嵌合的双链核酸的制作方法

嵌合的双链核酸的制作方法
【专利摘要】本发明公开了借助反义作用抑制靶基因表达的双链核酸复合物，和使用该双链核酸复合物的方法。一种用于减少细胞中转录产物水平的方法包括使组合物与细胞接触，所述组合物包含双链核酸复合物，所述双链核酸复合物包含与第二核酸链复性的第一核酸链，其中第一核酸链(i)包含核苷酸和任选地核苷酸类似物，并且第一核酸链中核苷酸和核苷酸类似物的总数是8至100，(ii)包含当第一核酸链与转录产物杂交时由RNA酶H识别的至少4个连续核苷酸，并且(iii)第一核酸链与转录产物杂交；和第二核酸链包含核苷酸和任选地核苷酸类似物。
【专利说明】嵌合的双链核酸

【技术领域】
[0001] 本申请涉及具有借助反义作用抑制靶基因表达的活性的双链核酸，并且更具体 地，涉及包含反义核酸和与所述反义核酸互补的核酸的双链核酸，所述反义核酸与靶基因 的转录产物互补并含有包含4个或更多个连续碱基的区域。

【背景技术】
[0002] 近年来，寡核苷酸已经成为正在开发的称作核酸药物的药物产品中的目的主题， 并且特别地，从靶基因的高度选择性和低毒性的观点看，利用反义方法开发核酸药物正在 活跃进行中。反义方法是通过引入与靶基因的mRNA(有义链）的部分序列互补的寡核苷酸 (反义寡核苷酸（AS0))至细胞中，选择性抑制靶基因编码的蛋白质表达的方法。
[0003] 如图1 (上半部分）中所示，将包含RNA的寡核苷酸作为AS0引入细胞时，AS0与 靶基因的转录产物（mRNA)结合，并且形成部分的双链。已知这种双链发挥覆盖物的作用以 防止核糖体翻译，并且因此抑制靶基因编码的蛋白质的表达。
[0004] 在另一方面，将包含DNA的寡核苷酸作为AS0引入细胞时，形成部分的DNA-RNA异 双链体。由于RNA酶Η识别这种结构，靶基因的mRNA因而分解，抑制靶基因编码的蛋白质 的表达。（图1，下半部分）。另外，还已经发现在许多情况下，与使用RNA时相比，基因表达 抑制效应在使用DNA作为AS0(RNA酶Η依赖性途径）时更高。
[0005] 在利用寡核苷酸作为核酸药物的情况下，已经在考虑增强对靶RNA的结合亲和 力、体内稳定性等时开发多种核酸类似物如锁核酸（LNA)(注册商标）、其他桥连的核酸等。
[0006] 如图2中所示，由于天然核酸（RNA或DNA)的糖部分具有含4个碳原子和1个氧 原子的五元环，所以糖部分具有两种构象：Ν型和S型。已知这些构象从一种形式转变成 另一种形式，并且因而核酸的螺旋结构也采取不同形式：Α型和Β型。由于充当前述AS0 的靶的mRNA采取A型螺旋结构，糖部分主要处于N型，因此从增加对RNA的亲和力的观 点看，AS0的糖部分采取N型是重要的。已经在这种概念下开发的产品是修饰的核酸，如 LNA(2' -0, 4' -C-亚甲基桥连的核酸（2'，4' -BNA))。例如，在LNA中，由于2' -位置处的氧 和4'-位置处的碳由亚甲基桥连，所以构象固定成N型，并且不存在构象之间的波动。因此， 与采用常规天然核酸合成的寡核苷酸相比，通过掺入几个LNA单元所合成的寡核苷酸具有 针对RNA的非常高的亲和力和非常高的序列特异性，并且还显示出优异的耐热性和核酸酶 抗性（见PTL1)。由于其他人工核酸也具有这类特征，更多注意力投向与利用反义方法等有 关的人工核酸（见PTL1至7)。
[0007] 另外，将寡核苷酸应用至药物时，重要的是相关寡核苷酸可以以高特异性和高效 率递送至靶部位。此外，作为用于递送寡核苷酸的方法，已经开发了一种利用脂质如胆固醇 和维生素 E的方法（NPL1和2)、一种利用受体特异性肽如RVG-9R的方法（NPL3)和一种利 用对靶部位特异的抗体的方法（NPL4)。
[0008] 引文目录
[0009] [专利文献]
[0010] [PTL1]JP10-304889A
[0011] [PTL2]W02005/021570
[0012] [PTL3]JP10-195098A
[0013] [PTL4]JP2002-521310ff
[0014] [PTL5]W02007/143315
[0015] [PTL6]W02008/043753
[0016] [PTL7]W02008/029619
[0017] [非专利文献]
[0018] [NPLl]Kazutaka Nishina 等人，Molecular Therapy,第 16 卷，734-740 (2008)
[0019] [NPL2] Jurgen Soutscheck 等人，Nature,第 432 卷，173-178 (2004)
[0020] [NPL3]Kazutaka Nishina 等人，Molecular Therapy,第 l6 卷，734_74〇 (2〇〇8)
[0021] [NPL4]Dan Peer 等人，Science,第 319 卷，627-630(2008)
[0022] 发明概述
[0023] 技术问题
[0024] 在某些实施方案中，双链核酸复合物包含抑制靶基因表达或更广义地抑制RNA转 录产物水平的反义核酸。本发明的又一个目的是双链核酸复合物以高特异性和高效率递送 反义核酸链至靶部位。
[0025] 解决问题的方案
[0026] 出于研究怎样增强AS0稳定性、抑制靶基因体内表达的活性（反义作用）和在反 义方法中递送AS0至靶部位的特异性和效率（递送特性）的目的，发明人制备了与脂质（胆 固醇）直接结合的包含LNA和DNA(LNA/DNA缺口聚体）的AS0,并且通过静脉内施用这种 AS0至小鼠，发明人评价了递送特性和反义作用。作为结果，发现当胆固醇与AS0结合时， AS0至肝脏的递送特性增强，然而，反义作用丧失。
[0027] 因而，发明人进行了彻底研究，目的是开发在增加 AS0递送特性的同时，具有高反 义作用的核酸，并且作为结果，发明人在一个实施方案中构思了通过使LNA/DNA缺口聚体 (gapmer)与RNA链复性所产生的新双链核酸复合物，其中所述RNA链与缺口聚体互补，并且 首次评价反义作用。作为结果，发现双链核酸的反义作用总体上好于单链LNA/DNA缺口聚 体，并且取决于所用AS0的链长度，大大增强。发明人还产生了其中生育酚与包含RNA的互 补链结合的双链核酸，将该双链核酸静脉内施用至小鼠，并评价其反义作用。作为结果，发 现含有与生育酚结合的互补链的双链核酸具有非常高的反义作用。此外，发明人还发现通 过与包含PNA(肽核酸）而非RNA的互补链复性产生的LNA/DNA缺口聚体的反义作用至少 相似于或好于单链LNA/DNA缺口聚体，并且另外，PNA提供了使AS0与能指导递送AS0至特 定位点的肽、蛋白质或抗体间接结合的方式。
[0028] S卩，本申请涉及具有借助反义作用抑制靶基因表达的活性的双链核酸。
[0029] 在某些实施方案中，提供了以下内容。
[0030] (1)具有借助反义作用抑制靶基因表达的活性的双链核酸，该双链核酸包含以下 项（a)和b)的核酸 ：
