专利名称：一种对枇杷枝条和叶片同时致病的真菌以及用途的制作方法
技术领域：
本发明属于植物真菌，特别是，属于一种可以同时对枇杷叶片和枝条致病的真菌以及对该真菌的用途。
背景技术：
枇杷iEriobotrya Japonica )是一种亚热带果树,原产中国，果实酸甜可口，叶片可入药，具有清热、润肺、止咳化痰等功效。
拟盘多毛孢属iPestalotiopsis)真菌可引起枇杷上多种叶部病害，在叶片上形成圆形或不规则形灰褐色病斑，直径2-13mm，发病重时病斑可连接在一起，病害后期病斑处长出黑色小点。如 Pestalotiopsis eriobotrifolia、Pestalotiopsiseriobotryae-japonica引起的枇杷叶部病害。通常可从叶片的病健交界处分离获得致病菌，并纯化保存菌种，可以利用这些菌种对枇杷进行抗病性鉴定和筛选，最终获得抗该病原菌的枇杷新品种，也可以利用这些菌种进行其它实验研究，例如用于研究和开发防治或防止枇杷该病害的药剂。
发明内容
本发明研究小组在枇杷枝条上发现一种新的致病菌，聚多拟盘多毛孢iPestalotiopsis sydowiana),该病菌既可以对枇杷的叶片致病，也可以使枇杷枝条致病。这与其他以往只在枇杷叶片上发现的拟盘多毛孢属致病菌不同。基于其在枇杷枝条上的新致病性状，该致病菌可以作为枇杷抗病性育种的一种新的便利工具。利用该病原菌进行抗病性鉴定可以获得的抗该病害的枇杷新品种，筛选出叶片和枝条均抗聚多拟盘多毛孢iPestalotiopsis sydowiana)的批杷新品种。一方面，本发明提供一种对枇杷枝条和叶片同时致病的真菌，该真菌为中国普通微生物菌种保藏管理中心的保藏号为CGMCC NO. 6493的聚多拟盘多毛孢(Pestalotiopsissydowiana)
一方面，本发明提供一种用于枇杷枝条抗病性育种筛选的真菌，该真菌为在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC NO. 6493的聚多拟盘多毛孢(Pestalotiopsis sydowiana)。优选的方式中，该病菌既可以让枇杷叶片感病，又可以让枇杷的枝条发病。另一方面，本发明提保藏号为CGMCC NO. 6493的聚多拟盘多毛孢{Pestalotiopsis sydowiana)真菌，作为枇杷抗病性育种筛选的应用。在优选的方式中，把病菌同时接种在枇杷叶片和枇杷的枝条上。在一些优选的方式中，用IO6个/mL的该真菌的分生孢子悬浮液接种到离体的枇杷嫩茎或活体的枇杷嫩茎上。本发明还提供一种筛选枇杷抗病性品种的方法，该方法包括提供保藏号为CGMCC NO. 6493的真菌，或通过培养保藏号为6493的真菌，聚多拟盘多毛孢(Pestalotio^is yoWiaflaA获裔分生孢子悬浮液,浓度为IO6个/mL;把菌丝或分生孢子悬浮液接种到枇杷的枝叶上；接种处用透明塑料袋包裹，内置棉花保湿，置于20-30°C的温室大棚培养48 h ;然后去除塑料袋，进行日常的栽培管理；
观察枇杷的枝条感病或抗病，获得抗聚多拟盘多毛孢sydowiana)的枇杷品种。保藏信息
编号NNH-B-4的菌株的保藏日期为2012年9月3日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所；保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏号为=CGMCC No. 6493，中文名称为聚多拟盘多毛孢，拉丁文学名为-.Pestalotiopsis sydowiana。
有益效果
本发明分离纯化的真菌即可以对枇杷的叶片和枝条致病，为鉴定筛选抗该真菌的枇杷新品种提供了新的途径，可以避免传统方法筛选出现假抗病的现象。
实施例实施例I :病原分离物的分离纯化
于2012年2月15日采集于浙江宁波宁海的枇杷干枯病的典型病枝，切取病健交界的小块茎或叶片组织，置于弱酸性PSA培养基(土豆200 g，蔗糖20 g，琼脂18 g，水IOOOmL,pH 6.0)，培养3 d。对长出的所有不同菌落，挑取少量菌丝进行分离。对分离后的不同分离物进行单胞培养，获得病原分离物13个。这些病原分离物在25°C光照培养箱进行培养，至产生大量分生孢子器。实施例2 :致病性接种初步鉴定
