用于肌营养不良的诊断和治疗随访的方法
【专利摘要】本发明涉及通过检测体液中、尤其是尿液中的微RNA来进行肌营养不良的诊断、随访和治疗效能评估。
【专利说明】用于肌营养不良的诊断和治疗随访的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及通过检测体液中、尤其是尿液中的微RNA来进行肌营养不良的诊断、 随访和治疗效能评估。
【背景技术】
[0002] Duchenne型肌营养不良（DMD)和Becker型肌营养不良（BMD)由编码肌养蛋白的 基因的突变或缺失造成（Munt〇ni，T〇relli等，2003)。在表型最为严重的第一种情形中，肌 养蛋白完全不存在。允许细胞内肌动蛋白微丝附着于细胞外基质（LeRumeur,Winder等） 的DAPC复合物（肌养蛋白结合蛋白复合物）也不存在。这种复合物通常保护经历收缩和 松弛的肌纤维的膜。在它不存在的情况下，纤维不再受到保护，并且我们在肌肉中观察到经 历变性的肌细胞和作为倾向于抵消这种现象的再生的证据的新细胞（Batchelor和Winder 2006)。最终，再生不充分，并且纤维被脂肪组织代替。
[0003] 在治疗上，目前将最大的希望放在外显子跳跃技术上（Cirak,Arechavala-Gomeza 等；Lu，Yokota等）。事实上，引起严重性较低的表型的BMD也是由编码肌养蛋白的基因中 的一个或多个突变造成的，但是蛋白质的基本结构域被保留：
[0004] -与肌动蛋白微丝结合的N-端结构域，
[0005] -与DAPC复合物结合的富含半胱氨酸的C-端结构域。
[0006] 因此，对于DMD患者来说，可以通过排除信使RNA(mRNA)内带有无义突变的外显子 来获得Becker表型，并因此恢复开放阅读框。这样产生的较短的蛋白有部分功能。这种策 略目前正在几项临床试验中进行试验。
[0007] 定期的多学科医学监测能够评估病理进展并提出管理方案以延长患者的寿命。 它包括防止退缩、提供技术帮助、物理疗法、心脏监测、整形外科和呼吸辅助。诊断随访通 过例如运动功能评估，通过肌肉活检或通过循环中分泌的酶，肌酸激酶的测定等来进行 (Bushby,Finkel等）。
[0008] 肌肉活检分析能够观察受损的纤维、表明肌肉再生的较小纤维以及被脂肪组织代 替的坏死区。这种方法的缺点在于它对患者具有非常大的侵入性。
[0009] 另一种方法由测定血液中的肌酸激酶（CK)构成。这种酶与几种细胞类型中存在 的能量代谢相关。它在血液中浓度的增加表明了肌纤维的降解状态。然而，这种生物标志 物不是完全可靠的，因为他的水平也取决于应激，例如体力活动（Nicholson,Morgan等， 1986)。还存在其他的酶例如醛缩酶或乳酸脱氢酶，但是与CK的情况相同，它们的丰度不仅 仅依赖于病理状态（Lott和Landesman1984)。
[0010] 因此，在Duchenne型肌营养不良的情形中，似乎必需鉴定更可靠的新的生物标志 物，可以在非侵入性样品例如尿液样品的基础上测定的标志物。
[0011] 微RNA(或miRNA)是有希望的生物标志物。它们在身体的所有组织中，尤其是骨骼 肌中表达。还已知道，它们以"循环"状态存在于所有生物流体中（Weber，Baxter等）。文献 中的最近工作显示，Duchenne型肌病的特有识别标志存在于肌肉（Cacchiarelli，Martone 等；Greco,DeSimone等，2〇〇9)和血清（Cacchiarelli，Legnini等）中。
[0012] 到目前为止，没有研究显示出miRNA用作在尿液中肌营养不良标志物的潜在用 途。本发明人调查了在患有肌营养不良的患者的尿液中miRNA的存在情况，以便鉴定这种 类型的障碍特有的识别标志。
[0013] 此外，本发明人还调查了肌营养不良的新的循环标志物。
[0014] 发明概述
[0015] 本发明人尤其是调查了DMD患者的尿液样品，以便确定是否可以鉴定这种障碍特 有的miRNA。这一工作显示，存在与某些miRNA在DMD患者的尿液中比在健康供体的尿液中 更加丰富的表达相关的特异性识别标志。
[0016] 一种或多种miRNA在患病个体中相对于健康个体中的表达的这种变化的发现，在 诊断领域中找到应用。因此，本发明涉及将选自表1中的miRNA的至少一种miRNA应用于 诊断肌营养不良的方法。它还涉及使用一种或多种所述miRNA来评估发生或出现肌营养不 良的风险。
[0017]表1 :
[0018]
【权利要求】
1. 一种用于诊断或评估在对象中发生或出现肌营养不良的风险的方法，所述方法包括 测量所述对象的尿液样品中至少一种微RNA的表达水平，并将在所述尿液样品中测量到的 所述表达水平与在健康参比样品中获得的水平进行比较，所述表达水平相对于所述参比样 品之间的差异指示了所述对象中的营养不良。