[0031] (a)反义核酸，其与靶基因的转录产物互补并且含有包含4个或更多个连续碱基 的DNA的区域，和
[0032] (b)与（a)的核酸互补的核酸。
[0033] (2)项⑴中所述的双链核酸，其中（a)的核酸还含有包含修饰核酸的区域，所述 区域在包含4个或更多个连续碱基的DNA的区域的5'末端侧和3'末端侧的至少任一者上 布置。
[0034] (3)项⑵中所述的双链核酸，其中（a)的核酸的包含修饰核酸的区域是这样的包 含修饰核酸的区域，所述修饰核酸在包含4个或更多个连续碱基的DNA的区域的5'末端侧 和3'末端侧上布置，并且修饰核酸是LNA。
[0035] (4)在项⑴至⑶的任一项中所述的双链核酸，其中（b)的核酸是RNA或PNA。
[0036] (5)在项⑴至⑶的任一项中所述的双链核酸，其中（b)的核酸是RNA，与（a) 的核酸的包含修饰核酸的区域互补的区域被修饰，并且该修饰具有抑制由核糖核酸酶（RNA 酶）所致分解的作用。
[0037] (6)在项（5)中所述的双链核酸，其中修饰是2' -0-甲基化和/或硫代磷酸酯化。
[0038] (7)在项⑴至（6)的任一项中所述的双链核酸，其中功能性部分与（b)的核酸结 合。
[0039] (8)在项⑴至（7)的任一项中所述的双链核酸，其中（a)和（b)的核酸的链长度 是相同的。
[0040] (9)在项⑴至（7)的任一项中所述的双链核酸，其中（a)和（b)的核酸的链长度 是不同的。
[0041] (10)在项（9)中所述的双链核酸，还包括以下项（C)的核酸：
[0042] (c)与（a)和（b)的核酸之间具有较长链长度的核酸中相对于另一个核酸突出的 区域互补的核酸。
[0043] (11)在项（10)中所述的双链核酸，其中（c)的核酸是PNA。
[0044] (12)在项（10)或（11)中所述的双链核酸，其中功能性部分与（c)的核酸结合。
[0045] (13)在项（7)或（12)中所述的双链核酸，其中功能性部分是具有递送双链核酸至 革巴部位的活性的分子。
[0046] (14)借助反义作用抑制靶基因表达的组合物，所述组合物含有在项（1)至（13)的 任一项中所述的双链核酸作为有效成分。
[0047] (15) -种减少细胞中转录产物水平的方法，包括使组合物与细胞接触，所述组合 物包含：
[0048] (a)双链核酸复合物，所述双链核酸复合物包含与第二核酸链复性的第一核酸链， 其中：
[0049] 第一核酸链（i)包含核苷酸和任选地核苷酸类似物，并且第一核酸链中核苷酸和 任选地核苷酸类似物的总数是8至100,（ii)包含当第一核酸链与转录产物杂交时由RNA 酶Η识别的至少4个连续核苷酸，并且（iii)第一核酸链与转录产物杂交；和
[0050] 第二核酸链包含核苷酸和任选地核苷酸类似物。
[0051] (16) -种减少哺乳动物中基因表达水平的方法，包括向所述哺乳动物施用有效量 的药物组合物的步骤，所述组合物包含：
[0052] (a)双链核酸复合物，所述双链核酸复合物包含与第二核酸链复性的第一核酸链， 其中：
[0053] 第一核酸链（i)包含核苷酸和任选地核苷酸类似物，并且第一核酸链中核苷酸和 任选地核苷酸类似物的总数是8至100,（ii)包含当第一核酸链与所述基因的转录产物杂 交时由RNA酶Η识别的至少4个连续核苷酸，并且（iii)第一核酸链与转录产物杂交；和
[0054] 第二核酸链包含核苷酸和任选地核苷酸类似物；和（b)可药用载体。
[0055] (17)纯化的或分离的双链核酸复合物，包含与第二核酸链复性的第一核酸链，其 中：
[0056] 第一核酸链（i)包含核苷酸和任选地核苷酸类似物，并且第一核酸链中核苷酸和 核苷酸类似物的总数是8至100,（ii)包含当第一核酸链与转录产物杂交时由RNA酶Η识 别的至少4个连续核苷酸，（iii)包含至少一个非天然核苷酸，并且（iii)第一核酸链与转 录产物杂交；并且
[0057] 第二核酸链包含核苷酸和任选地核苷酸类似物。
[0058] (18)用于治疗哺乳动物的药物组合物，包含项（17)的双链核酸复合物和可药用 载体，其中转录产物是哺乳动物转录产物。
[0059] 在本发明的其他实施方案中，提供以下项。
[0060] 〈1>纯化的或分离的双链核酸复合物，包含与第二核酸链复性的第一核酸链，其 中：
[0061] 第一核酸链包含DNA核苷酸和任选地核苷酸类似物，其中包含一个或多个抗核酸 酶的核苷酸的5'翼区位于5'末端处和/或包含一个或多个抗核酸酶的核苷酸的3'翼区 位于3'末端处，第一核酸链包含至少4个连续DNA核苷酸，并且第一核酸链中DNA核苷酸 和核苷酸类似物的总数是10至100个核苷酸；
[0062] 第一核酸链还包含与转录产物的序列的一部分互补的至少10个连续核苷酸的序 列；并且
[0063] 第二核酸链包含：
[0064] (i) RNA核苷酸和任选地核苷酸类似物，以及任选地DNA核苷酸；或
[0065] (ii)DNA核苷酸和/或核苷酸类似物；或
[0066] (iii)PNA 核苷酸。
[0067] 其中包含一个或多个抗核酸酶的核苷酸的5'翼区位于5'末端处和/或包含一个 或多个抗核酸酶的核苷酸的3'翼区位于3'末端处，并且其中第二核酸链中RNA核苷酸、 DNA核苷酸、核苷酸类似物和PNA核苷酸的总数是10至100个核苷酸。
[0068] 〈2>项〈1>的双链核酸复合物，其中转录产物是编码蛋白质的转录产物。
[0069] 〈3>项〈1>的双链核酸复合物，其中转录产物是不编码蛋白质的转录产物。
[0070] 〈4>项〈1>-〈3>中任一项的双链核酸复合物，其中第一核酸链和第二核酸链中的 核苷酸的数目是相同的。
[0071] 〈5>项〈1>-〈3>中任一项的双链核酸复合物，其中第一核酸链和第二核酸链中的 核苷酸的数目是不同的。
[0072] 〈6>项〈5>的双链核酸复合物，其中第二核酸链中核苷酸的数目大于第一核酸链 中核苷酸的数目。
[0073] 〈7>项〈1>-〈6>中任一项的双链核酸复合物，其中第一核酸链包含范围从10至35 个核苷酸的核苷酸总数。
[0074] 〈8>项〈1>-〈7>中任一项的双链核酸复合物，其中第一核酸链的核苷酸均是抗核 酸酶的核苷酸。
[0075] 〈9>项〈1>-〈8>中任一项的双链核酸复合物，其中第一核酸链的5'翼区包含一个 或多个核苷酸类似物和/或第一核酸链的3'翼区包含位于3'末端处的一个或多个核苷酸 类似物。
[0076] 〈10>项〈1>-〈9>中任一项的双链核酸复合物，其中第一链包含在5'末端的至少2 个连续核苷酸类似物的5'翼区和在3'末端的至少2个连续核苷酸类似物的3'翼区。
[0077] 〈11>项〈10>的双链核酸复合物，其中5'翼区和3'翼区独立地由2至10个核苷 酸类似物组成。
