专利名称：可用于检测与冠心病相关的pla2g7基因启动子区甲基化程度的试剂盒及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种辅助诊断冠心病的检测试剂盒，尤其是涉及ー种可用于检测与冠心病相关的基因启动子区甲基化程度的试剂盒及其应用。
背景技术：
冠状动脉粥样硬化性心脏病(coronary heart disease, CHD)简称冠心病，是心血管疾病的重要组成部分。据世界卫生组织(World Health Organization, WHO)报道，CHD是世界上致死和致残的主要原因之一，在2008年，约有1730万人死于CHD，在2030年之前，据估计将有2360万人将死于CHD。CHD症状表现为胸腔中央发生ー种压榨性的疼痛，并可迁延至颈、颌、手臂、后背及胃部。发作的其他症状可能有眩晕、气促、出汗、寒颤、恶心及昏厥。严重患者可能因为心カ衰竭而死亡。CHD是ー种由遗传因素和环境因素共同作用而引起的复杂性疾病，寻找其相关基因进而阐明冠心病发病的遗传机制已经成为目前研究的热点。虽然有越来越多的医学研究机构重视并开展冠心病的相关研究，但研究多集中于相关候选基因的单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)与冠心病的关联性上，其发病机理仍未被完全阐释清楚，这无疑妨碍了冠心病病理机制的理解和预防治疗水平的提闻。基因PLA2G7的功能是编码脂蛋白磷脂酶A2 (Lp-PLA2), Lp-PLA2能够催化产生各种致炎因子，水解氧化磷脂以形成溶血磷脂胆碱，还能氧化脂肪酸。已有文献报道Lp-PLA2的高活性以及量的増加能提高冠心病的风险。目前国内外已有不少研究报道了基因单核苷酸多态性与CHD发病的关系。但是，目前国内外还没有公开任何关于冠心病相关的基因启动子区甲基化程度的试剂盒的相关研究报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供ー种可用于检测与冠心病相关的基因启动子区甲基化程度的试剂盒及其应用，其中基因甲基化水平与冠心病的患病率在男性中呈负相关，在女性中呈正相关，并且检测效率高，针对性强。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为ー种可用于检测与冠心病相关的PLA2G7基因启动子区甲基化程度的试剂盒，其特征在于ー对PLA2G7基因启动子区甲基化特异性扩增引物及其甲基化特异性测序引物，其中所述的甲基化特异性扩增上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示
5’ -GTTTTGGGGAGGGTGTTG-3’ ；
所述的甲基化特异性扩增下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示
5’ -Biotin-ACCAACCCCTATCCCCCTAACTA-3’ ；
所述的甲基化特异性测序引物如SEQ ID NO. 3所示
5’ -AGTAITAITAGGGGAGGA-3’。
ー种可用于检测与冠心病相关的基因启动子区甲基化程度的试剂盒的应用，其特征在干在外周血检测中，该试剂盒可用于冠心病辅助检测、诊断或药物治疗中。与现有技术相比，本发明的优点在于本发明首次公开了可用于检测与冠心病相关的基因启动子区甲基化程度的试剂盒及其应用，在男性中，启动子区域的低甲基化水平导致基因的高表达，从而影响脂蛋白磷脂酶A2的转录与翻译，最后导致冠心病的发生和发展；而在女性中，启动子区域的高甲基化水平将导致冠心病的发展和发生。而且基因启动子区域甲基化水平可通过外周血检测得到，因此测定外周血中基因
启动子区域的甲基化水平，为检测冠心病的进展以及人群筛查和药物开发提供了新视野。综上所述，以基因启动子区域甲基化水平为基础的诊断试剂盒可以方便 快捷地在分子水平上实现对冠心病的检测，同时，以基因启动子区域DNA甲基化为靶点的药物有望成为冠心病辅助诊断、检测和筛选的ー种新手段。
图1为被检测序列所在区域(具体位置为Chr6:46703038-46703274)，以及所检测的4个CpG点之间的关联性分析结果(因为4个CpG岛之间相关系数r均大于0. 8，存在显著相关，所以取平均值代表整体甲基化水平);