2. 权利要求1中所要求的方法，其中所述至少一种微RNA选自let-7f、let-7a、 miR-548d_5p、miR-183、miR-490_3p、miR-520a_3p、miR-590_3p、miR_15a、miR-1244、 miR-328、miR-494、miR-668、miR-208、miR-521、miR-597、miR-874、miR-224、miR-182、 miR_23b、miR-492、let_7c、let_7e、miR_15b、miR_487b、miR-410、miR-139_5p、miR_216b、 miR-423_5p、miR-484、miR_23a、miR_376c、miR-412、miR-433、miR-206、miR-335、 miR_33a*、miR-193a_3p、miR-381、miR-34c_5p、miR-628_3p、miR-659、miR-505*、let_7b、 let_7d、let_7g、miR_196b、miR_26b、miR-942、miR_200b*、miR-523、miR-346、miR-155、 miR-548b-5p、miR-548c-5p、miR-518f、miR-886-3p、miR-650、miR-720、miR-593、miR-657、 miR-502_3p、miR-198、miR-214、miR-220、miR-373、miR-511、miR_517b、miR-518a_3p、 miR-518b、miR-518e、miR-520g、miR-493、miR-151-5p、miR-192*、miR-28-5p、miR-30d 和 miR-30e_3p〇
3. -种用于诊断或评估在对象中发生或出现肌营养不良的风险的方法，所述方法包 括在所述对象的体液样品中测量至少一种微RNA的表达水平，所述微RNA选自let-7f、 let_7a、miR-548d_5p、miR-183、miR-490_3p、miR-520a_3p、miR-590_3p、miR_15a、 miR-1244、miR-328、miR-494、miR-668、miR-208、miR-521、miR-597、miR-874、miR-224、 miR-182、miR_23b、miR-492、let_7c、let_7e、miR_15b、miR_487b、miR-410、miR-139_5p、 miR_216b、miR-423_5p、miR-484、miR_23a、miR_376c、miR-412、miR-433、miR-335、 miR_33a*、miR-193a_3p、miR-381、miR-34c_5p、miR-628_3p、miR-659、miR-505*、let_7b、 let_7d、let_7g、miR_196b、miR_26b、miR-942、miR_200b*、miR-523、miR-346、miR-155、 miR-548b_5p、miR-548c_5p、miR_518f、miR-886_3p、miR-650、miR-720、miR-593、miR-657、 miR-502_3p、miR-198、miR-214、miR-220、miR-373、miR-511、miR_517b、miR-518a_3p、 miR-518b、miR-518e、miR-520g、miR-493、miR-151-5p、miR-192*、miR-28-5p、miR-30d 和 miR-30e_3p〇
4. 一种用于监测肌营养不良的演变的方法，所述方法包括在对象的第二体液样品中中 测量至少一种微RNA的表达水平，所述微RNA选自let-7f、let-7a、miR-548d-5p、miR-183、 miR-490_3p、miR-520a_3p、miR-590_3p、miR_15a、miR-1244、miR-328、miR-494、miR-668、 miR-208、miR-521、miR-597、miR-874、miR-224、miR-182、miR_23b、miR-492、let_7c、 let-7e、miR-15b、miR-487b、miR-410、miR-139-5p、miR-216b、miR-423-5p、miR-484、 miR_23a、miR_376c、miR-412、miR-433、miR-335、miR_33a*、miR-193a_3p、miR-381、 miR-34c-5p、miR-628-3p、miR-659、miR-505*、let_7b、let_7d、let_7g、miR-196b、miR-26b、 miR-942、miR_200b*、miR-523、miR-346、miR-155、miR-548b_5p、miR-548c_5p、miR_518f、 miR-886_3p、miR-650、miR-720、miR-593、miR-657、miR-502_3p、miR-198、miR-214、 miR-220、miR-373、miR-511、miR_517b、miR-518a_3p、miR_518b、miR_518e、miR_520g、 1^尺-493、1^1?-151-5口、1^1?-192*、1^1?-28-5口、1^1?-30(1和1^1?-3(^-3口，将所述对象的样品中 的这一水平与第一参比样品中所述微RNA的水平进行比较，所述第一参比样品对应于之前 从同一对象获取的样品； 所选的一种或多种微RNA的表达水平的演变，指示了肌营养不良的发展。