[0078] 〈12>项11的双链核酸复合物，其中5'翼区和3'翼区独立地由2-3个核苷酸类似 物组成。
[0079] 〈13>项〈1>-〈12>中任一项的双链核酸复合物，其中第一核酸链包含至少一个核 苷酸类似物，所述核苷酸类似物是桥连核苷酸。
[0080] 〈14>项〈1>-〈13>中任一项的双链核酸复合物，其中第一核酸链中所含有的核苷 酸类似物是桥连核苷酸。
[0081] 〈15>项〈14>的双链核酸复合物，其中第一核酸链的桥连核苷酸独立地选自LNA、 cEt-BNA、酰胺 BNA(AmNA)和 cMOE-BNA。
[0082] 〈16>项〈14>的双链核酸复合物，其中第二核酸链的桥连核苷酸选自其中2' -位置 处的碳原子和 4' -位置处的碳原子由 4' _(CH2)p-0-2'、4' _(CH2)p-S-2'、4' _(CH2)p-0C0-2'、 4' - (CH2) n-N (R3)-0-(CH2) m-2'桥连的核糖核苷酸，其中p、m和η分别代表1至4的整数、?至 2的整数和1至3的整数，并且R 3代表氢原子、烷基、烯基、环烷基、芳基、芳烷基、酰基、磺酰 基、荧光标记物或化学发光标记物、具有核酸切割活性的官能团或胞内或核内定位信号肽。
[0083] 〈17>项〈1>-〈16>中任一项的双链核酸复合物，其中第一核酸链中的DNA核苷酸是 硫代磷酸酯化的。
[0084] 〈18>项〈1>-〈17>中任一项的双链核酸复合物，其中第一核酸链中所含有的核苷 酸类似物是硫代磷酸酯化的。
[0085] 〈19>项〈1>-〈18>中任一项的双链核酸复合物，其中第一核酸链包含4-20个连续 DNA核苷酸的区段。
[0086] 〈20>项〈1>-〈19>中任一项的双链核酸复合物，其中第一链包含（i)在5'末端的 至少2个连续核苷酸类似物的5'翼区，（ii)在3'末端的至少2个连续核苷酸类似物的3' 翼区，和（iii)至少4个连续DNA核苷酸。
[0087] 〈21>项〈1>-〈19>中任一项的双链核酸复合物，其中第一链包含（i)在5'末端的 至少2个连续核苷酸类似物的5'翼区，（ii)在3'末端的至少2个连续核苷酸类似物的3' 翼区，其中5'翼区和3'翼区中的所述核苷酸类似物是桥连核苷酸；和（iii)至少4个连续 DNA核苷酸；其中所述桥连核苷酸和所述DNA核苷酸是硫代磷酸酯化的。
[0088] 〈22>项〈1>-〈21>任一项的双链核酸，其中第一核酸链具有12-25个核苷酸长度。
[0089] 〈23>项〈1>-〈22>中任一项的双链核酸复合物，其中第二核酸链包含RNA核苷酸和 /或核苷酸类似物，和任选地DNA核苷酸。
[0090] 〈24>项〈23>的双链核酸复合物，其中第二核酸链的5'翼区包含至少一个核苷酸 类似物，第二核酸链的3'翼区包含至少一个核苷酸类似物，并且第二核酸链包含至少4个 连续RNA核苷酸。
[0091] 〈25>项〈23>的双链核酸复合物，其中第二核酸链的5'翼区包含至少一个硫代磷 酸酯化核苷酸，第二核酸链的3'翼区包含至少一个硫代磷酸酯化核苷酸，并且第二核酸链 包含至少4个连续RNA核苷酸。
[0092] 〈26>项〈24>或〈25>的双链核酸复合物，其中第二核酸链的5'翼区和3'翼区的 全部核苷酸均是硫代磷酸酯化的。
[0093] 〈27>项〈24>-〈26>任一项的双链核酸复合物，其中第二核酸链的抗核酸酶的核苷 酸独立地选自桥连核苷酸和2' -0-甲基RNA。
[0094] 〈28>项〈27>的双链核酸复合物，其中第二核酸链的桥连核苷酸独立地选自LNA、 cEt-BNA、酰胺 BNA(AmNA)和 cMOE-BNA。
[0095] 〈29>项〈27>的双链核酸复合物，其中第二核酸链的桥连核苷酸选自其中2' -位置 处的碳原子和 4' -位置处的碳原子由 4' _(CH2)p-0-2'、4' _(CH2)p-S-2'、4' _(CH2)p-0C0-2'、 4' - (CH2) n-N (R3)-0-(CH2) m-2'桥连的核糖核苷酸，其中p、m和η分别代表1至4的整数、?至 2的整数和1至3的整数，并且R 3代表氢原子、烷基、烯基、环烷基、芳基、芳烷基、酰基、磺酰 基、荧光标记物或化学发光标记物、具有核酸切割活性的官能团或胞内或核内定位信号肽。
[0096] 〈30>项〈24>的双链核酸复合物，其中第二核酸链包含括（i)在5'末端的至少2 个硫代磷酸酯化、2' -0-甲基化的RNA核苷酸，（ii)在3'末端的至少2个硫代磷酸酯化、 2' -0-甲基化的RNA核苷酸，和（iii)分别任选地硫代磷酸酯化的至少4个连续天然RNA核 苷酸。
[0097] 〈31>项〈24>的双链核酸复合物，其中第二核酸链包含括（i)在5'末端的至少2 个硫代磷酸酯化、桥连的RNA核苷酸，（ii)在3'末端的至少2个硫代磷酸酯化、桥连的RNA 核苷酸，和（iii)分别任选地硫代磷酸酯化的至少4个连续天然RNA核苷酸。
[0098] 〈32>项〈1>-〈22>任一项的双链核酸复合物，其中第二核酸链包含PNA核苷酸。
[0099] 〈33>项〈23>-〈32>任一项的双链核酸复合物，其中第二核酸链还包含具有功能的 功能性部分，所述功能选自标记功能、纯化功能和祀向递送功能。
[0100] 〈34>根据项〈1>至〈3>和〈5>至〈33>中任一项的双链核酸复合物，其中双链核酸 复合物还包含与第二核酸链复性的第三核酸链。
[0101] 〈35>根据项〈34>的双链核酸，其中第三核酸链包含DNA核苷酸和任选地核苷酸类 似物，并且包含至少4个连续DNA核苷酸，其中核苷酸的总数是10至100个核苷酸，所述第 三核酸链还包括与转录产物的序列的一部分互补的至少10个连续核苷酸的序列。
[0102] 〈36>根据项〈35>的双链核酸复合物，其中第三链包含（i)在5'末端的至少2个 连续核苷酸类似物的5'翼区，（ii)在3'末端的至少2个连续核苷酸类似物的3'翼区，其 中5'翼区和3'翼区中的所述核苷酸类似物是桥连核苷酸；和（iii)至少4个连续DNA核 苷酸；其中所述桥连核苷酸和所述DNA核苷酸是硫代磷酸酯化的。
[0103] 〈37>根据项〈34>的双链核酸，其中第三核酸链包含PNA核苷酸。
[0104] 〈38>项〈34>-〈37>任一项的双链核酸复合物，其中第三核酸链还包含具有功能的 功能性部分，所述功能选自标记功能、纯化功能和祀向递送功能。
[0105] 〈39>根据项33或38的双链核酸复合物，其中所述功能性部分是选自脂质、肽和蛋 白质的分子。
[0106] 〈40>根据项〈39>的双链核酸复合物，其中功能性部分与3'末端核苷酸或5'末端 核苷酸连接。
[0107] 〈41>根据项〈39>或〈40>的双链核酸复合物，其中功能性部分是脂质。
[0108] 〈42>根据项〈41>的双链核酸复合物，其中功能性部分是选自胆固醇、脂肪酸、月旨 溶性维生素、糖脂和甘油酯的脂质。