对在实施例I中获得的13个病原分离物进行致病性接种鉴定。鉴定方法采用枇杷离体嫩茎接种方法分别用分离物的菌丝块(5X20 mm)和分生孢子悬浮液(IO6个/mL)接种离体的枇杷嫩茎。嫩茎截成8 cm长的小段，菌丝块接种在伤口上，伤口用棉花保湿，紧密包裹嫩茎。分生孢子液用小型喷雾器均匀喷洒在嫩茎上；各处理置于9 cm的培养皿中，于25°C光照培养箱保湿培养10 d (12 h光照/12 h黑暗)，每个处理重复3次。其中接种4 d和10 d后编号为NNH-B-4的菌丝块和分生孢子液接种处分别出现了茎部褐变症状。而其他12个分离物则与对照相同，没有明显症状。对照处理为无菌水，接种方法和处理时间同上。实施例3 :致病性接种田间活体鉴定
为了进一步说明NNH-B-4的致病性，用I年生的原寄主“宁海白”枇杷苗进行活体接种分别用NNH-B-4的菌丝块和分生孢子液接种枇杷苗，接种茎干和叶片，接种方法同上，接种处用透明塑料袋包裹，内置棉花保湿，置于20-30°C的温室大棚培养48 h。然后去除塑料袋，进行日常的栽培管理。每个处理3个重复。接种4 d后，菌丝块接种的枇杷苗最先出现病症——莖部变褐，叶片自叶柄沿叶脉向外枯黄变褐；接种15 d后，分生孢子液接种处出现干枯病的典型病症。因此，分离物NNH-B-4是引起枇杷干枯病的致病真菌。实施例4 :病原培养鉴定
于25°C培养病原菌NNH-B-4，其在PSA培养基上形成白色绒毛状菌落，具痂状轮纹，背面密黄色。25°C培养7 d后产生黑色小团状子实体(485. 4 - 385. 6 μ m)。分生孢子5细胞，梭形或纺锤形，直或略弯曲，20. 9-29.8X7. 1-14. 5 μ m ;中间3色胞异色，第1、2色胞深褐色，第3色胞浅褐色，分隔处缢缩；顶孢无色，三角形，具2-3根附属丝，大角度分开，长12. 0-33. I μ m ;尾孢无色，三角形或圆锥形，具中生式柄I根，长3. 3-7. 8 μ m,尾孢细胞大于顶孢细胞。根据该分离物的形态特征初步鉴定该菌为sydowiarm。实施例5 :病原菌分子鉴定
用引物 ITS4(5' -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')和 ITSl (5' - TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3' ) PCR扩增该病原菌的rDNA Internal Transcibed Spacer序列(ITS),经测序获得一个 550 bp 的序列，具体序列如下TCCGTAGGTGAACCTGCGGAGGGATCATTATAGAGITTTCTAAACTCCCAACCCATGTGAACTTACCTTTTGTTGCCTCGGCAGAAGTTATAGGTCTTCTTATAGCTGCTGCCGGTGGACCATTAAACTCTTGTTATTTTATGTAATCTGAGCGTCTTATTTTAATAAGTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACCTTGCGCCCATTAGTATTCTAGTGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTTAAGCCTAGCTTAGTGTTGGGAATCTACTTCTCTTAGGAGTTGTAGTTCCTGAAATACAACGGCGGATTTGTAGTATCCTCTGAGCGTAGTA ATTTTTTTCTCGCTTTTGTTAGGTGCTATAACTCCCAGCCGCTAAACCCCCAATTTTTTGTGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGA。该序列在 Genbank 中检索发现其与Pestalotiopsis sydowiana 的相似性高达 99%。综合培养形态与ITS分子鉴定结果认为引起枇杷干枯病的病原菌为拟盘多毛孢属聚多拟盘多毛抱{Pestalotiopsis sydowiana) 实施例6 :病原菌的用途
Pestalotiopsis属真菌可引起枇杷上多种叶部病害,在叶片上形成圆形或不规则形灰褐色病斑，直径2_13mm,发病重时病斑可连接在一起，病害后期病斑处长出黑色小点。如Pestalotiopsis eriobotri folia'Pestalotiopsis eri obo tryae-japoni ca 弓 I起白勺朴匕把口十部病害。尚未有报道由属病原菌引起的枇杷枝条病害。以往的文献资料报道聚多毛孢对杜醇、茶树等植物致病，这是首次发现sydowiana能够对枇杷致病。其能引起枇杷的嫩茎枯萎，叶片产生大病斑(直径大于20 mm)，枝条枯死，严重时整棵树死亡。用A eriobotrifolia (由浙江大学农业生物技术学院徐同教授惠赠)、P.eri obo tryae-japoni ca (由浙江大学农业生物技术学院徐同教授惠赠):私本发明的P.