5. -种用于在对象中确定肌营养不良的治疗性治疗的效能的方法，所述方法包括： a) 测量所述对象的体液中一种或多种微RNA的表达水平，由此确定参比水平；然后 b) 在施用所述治疗性治疗之后的给定时间，测量在从同一对象获取的生物流体的第二 样品中在步骤a)中选择的所述至少一种微RNA的表达水平，由此确定试验水平；以及 c) 比较对照水平和试验水平，所选的微RNA的表达水平的演变指示了所述对象的有效 治疗； 所述一种或多种 miRNA 选自 let_7f、let_7a、miR-548d_5p、miR-183、miR-490_3p、 miR-520a_3p、miR-590_3p、miR_15a、miR-1244、miR-328、miR-494、miR-668、miR-208、 miR-521、miR-597、miR-874、miR-224、miR-182、miR_23b、miR-492、let_7c、let_7e、 miR-15b、miR-487b、miR-410、miR-139-5p、miR-216b、miR-423-5p、miR-484、miR-23a、 miR_376c、miR-412、miR-433、miR-335、miR_33a*、miR-193a_3p、miR-381、miR-34c_5p、 miR-628_3p、miR-659、miR-505*、let_7b、let_7d、let_7g、miR_196b、miR_26b、miR-942、 miR_200b*、miR-523、miR-346、miR-155、miR-548b_5p、miR-548c_5p、miR_518f、 miR-886_3p、miR-650、miR-720、miR-593、miR-657、miR-502_3p、miR-198、miR-214、 miR-220、miR-373、miR-511、miR_517b、miR-518a_3p、miR_518b、miR_518e、miR_520g、 miR-493、miR-151_5p、miR-192*、miR-28_5p、miR_30d 和 miR-30e_3p。
6. 权利要求3至5任一项中所要求的方法，所述样品是尿液样品。
7. -种用于在对象中（a)监测肌营养不良的演变或（b)确定肌营养不良的治疗性 治疗的效能的方法，所述方法包括测量所述对象的尿液样品中至少一种微RNA的表达水 平，所述微 RNA 选自 let-7f、let-7a、miR-548d-5p、miR-183、miR-490-3p、miR-520a-3p、 miR-590-3p、miR-15a、miR-1244、miR-328、miR-494、miR-668、miR-208、miR-521、miR-597、 miR-874、miR-224、miR-182、miR_23b、miR-492、let_7c、let_7e、miR_15b、miR_487b、 miR-410、miR-139_5p、miR_216b、miR-423_5p、miR-484、miR_23a、miR_376c、miR-412、 miR-433、miR-206、miR-335、miR_33a*、miR-193a_3p、miR-381、miR-34c_5p、miR-628_3p、 miR-659、miR-505*、let_7b、let_7d、let_7g、miR_196b、miR_26b、miR-942、miR_200b*、 miR-523、miR-346、miR-155、miR-548b-5p、miR-548c-5p、miR-518f、miR-886-3p、miR-650、 miR-720、miR-593、miR-657、miR-502-3p、miR-198、miR-214、miR-220、miR-373、miR-511、 miR-517b、miR-518a-3p、miR-518b、miR-518e、miR-520g、miR-493、miR-151-5p、miR-192*、 miR-28_5p、miR_30d 和 miR-30e_3p。
8. 权利要求1至7任一项中所要求的方法，所述一种或多种microRN选自let-7f、 let_7a、miR-548d_5p、miR-183、miR-490_3p、miR-520a_3p、miR-590_3p、miR_15a、 miR-1244、miR-328、miR-494、miR-668、miR-208、miR-521、miR-597、miR-874、miR-224、 miR-182、miR_23b、miR-492、let_7c、let_7e、miR_15b、miR_487b、miR-410、miR-139_5p、 miR-216b、miR-423-5p、miR-484、miR-23a、miR-376c、miR-412、miR-433、miR-206、miR-335、 miR_33a*、miR-193a_3p、miR-381、miR-34c_5p、miR-628_3p、miR-659、miR-505*、let_7b、 let_7d、let_7g、miR_196b、miR_26b、miR-942、miR_200b*、miR-523、miR-346、miR-155、 miR-548b-5p、miR-548c-5p、miR-518f、miR-886-3p、miR-650、miR-720、miR-593、miR-657、 miR-502_3p、miR-198、miR-214、miR-220、miR-373、miR-511、miR_517b、miR-518a_3p、 miR-518b、miR-518e、miR-520g 和 miR-493〇