[0109] 〈43>根据项〈41>的双链核酸复合物，其中功能性部分是选自胆固醇、生育酚和生 育三烯酚的脂质。
[0110] 〈44>根据项〈39>或〈40>的双链核酸复合物，其中功能分子是选自受体配体和抗 体的肽或蛋白质。
[0111] 〈45>药物组合物，包含可药用载体和项〈1>至〈44>任一项的双链核酸复合物。
[0112] 〈46>项〈1>至〈44>任一项的双链核酸复合物的用途，用于制备减少哺乳动物中基 因表达的药物。
[0113] 〈47>项〈1>至〈44>任一项的双链核酸复合物的用途，用于减少哺乳动物中基因的 表达。
[0114] 〈48> -种减少哺乳动物中基因表达的方法，包括向所述哺乳动物施用有效量的药 物组合物的步骤，所述组合物包含：
[0115] 纯化或分离的双链核酸复合物，包含与第二核酸链复性的第一核酸链，其中：
[0116] 第一核酸链包含DNA核苷酸和任选地核苷酸类似物，和包括至少4个连续DNA核 苷酸，其中第一核酸链中DNA核苷酸和核苷酸类似物的总数是10至100个核苷酸；
[0117] 第一核酸链还包含与哺乳动物转录产物的序列的一部分互补的至少10个连续核 苷酸的序列；并且
[0118] 第二核酸链包含：
[0119] (i)RNA核苷酸和任选地核苷酸类似物，以及任选地DNA核苷酸；或
[0120] (ii)DNA核苷酸和/或核苷酸类似物；或
[0121] (iii)PNA 核苷酸。
[0122] 其中第二核酸链中RNA核苷酸、DNA核苷酸、核苷酸类似物和PNA核苷酸的总数是 10至100个核苷酸；和
[0123] 可药用载体。
[0124] 〈49>项〈48>的方法，其中施用途径是肠内途径。
[0125] 〈50>项〈48>的方法，其中施用途径是肠胃外途径。
[0126] 〈51>项〈48>-〈50>任一项的方法，其中剂量是0.001mg/kg/日至50mg/kg/日的双 链核酸复合物。
[0127] 〈52>项〈48>-〈51>任一项的方法，其中哺乳动物是人。
[0128] 本发明的有益效果
[0129] 根据某些实施方案，反义核酸可以在双链复合物中递送并且可以通过反义核酸选 择性地和非常有效地抑制靶基因的表达或转录产物的水平。在一些实施方案中，双链复合 物可以通过缔合递送部分与该复合物而以高特异性和高效率递送至靶部位。
[0130] 附图简述
[0131] 图1是说明某些反义方法的一般机制的简图。如本图中所示，将与靶基因的mRNA 的部分序列互补的寡核苷酸（反义寡核苷酸（AS0))(该图中的"DNA"）引入细胞时，选择性 地抑制由靶基因编码的蛋白质的表达。在划虚线的框中，显示其中RNA酶Η在mRNA与AS0 杂交的位置处切割该mRNA的降解机制。作为RNA酶Η切割的结果，该mRNA通常不翻译，从 而不产生功能性基因表达产物。
[0132] 图2是说明RNA、DNA和LNA核苷酸的结构的示意图。
[0133] 图3A-B是说明双链核酸复合物的合适实施方案的例子的示意图。 5'-LNA-DNA-LNA-3'链是与靶向的转录产物互补的反义核酸。在本图中，"（s)"表示具有硫 代磷酸酯键的核酸；"（〇) "表示具有天然硫代磷酸酯键的核酸；并且" (m/s) "表示已经硫 代磷酸酯化和2' -0-甲基化的RNA。另外，"X"表示功能性部分，并且可以独立地代表脂质 (例如，胆固醇或生育酚）、糖等或蛋白质、肽（例如，抗体）等。
[0134] 图4A-B是说明双链核酸复合物的合适实施方案的例子的示意图，所述双链核酸 复合物含有三条链：具有不同链长度的第一 AS0核酸链和第二互补性核酸链以及包含与功 能分子如肽、抗体等结合的PNA的第三核酸链。本图中的符号具有与图3中定义的那些符 号相同的意思。
[0135] 图5A-B是说明双链核酸复合物的合适实施方案的例子的示意图，所述双链核酸 复合物具备至少具有不同链长度的第一 AS0核酸链和第二互补性核酸链。在这些实施方 案中，（A)核酸还包含与第二核酸链互补的第三核酸链或（B)第二核酸链还包含通过发夹 接头与第二核酸链连接的硫代磷酸酯化DNA的自身互补区。另外，在本图中，"(m)"表示 2' -0-甲基化RNA。其他符号具有与图3中定义的那些符号相同的意思。
[0136] 图6A是说明具有结构5' -LNA-DNA-LNA-3'的核酸的示意图，所述核酸在5'末端 用荧光染料Cy3标记。图6B是说明具有结构5' -LNA-DNA-LNA-3'的核酸的示意图，所述核 酸在5'末端用荧光染料Cy3标记并且在3'末端用胆固醇（"Choi"）标记。
[0137] "（s) "表示硫代磷酸酯化核酸。
[0138] 图7是荧光显微照片，其说明观察已经施用荧光（Cy3)标记的"LNA"（根据图6A) 或荧光（Cy3)标记chol-LNA"（根据图6B)的小鼠的肝脏结果。
[0139] 图8是说明通过以下方式获得的结果的图：向小鼠施用"12聚 Cy3-Chol-LNA(ApoBl)"（根据图 6B)、"20 聚 Cy3-Chol-LNA(ApoBl)" 或"29 聚 Cy3-Chol-LNA(ApoBl) "或"12 聚 Cy3-LNA(ApoBl) "（根据图 6A)，它们均具有与 ApoBl 基因 的碱基序列互补的序列，并且通过定量PCR分析这些小鼠的肝脏中ApoBl基因的表达量。
[0140] 图9是说明双链核酸的某些实施方案的示意图。符号具有与图3-6中定义的那些 符号相同的意思。
[0141] 图10是说明用来评价根据一个实施方案的双链核酸复合物的反义作用的反义链 (AS0)和其互补链（cRNA(o)、cRNA(G)和cRNA(m/s)的示意图。符号具有与图3-6和图9中 定义的那些符号相同的意思。
[0142] 图11显示说明结果的照片，所述结果通过采用电泳法分析存在或不存在图10中 所示的反义链和其互补链的复性来获得。小图A表示在UV照射下拍照的结果，并且小图B 显示凝胶的照片。
[0143] 图12是在UV照射下拍摄的照片，所述照片说明通过使图10中所示的反义链及其 互补链复性、用RNA酶Η处理所述链并通过电泳法分析反应产物所获得的结果。
[0144] 图13是说明结果的图，所述结果通过将图10中所示的反义链或由该反义链和图 10中所示的互补链之一组成的双链核酸复合物（以〇. 4ηΜ或ΙΟηΜ的浓度）引入细胞中获 得。通过定量PCR分析细胞中其转录产物由反义链靶向的ApoBl基因的表达量。
[0145] 图14是说明结果的图，所述结果通过分析其中引入图10中所示的反义链或由该 反义链和图10中所示的互补链之一组成的双链核酸复合物的细胞中ApoBl基因的表达量 获得，所述表达量针对仅引入该反义链的细胞中获得的表达量归一化。
[0146] 图15是说明用来评价双链核酸复合物的反义作用的反义链、互补链（cRNA(G))和 具有生育酚功能性部分的互补链（Toc-cRNA(G))的示意图。"Toe"表示生育酚。其他符号 具有与图3-6、图9和图10中定义的那些符号相同的意思。