图2为甲基化水平检测结果示例(如图示CpGl到CpG4的甲基化程度分别为6%，12%，8%，7%);图中阴影部分显示的是对应CpG位点的信号強度，结合该位点附近碱基种类可分析得到其甲基化水平(即阴影框对应的上方数字)。图3为年龄与甲基化程度的相关性研究(男性样本相关系数r为-0. 365，女性样本相关系数r为0. 373)。
具体实施例方式以下结合附图实施例对本发明作进ー步详细描述。
具体实施例1、研究对象的收集
募集愿意參加研究的志愿者，根据冠心病的国际诊断标准，将志愿者分为病例组和对照组，并采用调查表的形式调查志愿者的一般情况，同时采取静脉血，进行一般血生化检测，具体如下
从某医院收集冠心病患者，排除心源性休克、重度心カ衰竭、严重室性心律失常、伴有其他严重疾病如恶性肿瘤、严重肝肾疾病等，将冠脉造影结果严重于ー支主要动脉狭窄^ 50%归为病例组，将相对应的冠脉造影结果轻于ー支主要动脉狭窄〈50%归为对照组。最后确定冠心病病人36例(18男；18女)，同时收集性别匹配、年龄相仿的36名正常者作为对照((18男；18女)。对所有研究对象空腹抽血检测血脂、血糖等一般生化指标，同时抽取静脉血3ml入EDTA抗凝管中，_80°C低温储存，以备用于标本统ー提取基因组DNA。2、基因组DNA的提取
应用全自动核酸提取仪(中国厦门，致善/zeesan，Lab-Aid 820)提取样本的全血基因组DNA,再通过超核酸紫外测定仪(Wilmington, USA, Thermo scitif ic, NanoDrop 1000)检测所得DNA的浓度，以供基因启动子区DNA甲基化水平的检测。3、DNA甲基化水平测定
本研究采用重亚硫酸盐焦磷酸测序技术对基因启动子区的4个CpG位点(如图1)进行了 DNA甲基化水平检测。此技术的基本原理用重亚硫酸盐处理DNA样品后，再应用聚合酶链反应(PCR)扩增，可使发生甲基化的胞嘧啶(C)碱基保持不变，而使未发生甲基化的C转变成了尿嘧啶(U)，然后通过测序引物进行PCR测序，从而得到哪个位点发生了甲基化。本次研究采用PyroMark Assay Design软件进行引物设计,用于实验的PCR扩增引物和测序引物如下
(1)甲基化特异性上游引物(Forwardprimer) 5’ -GTTTTGGGGAGGGTGTTG-3’ (SEQ ID NO.1),
(2)甲基化特异性上游引物(Reverseprimer):5’ -Biotin-ACCAACCCCTATCCCCCTAACTA-3，(SEQ ID NO. 2)，
(3)甲基化特异性测序引物(Sequencingprimer)
5’ -AGTATTATTAGGGGAGGA-3’ (SEQ ID NO. 3)。具体实验步骤如下
A.采用 QIAGEN EpiTect 亚硫酸氢盐处理试剂盒(EpiTech Bisulfite Kits;Qiagen; #59104)对样本DNA进行亚硫酸氢盐转化。B.取步骤A中转化过的DNA样本20ng加入到Pyromark PCR试剂盒(PyromarkPCR Kit; Qiagen; #978703)，并加入上述ー对a -内收蛋白基因启动子区甲基化特异性扩增引物，进行PCR扩增，扩增条件首先95°C 15min的变性；接着95°C 15s, Tm 30s, 72 °C20s，共50个循环的退火反应；然后延伸反应72°C 5min。(注Tm在实验中根据跑PCR梯度温度确定)
C.焦磷酸测序的前期准备在PSQ96板中预先加入45iU含有0. 3iiM上述甲基化特异性测序引物的退火缓冲液(PyroMark Annealing Buffer;产品货号Qiagen; #979009)；将需要使用的混匀的琼脂糖珠总量(每样本3iU)转移到ー个Eppendorf 管中；在琼脂糖珠中加入结合缓冲液(PyroMark Binding Buffer;产品货号Qiagen; #979006),使得平均每个样品约有50 u I的体积，将混合物混匀；将以上混合物加入PCR产物(50 u I反应体积)中，每样本50 Ul ;将PCR产物在常温下混匀10分钟，使得磁珠与生物素结合；在真空预备工作站中，四个样品板中依次加入180ml的高纯水、70%こ醇、洗涤缓冲液(PyroMark WashBuffer;产品货号Qiagen; #979008)和 120ml 的变性缓冲液(PyroMark DenaturationSolution; Qiagen;产品货号#979007);打开真空预备工作站的泵，将真空准备工具在高纯水中清洗30秒；然后将真空准备工具(PyroMark