的菌丝块对枇杷离体叶片和枝条进行接种比较。5 mm2的菌丝块对枇杷莖的接种方法同上，每个茎接种一个菌丝块；5 mm2的菌丝块等距离放置在枇杷叶片叶脉的一侦牝每个菌丝块相距约40 mm, 一个叶片最多放置3个菌丝块，每个处理重复3次。于25°C光照培养箱保湿培养10 d (12 h光照/12 h黑暗)，结果发现A eriobotrifolia M P.eri obo tryae-japoni ca只能对枇杷叶片致病,产生小的圆形或不规则形病斑；而本发明的P. SjOrOffiaaa对叶片和枝条都有非常好的致病效果。A SjOrOffiaaa接种4 d后枝条和叶片出现病症，枝条发病处褐变，僵硬，长约5mm ;枝条病斑扩展稍缓慢，而叶片病斑扩展迅速，接种第8天时叶片病斑已经大于20 mm，其病斑初期主要在叶肉间扩展，后期侵染叶脉，导致叶片整个死亡。表I /I eriobotrifolia、P. eriobotryae-japonica 取P. SjOrOffiaaa 的致病性。
权利要求
1.一种对枇杷枝条和叶片同时致病的真菌，该真菌为中国普通微生物菌种保藏管理中心的保藏号为CGMCC NO. 6493的聚多拟盘多毛孢的NNH_B_4 菌株。
2.—种筛选枇杷抗病性品种的方法，该方法包括通过培养保藏号为CGMCC NO. 6493的聚多拟盘多毛孢sydowiana)的NNH_B_4菌株，资淳分生孢子悬浮液，让其浓度为IO6个/mL;把菌丝或分生孢子悬浮液接种到枇杷的枝条和页叶上；接种处用透明塑料袋包裹，内置棉花保湿，置于20-30°C的温室大棚培养48 h;然后去除塑料袋，进行日常的栽培管理；观察枇杷的枝条感病或抗病情况，获得抗聚多拟盘多毛孢(Pes talo ti op si s sydowiana)的批杷品种。
3.—种利用中国普通微生物菌种保藏管理中心的保藏号为CGMCC NO. 6493的聚多拟盘多毛孢sydowiana)的NNH-B-4菌株作为枇杷抗病育种的用途。
全文摘要
本发明提供一种对枇杷枝条和叶片同时致病的真菌，该真菌为中国普通微生物菌种保藏管理中心的保藏号为CGMCC NO.6493的聚多拟盘多毛孢(Pestalotiopsissydowiana)以及该真菌的用途。本发明分离纯化的真菌既可以对枇杷的叶片和枝条致病，为鉴定筛选抗该真菌的枇杷新品种提供了新的途径，可以避免传统方法筛选出现假抗病的现象。
文档编号C12R1/645GK102965289SQ201210515360
公开日2013年3月13日 申请日期2012年12月5日 优先权日2012年12月5日
发明者方丽, 王汉荣 申请人:浙江省农业科学院