[0147] 图16是说明结果的图，所述结果通过以下方式获得：向小鼠施用图15中所示的反 义链或由反义链和图15中所示的互补链之一组成的双链核酸并且分析小鼠中其转录产物 由反义链靶向的ApoBl基因的表达量。
[0148] 图17是说明结果的图，所述结果通过评价双链核酸复合物的反义作用的特异性 获得，所述双链核酸复合物由如图15中所示的反义链和具有与之结合的生育酚的互补链 组成。
[0149] 图18是说明结果的图，所述结果通过评价双链核酸复合物的反义作用的剂量依 存关系获得，所述双链核酸复合物由如图15中所示的反义链和具有与之结合的生育酚的 互补链组成。
[0150] 图19A是说明结果的图，所述结果通过评价双链核酸复合物的反义作用的可持续 性获得，所述双链核酸复合物由如图15中所示的反义链和具有与之结合的生育酚的互补 链组成。在本图中，"d"表示在施用相关双链核酸后过去的天数。
[0151] 图19B是说明结果的图，所述结果通过评价双链核酸复合物的反义作用的可持续 性获得，所述双链核酸复合物由如图15中所示的反义链和具有与之结合的生育酚的互补 链组成。在本图中，"d"表示在施用相关双链核酸后过去的天数。
[0152] 图20A是说明根据某些实施方案的反义寡核苷酸和互补链的示意图。
[0153] 图20B是比较下述结果的图，所述结果通过评价根据本发明的一个实施方案的 双链核酸复合物（LNA/cRNA(G)-〇M)的反义作用获得，所述双链核酸复合物具有包含全部 2' -0-甲基化的RNA的互补链。
[0154] 图21是说明可以用来掺入肽、蛋白质等作为功能性部分的双链核酸的合适实施 方案的示意图。本图中的符号具有与图3和图4中定义的那些符号相同的意思。
[0155] 图22是说明结果的图，所述结果通过评价由以下三条链组成的双链核酸复合物 的反义作用获得：反义链、包含RNA的互补链和与肽等结合的PNA链。
[0156] 图23是说明结果的图，所述结果通过评价由反义链和包含PNA的互补链组成的双 链核酸复合物的反义作用获得。
[0157] 图24是说明根据某些实施方案的反义寡核苷酸和互补链的示意图。
[0158] 图25A是说明结果的图，所述结果对采用图24中所示链制备的双链核酸复合物获 得。
[0159] 图25B是说明结果的图，所述结果对采用图24中所示链制备的双链核酸复合物获 得。
[0160] 图26是说明结果的图，所述结果在使用双链核酸复合物抑制表达的实施例11中 获得。
[0161] 图27A是说明结果的图，所述结果在评价用不同长度的双链核酸复合物抑制hTTR 表达的实施例12中获得。
[0162] 图27B是说明结果的图，所述结果在评价用不同长度的双链核酸复合物抑制hTTR 表达的实施例12中获得。
[0163] 图28是说明结果的图，所述结果在评价处理之前和之后由双链核酸复合物靶向 的蛋白质的血清蛋白水平的实施例12中获得。
[0164] 图29是显示在实施例13中获得的结果的荧光图像，显示了由三条链组成的双链 核酸复合物的定位。
[0165] 图30是说明实施例13的结果的图，显示了由三条链组成的双链核酸复合物所致 的表达抑制。
[0166] 图31是说明实施例14的结果的图，显示了抑制miRNA的水平。
[0167] 图32是说明结果的图，所述结果在展示使用双链核酸复合物抑制表达的实施例 15中获得，所述双链核酸复合物含有包含酰胺BNA(AmNA)核苷酸类似物的AS0。
[0168] 实施方案的描述
[0169] 包含反义核酸和与该反义核酸互补的核酸的双链核酸复合物。
[0170] 某些实施方案包括包含与第二核酸复性的第一核酸的纯化或分离的双链核酸复 合物，所述双链核酸复合物具有借助反义作用抑制靶基因表达或更普遍地抑制转录产物水 平的活性。
[0171] 第一核酸链（i)包含核苷酸和任选地核苷酸类似物，并且第一核酸链中核苷酸和 核苷酸类似物的总数是8至100,（ii)包含当第一核酸链与转录产物杂交时由RNA酶Η识 别的至少4个连续核苷酸，（iii)包含至少一个非天然核苷酸，并且（iii)第一核酸链与转 录产物杂交；并且
[0172] 第二核酸链包含核苷酸和任选地核苷酸类似物，和
[0173] 第二核酸链可以与第一核酸链复性，
[0174] 第二核酸链包含：
[0175] (i)RNA核苷酸和任选地核苷酸类似物，以及任选地DNA核苷酸；或
[0176] (ii)DNA核苷酸和/或核苷酸类似物；或
[0177] (iii)PNA 核苷酸。
[0178] "反义作用"意指抑制靶基因的表达或靶向的转录产物的水平，这因靶向的转录产 物（RNA有义链）与例如与转录产物等的部分序列互补的DNA链或更一般地设计成引起该 反义作用的链杂交而发生，其中在某些情况下，抑制翻译或剪接功能调节作用如外显子跳 跃（见对图1中点线包围的区域之外上半部分中的描述）可以因转录产物被杂交产物覆盖 引起，和/或转录产物的分解可以因杂交部分的识别而发生（见图1中点线包围的区域内 部描述）。
[0179] 不特别地限制其表达被反义作用抑制的"靶基因"或"靶向的转录产物"，并且其例 子包括其表达在多种疾病中增加的基因。另外，"靶基因的转录产物"是从编码靶基因的基 因组DNA转录的mRNA，并且还包括未经历碱基修饰的mRNA、尚未剪接的mRNA前体等。更一 般地，"转录产物"可以是由DNA依赖性RNA聚合酶合成的任何RNA。
[0180] 如本文所用的术语"纯化或分离的双链核酸复合物"意指这样的核酸复合物，它包 含自然界中不存在的至少一个核酸链或包含基本上不含天然存在的核酸物质的至少一个 核酸链。
[0181] 如本文所用的术语"互补"意指其中所谓Watson-Crick碱基对（天然型碱基对） 或非Watson-Crick碱基对（Hoogsteen碱基对等）可以借助氢键形成的关系。祀向的转录 产物（例如靶基因的转录产物）的碱基序列和第一核酸链的碱基序列不必需是完美互补 的，并且如果碱基序列具有至少70 %或更高的、优选地80 %或更高和更优选地90 %或更高 (例如，95%、96%、97%、98%或99%或更高的）的互补性，则这是可接受的。可以通过使 用BLAST程序等确定序列的互补性。当序列互补时，第一链可以"与第二链复性"。本领域 技术人员可以轻易地确定两个链可以复性的条件（温度、盐浓度等）。另外，本领域普通技 术人员可以基于例如靶基因的碱基序列信息，容易地设计与靶向的转录产物互补的反义核 酸。
[0182] 根据某些实施方案，第一核酸链是与转录产物（如靶基因的转录产物）互补的反 义核酸，并且是含有下述区域的核酸，所述区域包含当第一核酸链与转录产物杂交时由RNA 酶Η识别的至少4个连续核苷酸。
