SEQ ID NO I的羧基端氨基酸序列的肽。
2.一种具有SEQ ID NO 3的氨基酸序列的肽。
3.一种具有SEQ ID NO 5的氨基酸序列的肽。
4.一种具有SEQ ID NO 7的氨基酸序列的肽。
5.一种用于增加细菌素产生的方法，包括a.向培养物体系添加产细菌素细菌和诱导者细菌，b.添加具有SEQID NO I的羧基端氨基酸序列的肽，以及c.培养所述细菌和所述肽一段时间以实现增加的所述细菌素的产生。
6.一种用于刺激具有SEQ ID NO 2的细菌素的产生的方法，包括a.向培养物体系添加产细菌素细胞系NRRL-B-30514和诱导者细胞系NRRL30884，b.添加具有SEQID NO 3的肽，以及c.培养所述细菌和所述肽一段时间以实现增加的所述细菌素的产生。
7.一种用于刺激具有SEQ ID NO 4的细菌素的产生的方法，包括a.向培养物体系添加产细菌素细胞系NRRLB-30746和诱导者细胞系NRRLB-30510，b.向所述体系添加具有SEQID NO 5的肽，以及c.培养所述细菌和肽一段时间以实现增加的所述细菌素的产生。
8.一种用于刺激具有SEQ ID NO 6的细菌素的产生的方法，包括d.向培养物体系添加产细菌素细胞系NRRLB-30745和诱导者细胞系NRRLB-30510，e.添加具有SEQID NO 7的肽，以及f.培养所述细菌和所述肽一段时间以实现增加的所述细菌素的产生。
9.一种用于刺激具有SEQ ID NO 2的细菌素的产生的方法，包括a.向培养物体系添加产细菌素细胞系NRRL-B-30514和诱导者细胞系NRRL30884，b.添加具有SEQID NO I的羧基端氨基酸序列的肽，以及c.培养所述细菌和所述肽一段时间以实现增加的所述细菌素的产生。
10.一种用于刺激具有SEQ ID NO 4的细菌素的产生的方法，包括g.向培养物体系添加产细菌素细胞系NRRLB-30746和诱导者细胞系NRRLB-30510，h.向所述体系添加具有SEQID NO I的羧基端氨基酸序列的肽，以及i.培养所述细菌和所述肽一段时间以实现增加的所述细菌素的产生。
11.一种用于刺激具有SEQ ID NO 6的细菌素的产生的方法，包括j.向培养物体系添加产细菌素细胞系NRRL B-30745和诱导者细胞系NRRL B-30510,k.添加具有SEQ ID NO I的羧基端氨基酸序列的肽，以及I.培养所述细菌和所述肽一段时间以实现增加的所述细菌素的产生。
全文摘要
由产细菌素细菌产生的新型的肽在体外刺激细菌素的产生。为了实现细菌肽产生的增加，在新的诱导者细菌和具有VKGLT的羧基端序列的肽的存在下培养所述生产者细菌。
文档编号C12R1/46GK102977187SQ20121029159
公开日2013年3月20日 申请日期2006年12月8日 优先权日2005年12月8日
发明者N·J·斯特恩, E·A·斯韦托奇, B·V·叶鲁斯拉诺夫, V·V·佩雷列金, V·P·列夫查克 申请人:由农业部部长代表的美利坚合众国, 国家应用微生物和生物技术研究中心