Vacuum Prep Filter Probes;产品货号Qiagen; #979010)移到PCR板中，抓取琼脂糖珠(在磁珠与PCR产物结合后三分钟内完成此操作);拿起PCR板，检查是否大部分磁珠都被吸附在了真空准备工具上；将真空准备工具放入70%こ醇中5秒；然后移到变性缓冲液中5秒；再移到洗涤缓冲液中清洗5 —10秒；关掉栗；将真空准备工具放入含有测序引物的板中，摇动，释放琼脂糖珠(测序引物也可最后加入)；使用高纯水清洗真空准备工具；将放有样品的PSQ96板放在加热板上加热到80°C 2分钟，再冷却到室温，即可进行焦磷酸测序反应；D.焦磷酸测序在PyroMark Q24焦磷酸测序仪上,采用Pyromark Gold Q24试剂盒(Pyromark Gold Q24 Reagents; Qiagen; #978802)对步骤 C 中的 PSQ96 板中的样本进行测序，然后应用PyroMark CpG软件对结果进行甲基化分析(甲基化水平检测结果示例见图2)。4、数据分析
本次研究采用SPSS 16. 0对数据进行整理分析，我们发现被检测的4个CpG位点之间存在显著关联(相关系数r > 0.8，P < 0.01，说明4个CpG之间存在显著相关，见图1)，所以后期我们选择取4个CpG甲基化的平均值来代表 整体的甲基化水平。在总样本的病例对照比较中，我们得到了甲基化程度的显著性差异(P=O. 026，P〈0. 05说明样本存在显著性差异)，所以我们做了性别的分层分析，在性别分组的病例对照差异对比中，我们发现女性样本中的DNA甲基化差异(P=O. 003)比男性样本(P=O. 096)更显著(见表I)。基因的DNA甲基化水平还与样本对象的抽烟，糖尿病，高血压情况有夫。另外，在年龄和甲基化程度的相关性研究中，我们发现男性样本中年龄与甲基化程度呈负相关(r=-0. 365，图3)，这与男性吸烟、喝酒等生活习惯导致的环境因素相关；而在女性样本中，年龄与甲基化程度呈正相关(r=0. 373，图3)，这与女性绝经期后激素水平变化而导致冠心病风险提升有夫。与其他传统的冠心病检测技术相比，此试剂盒技术具有准确可靠、灵活快速和经济节约的优点。本发明本发明采用上述试剂盒对基因启动子区甲基化水平进行检测，能够快速可靠地为冠心病的辅助诊断、检测或筛查药物提供借鉴。表1.总体与性别分组对各项指标的分析(n=72)
权利要求
1.一种可用于检测与冠心病相关的/^^^7基因启动子区甲基化程度的试剂盒，其特征在于一对/^^^7基因启动子区甲基化特异性扩增引物及其甲基化特异性测序引物，其中所述的甲基化特异性扩增上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示5’ -GTTTTGGGGAGGGTGTTG-3’ ； 所述的甲基化特异性扩增下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示5’ -Biotin-ACCAACCCCTATCCCCCTAACTA-3’ ； 所述的甲基化特异性测序引物如SEQ ID NO. 3所示5’ -AGTATTATTAGGGGAGGA-3’。
2.一种如权利要求1所述的可用于检测与冠心病相关的基因/^^^7启动子区甲基化程度的试剂盒的应用，其特征在于在外周血检测中，该试剂盒可用于冠心病辅助检测、诊断或药物治疗中。
全文摘要
本发明公开了可用于检测与冠心病相关的PLA2G7基因启动子区甲基化程度的试剂盒及其应用，特点是该试剂盒包括一对PLA2G7基因启动子区甲基化特异性扩增引物及一个甲基化特异性测序引物，其中上游引物具有如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列，下游引物具有如SEQIDNO.2所示的核苷酸序列，甲基化特异性测序引物如SEQIDNO.3所示，优点是该诊断试剂盒可以方便快捷地在分子水平上实现对冠心病的检测，检测效率高，针对性强，同时，以PLA2G7基因启动子区甲基化为靶点的药物有望成为冠心病辅助诊断、检测和筛选的一种新手段。
文档编号C12Q1/68GK103014165SQ20121056087
公开日2013年4月3日 申请日期2012年12月20日 优先权日2012年12月20日
发明者蒋丹捷, 段世伟, 吴莎莎 申请人:宁波大学