[0183] 如本文所用，术语"核酸"可以指单体核苷酸或核苷，或可以意指由多个单体组成 的寡核苷酸。术语"核酸链"在本文中还用来指寡核苷酸。核酸链可以通过化学合成方法 (包括使用自动化合成仪）或通过酶促过程（包括但不限于聚合酶、连接酶或限制性反应） 完全或部分地制备。
[0184] 不特别地限制第一核酸链的链长度，但是链长度通常是至少8个碱基、至少10个 碱基、至少12个碱基或至少13个碱基。链长度可以是直至20个碱基、25个碱基或35个碱 基。链长度可以甚至长约100个碱基。长度的范围可以是10至35个碱基、12至25个碱基 或13至20个碱基。在某些情况下，长度的选择通常取决于反义作用的强度与针对靶的核 酸链的特异性的平衡，连同其他因素如成本、合成产率等。
[0185] "由RNA酶Η识别的至少4个连续核苷酸"通常是包含4至20个连续碱基的区域、 包含5至16个连续碱基的区域或包含6至12个连续碱基的区域。另外，可以在这个区域 中使用的核苷酸是如天然DNA那样当与RNA核苷酸杂交时由RNA酶Η识别的那些核苷酸， 其中RNA酶Η切割RNA链。合适的核苷酸，如修饰的DNA核苷酸和其他碱基是本领域已知 的。已知含有2'-羟基的核苷酸如RNA核苷酸不是合适的。本领域技术人员可以轻易地确 定用于"至少4个连续核苷酸"的这个区域中的核苷酸的适宜性。
[0186] 在某些实施方案中，第一核酸链包含"核苷酸和任选地核苷酸类似物"。这个术语 意指第一链包含DNA核苷酸、RNA核苷酸，并且任选地还可以在链中包含核苷酸类似物。
[0187] 如本文所用，"DNA核苷酸"意指天然存在的DNA核苷酸，或具有修饰的碱基、糖或 磷酸酯键亚单位的DNA核苷酸。类似地，"RNA核苷酸"意指天然存在的RNA核苷酸，或具 有修饰的碱基、糖或磷酸酯键亚单位的RNA核苷酸。修饰的碱基、糖或磷酸酯键亚单位是 其中已经在亚单位中添加或取代单个取代基的那种，并且该亚单位总体上尚未替换为不同 的化学基团。从包含核苷酸的区域的部分或整体具有高脱氧核糖核酸酶抗性等的观点看， DNA可以是修饰的核苷酸。这类修饰的例子包括胞嘧啶的5-甲基化、5-氟化、5-溴化、5-碘 化和N4-甲基化；胸苷的5-去甲基化、5-氟化、5-溴化和5-碘化；腺嘌呤的N6-甲基化和 8_溴化；鸟嘌呤的N2-甲基化和8-溴化；硫代磷酸酯化、甲基膦酸化、甲基硫代膦酸化、手 性甲基膦酸化、二硫代磷酸酯化、磷酰胺化、2'-0-甲基化、2'-甲氧乙基（MOE)化、2'-氨丙 基（AP)化和2'-氟化。然而，从具有优异药物代谢动力学的观点看，硫代磷酸酯化是优选 的。可以如此实施这种修饰，从而相同的DNA可以经历组合的多种修饰。并且如下文讨论 的那样，可以修饰RNA核苷酸以实现相似的效果。
[0188] 在某些情况下，修饰的DNA的数目和修饰位置可以影响如本文中公开的双链核酸 提供的反义作用等。由于这些实施方案可以随靶基因等的序列变动，它可以根据情况变动， 但是本领域普通技术人员可以通过参考与反义方法相关的文献的描述，确定合适的实施方 案。另外，当测量由修饰后的双链核酸复合物拥有的反义作用时，如果如此获得的测量值并 未显著低于修饰后的双链核酸复合物的测量值（例如，如果修饰后获得的测量值比修饰前 该双链核酸复合物的测量值低30%或更多），可以是评价相关修饰。可以如下文实施例中 所示，通过以下方式实施反义作用的测量：将受测试的核酸化合物引入细胞等中，并且通过 适当使用已知技术如RNA印迹法、定量PCR和蛋白质印迹法测量其中表达被受测试的核酸 化合物提供的反义作用抑制的细胞中靶基因的表达量（mRNA的量、cDNA的量、蛋白质的量 等）。
[0189] 如本文所用，"核苷酸类似物"意指非天然存在的核苷酸，其中碱基、糖或磷酸酯 键亚单位在亚单位中具有多于一个添加或取代的取代基，或该亚单位整体上已经替换为不 同的化学基团。具有多于一个取代的类似物的例子是桥连核酸，其中桥连单元已经通过 两个取代添加在糖环上，一般与2'和4'碳原子连接。就根据某些实施方案的第一核酸 链而言，从增加针对靶基因转录产物的部分序列的亲和力和/或靶基因针对核酸酶的抗 性观点看，第一核酸链还包含核苷酸类似物。"核苷酸类似物"可以是其中针对靶基因转 录产物的部分序列的亲和力和/或核酸针对核酸酶的抗性由于修饰（桥连基团、取代基 等）而增强的任何核酸，并且其例子包括在JP10-304889A、W02005/021570、JP10-195098A、 JP2002-521310W、W02007/143315、W02008/043753、W02008/029619 和 W02008/049085 中被 公开为适用于反义方法中的核酸（下文中，这些文献将称作"与反义方法相关的文献"）。 艮P，其例子包括在上文描述的文献中公开的核酸：己糖醇核酸（HNA)、环己烷核酸（CeNA)、 肽核酸（PNA)、二醇核酸（GNA)、苏糖核酸（TNA)、吗啉代核酸、三环DNA(tcDNA)、2' -0-甲基 化核酸、2'-M0E(2'-0-甲氧乙基）化核酸、2'-AP(2'-0-氨丙基）化核酸、2'-氟化核酸、 2' -F-阿拉伯糖核酸（2' -F-ANA)和BNA (桥连核酸）。
[0190] 根据某些实施方案，BNA可以是其中2'碳原子和4'碳原子由两个或更多个原子桥 连的任何核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。桥连核酸的例子是本领域技术人员已知的。可以 将这类 BNA 的一个亚组描述为具有由 4' _(CH2)p-0-2'、4' _(CH2)p-S-2'、4' _(CH2)p-0C0-2'、 4' _(CH2)n-N(R3)-0-(CH2) m-2'桥连的2' -位置处碳原子和4' -位置处碳原子（这里，p、m和 η分别代表1至4的整数、0至2的整数和1至3的整数；并且R3代表氢原子、烷基、烯基、 环烷基、芳基、芳烷基、酰基、磺酰基、单元取代基（荧光标记分子或化学发光标记分子）、具 有核酸切割活性的官能团、胞内或核内定位信号肽等）。另外，就根据某些实施方案的BNA 而言，在3' -位置处碳原子上的0R2取代基和5' -位置处碳原子上的0?取代基中，&和R2 一般是氢原子，但是可以彼此相同或不同，并且也可以是用于核酸合成的羟基的保护基、烷 基、稀基、环烧基、芳基、芳烧基、醜基、横醜基、甲娃烧基、憐酸基、受:用于核酸合成的保护基 保护的磷酸基或-p (r4) r5 (这里，可以彼此相同或不同的r4和r5各自代表羟基、受用于核 酸合成的保护基保护的羟基、巯基、受用于核酸合成的保护基保护的巯基、氨基、具有1至5 个碳原子的烷氧基、具有1至5个碳原子的烷硫基、具有1至6个碳原子的氰基烷氧基或用 具有1至5个碳原子的烷基取代的氨基）。这种BNA的非限制性例子包括a -L-亚甲氧基 (4' -CH2-0-2'）ΒΝΑ或β -D-亚甲氧基（4' -CH2-0-2'）ΒΝΑ (又称作LNA (锁核酸（注册商标）、 2'，4' -BNA)、乙烯氧基（4, -CH2) 2-0-2'）BNA (又称作 ΕΝΑ)、β -D-硫代（4, -CH2-S-2'）BNA、 氛基氧（4, -CH2-0-N (R3) -2'）BNA、氧氛基（4, -CH2-N (R3) -0-2'）BNA (又称作 2'，4' -BNANC)、 2'，4' -BNAC0C、3' -氨基-2'，4' -BNA、5' -甲基 BNA、（4, -CH(CH3)-0-2'）BNA(又称作 cEt-BNA)、（4, -CH(CH20CH3)-0-2'）BNA(又称作 cMOE-BNA、酰胺 BNA(4' -C(0)-N(R)-2'） BNA(R = H、Me)(又称作AmNA)和本领域技术人员已知的其他BNA。