9. 权利要求1至8任一项中所要求的方法，所述一种或多种miRNA选自let-7f、 let_7a、miR-548d_5p、miR-183、miR-490_3p、miR-520a_3p、miR-590_3p、miR_15a、 miR-1244、miR-328、miR-494、miR-668、miR-208、miR-521、miR-597、miR-874、miR-224、 miR-182、miR_23b、miR-492、let_7c、let_7e、miR_15b、miR_487b、miR-410、miR-139_5p、 miR-216b、miR-423-5p、miR-484、miR-23a、miR-376c、miR-412、miR-433、miR-206、miR-335、 miR_33a*、miR-193a_3p、miR-381 和 miR-34c_5p。
10. 权利要求1至9任一项中所要求的方法，所述一种或多种miRNA选自let-7f、 let_7a、miR-548d_5p、miR-183、miR-490_3p、miR-520a_3p、miR-590_3p、miR_15a、 miR-1244、miR-328、miR-494、miR-668、miR-208、miR-521、miR-597 和 miR-874。
11. 权利要求1至10任一项中所要求的方法，所述方法包括测量列出的所有miRNA。
12. 权利要求1至11任一项中所要求的方法，用于Duchenne型肌营养不良或Becker 型肌营养不良、尤其是Ducherme型肌营养不良的诊断、风险评估、演变监测或治疗效能监 测。
13. -种试剂盒，其包含用于微RNA的检测或测定的用品，所述试剂盒中用于检测或 测定的用品由用于一种或多种miRNA的检测或测定的用品构成，所述miRNA选自let-7f、 let_7a、miR-548d_5p、miR-183、miR-490_3p、miR-520a_3p、miR-590_3p、miR_15a、 miR-1244、miR-328、miR-494、miR-668、miR-208、miR-521、miR-597、miR-874、miR-224、 miR-182、miR_23b、miR-492、let_7c、let_7e、miR_15b、miR_487b、miR-410、miR-139_5p、 miR-216b、miR-423-5p、miR-484、miR-23a、miR-376c、miR-412、miR-433、miR-206、miR-335、 miR_33a*、miR-193a_3p、miR-381、miR-34c_5p、miR-628_3p、miR-659、miR-505*、let_7b、 let_7d、let_7g、miR_196b、miR_26b、miR-942、miR_200b*、miR-523、miR-346、miR-155、 miR-548b-5p、miR-548c-5p、miR-518f、miR-886-3p、miR-650、miR-720、miR-593、miR-657、 miR-502_3p、miR-198、miR-214、miR-220、miR-373、miR-511、miR_517b、miR-518a_3p、 miR-518b、miR-518e、miR-520g、miR-493、miR-151-5p、miR-192*、miR-28-5p、miR-30d 和 miR-30e_3p〇
14. 权利要求13中所要求的试剂盒，每个所述miRNA利用探针和/或特异性引物对来 检测或测定。
15. -种用于PCR的多孔支持物，其包含由至少两种miRNA的特异性引物构成的PCR引 物对，所述 miRNA 选自 let-7f、let-7a、miR-548d-5p、miR-183、miR-490-3p、miR-520a-3p、 miR-590_3p、miR-l 5a、miR_l 244、miR-328、miR-494、miR-668、miR-208、miR-521、miR-597、 miR-874、miR-224、miR-182、miR_23b、miR-492、let_7c、let_7e、miR_15b、miR_487b、 miR-410、miR-139_5p、miR_216b、miR-423_5p、miR-484、miR_23a、miR_376c、miR-412、 miR-433、miR-206、miR-335、miR_33a*、miR-193a_3p、miR-381、miR-34c_5p、miR-628_3p、 miR-659、miR-505*、let_7b、let_7d、let_7g、miR_196b、miR_26b、miR-942、miR_200b*、 miR-523、miR-346、miR-155、miR-548b-5p、miR-548c-5p、miR-518f、miR-886-3p、miR-650、 miR-720、miR-593、miR-657、miR-502-3p、miR-198、miR-214、miR-220、miR-373、miR-511、 miR-517b、miR-518a-3p、miR-518b、miR-518e、miR-520g、miR-493、miR-151-5p、miR-192*、 miR-28-5p、miR-30d和miR-30e-3p，各个引物对被安排在所述支持物的不同孔中。
【文档编号】C12Q1/68GK104271760SQ201280062188
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2012年12月14日 优先权日:2011年12月16日
【发明者】劳伦斯·让松-莱尔, 大卫·伊斯拉雷利, 法蒂玛·阿莫尔, 托马斯·沃伊特 申请人:吉尼松公司, 肌肉学研究协会