[0191] 另外，在核苷酸类似物中，根据某些实施方案，碱基部分可以被修饰。在碱基部 分处修饰的例子包括胞嘧啶的5-甲基化、5-氟化、5-溴化、5-碘化和N4-甲基化；胸苷的 5_去甲基化、5-氟化、5-溴化和5-碘化；腺嘌呤的N6-甲基化和8-溴化；鸟嘌呤的N2-甲 基化和8-溴化。另外，在修饰的核酸中，根据某些实施方案，磷酸二酯结合位点可以被修 饰。修饰磷酸二酯结合位点的例子包括硫代磷酸酯化、甲基膦酸化、甲基硫代膦酸化、手性 甲基膦酸化、二硫代磷酸酯化、和磷酰胺化。然而，从具有优异药物代谢动力学的观点看，可 以使用硫代磷酸酯化。另外，可以如此实施对碱基部分的这种修饰或对磷酸二酯结合位点 的修饰，从而相同核酸可以经受组合的多种修饰。
[0192] 通常，修饰的核苷酸和修饰的核苷酸类似物不限于本文中例举的那些。众多修饰 的核苷酸和修饰的核苷酸类似物是现有技术中已知的，例如在授予Tachas等人的美国专 利号8, 299, 039中、特别是在第17 - 22栏中公开的那些，并且可以用于本申请的实施方案 中。
[0193] 本领域普通技术人员可以适当地选择并且使用这类修饰的核酸当中的核苷酸类 似物，同时考虑反义作用、针对靶基因转录产物的部分序列的亲和力、核酸酶抗性等。然而， 在一些实施方案中，核苷酸类似物是下式（1)代表的LNA:[化学式1]
[0194]

【权利要求】
1. 减少细胞中转录产物水平的方法，包括使组合物与细胞接触，所述组合物包含双链 核酸复合物，所述双链核酸复合物包含与第二核酸链复性的第一核酸链，其中： 第一核酸链（i)包含核苷酸和任选地核苷酸类似物，并且第一核酸链中核苷酸和任选 地核苷酸类似物的总数是8至100,（ii)包含当第一核酸链与转录产物杂交时由RNA酶Η 识别的至少4个连续核苷酸，并且（iii)第一核酸链与转录产物杂交；和 第二核酸链包含核苷酸和任选地核苷酸类似物。
2. 根据权利要求1所述的方法，其中第二核酸链包含： (i) RNA核苷酸和任选地核苷酸类似物，以及任选地DNA核苷酸；或 (ii) DNA核苷酸和/或核苷酸类似物；或 (iii) PNA核苷酸。
3. 权利要求1或权利要求2所述的方法，其中转录产物是编码蛋白质的mRNA转录产 物。
4. 权利要求1或权利要求2所述的方法，其中转录产物是不编码蛋白质的转录产物。
5. 权利要求1-4中任一项所述的方法，其中第一核酸链中核苷酸和核苷酸类似物的总 数和第二核酸链中RNA核苷酸、DNA核苷酸、核苷酸类似物和PNA核苷酸的总数是相同的。
6. 权利要求1-4中任一项所述的方法，其中第一核酸链中核苷酸和核苷酸类似物的总 数和第二核酸链中RNA核苷酸、DNA核苷酸、核苷酸类似物和PNA核苷酸的总数是不同的。
7. 权利要求6所述的方法，其中第二核酸链中RNA核苷酸、DNA核苷酸、核苷酸类似物 和PNA核苷酸的总数大于第一核酸链中核苷酸和核苷酸类似物的总数。
8. 权利要求1-7中任一项所述的方法，其中第一核酸链包含范围为10至35个核苷酸 的核苷酸总数。
9. 权利要求1-8中任一项所述的方法，其中第一核酸链包含位于RNA酶Η识别的至少 4个连续核苷酸的5'和/或3'的一个或多个核苷酸类似物。
10. 权利要求1-9中任一项所述的方法，其中第一核酸链包含位于RNA酶Η识别的至少 4个连续核苷酸5'的一个或多个核苷酸类似物的5'翼区和/或位于RNA酶Η识别的至少 4个连续核苷酸3'的一个或多个核苷酸类似物的3'翼区。
11. 权利要求10所述的方法，其中第一核酸链包含5'翼区和3'翼区，并且其中5'翼 区包含至少2个核苷酸类似物和3'翼区包含至少2个核苷酸类似物。
12. 权利要求11所述的方法，其中5'翼区和3'翼区独立地包含2至10个核苷酸类似 物。
13. 权利要求12所述的方法，其中5'翼区和3'翼区独立地包含2至3个核苷酸类似 物。
14. 权利要求1-13中任一项所述的方法，其中第一核酸链包含至少一个核苷酸，所述 核苷酸包含2' -〇-CH3基团或2' -0_CH2CH20CH3(M0E)基团。
15. 权利要求1-14中任一项所述的方法，其中第一核酸链包含至少一个核苷酸类似 物，所述核苷酸类似物是桥连核苷酸。
16. 权利要求15所述的方法，其中第一核酸链包含独立地选自LNA、cEt-BNA、酰胺 BNA(AmNA)和cMOE-BNA的桥连核苷酸。
17. 权利要求15所述的方法，其中第一核酸链包含桥连核苷酸，所述桥连核苷酸独 立地选自其中2'-位置处的碳原子和4'-位置处的碳原子由4'-(CH2)p-0-2'、4'-(CH 2) p-S-2'、4' _(CH2)p-0C0-2'、4' _(CH2)n-N(R3)-0-(CH2) m-2' 桥连的核糖核苷酸，其中 p、m 和 η 分别代表1至4的整数、0至2的整数和1至3的整数，并且R3代表氢原子、烷基、烯基、环 烷基、芳基、芳烷基、酰基、磺酰基、荧光标记物或化学发光标记物、具有核酸切割活性的官 能团或胞内或核内定位信号肽。
18. 权利要求1-17中任一项所述的方法，其中第一核酸链中的至少一个核苷酸是硫代 磷酸酯化的。
19. 权利要求1-18中任一项所述的方法，其中第一核酸链中的至少一个核苷酸类似物 是硫代磷酸酯化的。
20. 权利要求1-19中任一项所述的方法，其中第一核酸链包括当第一核酸链与转录产 物杂交时由RNA酶Η识别的4-20个连续核苷酸。
21. 权利要求20所述的方法，其中当第一核酸链与转录产物杂交时由RNA酶Η识别的 4-20个连续核苷酸的至少一个核苷酸是DNA核苷酸。
22. 权利要求10-21中任一项所述的方法，其中第一核酸链包含5'翼区和3'翼区，并 且其中（i) 5'翼区的核苷酸类似物是桥连核苷酸；（ii) 3'翼区的核苷酸类似物是桥连核苷 酸；并且（iii)当第一核酸链与转录产物杂交时由RNA酶Η识别的连续核苷酸是DNA核苷 酸。
23. 权利要求1-22中任一项所述的方法，其中第一核酸链中核苷酸和核苷酸类似物的 总数是12至25个核苷酸。
24. 权利要求2-23中任一项所述的方法，其中第二核酸链包含RNA核苷酸并任选地包 含核苷酸类似物，以及任选地包含DNA核苷酸。
25. 权利要求24所述的方法，其中第二核酸链包含当第二核酸链与第一核酸链复性时 被RNA酶Η切割的至少4个连续核苷酸。
26. 权利要求25所述的方法，其中第二核酸链包含位于至少4个连续核苷酸的5'和/ 或3'的一个或多个硫代磷酸酯化核苷酸。
27. 权利要求25或26所述的方法，其中第二核酸链包含位于至少4个连续核苷酸的 5'和/或3'的一个或多个核苷酸类似物。
28. 权利要求26或27所述的方法，其中第二核酸链包含位于至少4个连续核苷酸5' 的一个或多个核苷酸类似物的5'翼区和/或位于至少4个连续核苷酸3'的一个或多个核 苷酸类似物的3'翼区。
29. 权利要求28所述的方法，其中第二核酸链包含5'翼区和3'翼区，并且其中5'翼 区包含至少2个核苷酸类似物，并且第一链的3'翼区包含至少2个核苷酸类似物。
30. 权利要求29所述的方法，其中5'翼区和3'翼区独立地包含2至10个核苷酸类似 物。
31. 权利要求30所述的方法，其中5'翼区和3'翼区独立地包含2-3个核苷酸类似物。
32. 权利要求24-31中任一项所述的方法，其中第二核酸链包含至少一个RNA核苷酸， 所述RNA核苷酸包含2' -〇-CH3基团或2' -0-CH2CH20CH3 (ΜΟΕ)基团。
33. 权利要求24-32中任一项所述的方法，其中第二核酸链包含至少一个核苷酸，所述 核苷酸是桥连核苷酸。
34. 权利要求33所述的方法，其中第二核酸链包含独立地选自LNA、cEt-BNA、酰胺 BNA(AmNA)和cMOE-BNA的桥连核苷酸。
35. 权利要求33所述的方法，其中第二核酸链包含桥连核苷酸，所述桥连核苷酸独 立地选自其中2'-位置处的碳原子和4'-位置处的碳原子由4'-(CH 2)p-0-2'、4'-(CH2) p-S-2'、4' _(CH2)p-0C0-2'、4' _(CH2)n-N(R3)-0-(CH2) m-2' 桥连的核糖核苷酸，其中 p、m 和 η 分别代表1至4的整数、0至2的整数和1至3的整数，并且R3代表氢原子、烷基、烯基、环 烷基、芳基、芳烷基、酰基、磺酰基、荧光标记物或化学发光标记物、具有核酸切割活性的官 能团或胞内或核内定位信号肽。
36. 权利要求28-35中任一项所述的方法，其中第二核酸链包含5'翼区和3'翼区，并 且其中（i)5'翼区的核苷酸类似物是桥连核苷酸；（ii)3'翼区的核苷酸类似物是桥连核苷 酸；并且（iii)当第二核酸链与第一核酸链复性时被RNA酶Η切割的连续核苷酸是RNA核 苷酸。
37. 权利要求36所述的方法，其中第二核酸链的至少一个RNA核苷酸和/或至少一个 核苷酸类似物是硫代磷酸酯化的。
38. 权利要求2-23中任一项所述的方法，其中第二核酸链包含ΡΝΑ核苷酸。
39. 权利要求24-38中任一项所述的方法，其中第二核酸链还包含具有功能的功能性 部分，所述功能选自标记功能、纯化功能和祀向递送功能。
40. 根据权利要求1至4和6至33中任一项所述的方法，其中双链核酸复合物还包含 与第二核酸链复性的第三核酸链。
41. 根据权利要求40所述的方法，其中第三核酸链与第一核酸链相同。
42. 根据权利要求40所述的方法，其中第三链（i)包含核苷酸和任选地核苷酸类似物， (ii) 包含当第三核酸链与第二转录产物杂交时由RNA酶Η识别的至少4个连续核苷酸， (iii) 第三核酸链中核苷酸和任选地核苷酸类似物的总数是8至100,并且（iv)第三核酸 链与第二转录产物杂交。
43. 根据权利要求40所述的方法，其中第三核酸链包含PNA核苷酸。
44. 根据权利要求40-43中任一项所述的方法，其中第三核酸链还包含具有功能的功 能性部分，所述功能选自标记功能、纯化功能和祀向递送功能。
45. 根据权利要求39或44所述的方法，其中所述功能性部分是选自脂质、肽和蛋白质 的分子。
46. 根据权利要求45所述的方法，其中功能性部分与核酸链的3'末端核苷酸或5'末 端核苷酸连接。
47. 根据权利要求法45或46所述的方法，其中功能性部分是脂质。
48. 根据权利要求47所述的方法，其中脂质选自胆固醇、脂肪酸、脂溶性维生素、糖脂 和甘油酯。
49. 根据权利要求47所述的方法，其中功能性部分是选自胆固醇、生育酚和生育三烯 酚的脂质。
50. 根据权利要求45或46所述的方法，其中功能分子是选自受体配体和抗体的肽或蛋 白质。
51. 减少哺乳动物中基因表达水平的方法，包括向所述哺乳动物施用有效量的药物组 合物的步骤，所述组合物包含： (a) 双链核酸复合物，所述双链核酸复合物包含与第二核酸链复性的第一核酸链，其 中： 第一核酸链（i)包含核苷酸和任选地核苷酸类似物，并且第一核酸链中核苷酸和任选 地核苷酸类似物的总数是8至100,（ii)包含当第一核酸链与所述基因的转录产物杂交时 由RNA酶Η识别的至少4个连续核苷酸，并且（iii)第一核酸链与转录产物杂交；和 第二核酸链包含核苷酸和任选地核苷酸类似物；和 (b) 可药用载体。
52. 权利要求48所述的方法，其中施用途径是经肠途径。
53. 权利要求48所述的方法，其中施用途径是肠胃外途径。
54. 权利要求51-53中任一项所述的方法，其中剂量是0· 001mg/kg/日至50mg/kg/日 的双链核酸复合物。
55. 权利要求51-54中任一项所述的方法，其中哺乳动物是人。
56. 纯化的或分离的双链核酸复合物，包含与第二核酸链复性的第一核酸链，其中： 第一核酸链（i)包含核苷酸和任选地核苷酸类似物，并且第一核酸链中核苷酸和核苷 酸类似物的总数是8至100,（ii)包含当第一核酸链与转录产物杂交时由RNA酶Η识别的 至少4个连续核苷酸，（iii)包含至少一个非天然核苷酸，并且（iv)第一核酸链与转录产 物杂交；并且 第二核酸链包含核苷酸和任选地核苷酸类似物。
57. 根据权利要求56所述的纯化或分离的双链核酸复合物，其中第二核酸链包含 (i) RNA核苷酸和任选地核苷酸类似物，以及任选地DNA核苷酸；或 (ii) DNA核苷酸和/或核苷酸类似物；或 (iii) PNA核苷酸。
58. 用于治疗哺乳动物的药物组合物，包含权利要求56或57所述的双链核酸复合物和 可药用载体，其中转录产物是哺乳动物转录产物。
59. 权利要求56或57所述的双链核酸复合物的用途，用于制备减少哺乳动物中基因表 达的药物。
60. 权利要求56或57所述的双链核酸复合物的用途，用于减少哺乳动物中基因的表 达。
【文档编号】C12N15/11GK104126010SQ201280062110
【公开日】2014年10月29日 申请日期:2012年12月17日 优先权日:2011年12月16日
【发明者】横田隆德, 仁科一隆, 小比贺聪, 水泽英洋 申请人:国立大学法人东京医科齿科大学, 国立大学法人大阪大学