专利名称：一种检测猪流行性乙型脑炎病毒的引物及可视化试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及猪感染乙型脑炎病毒的快速检测试剂盒及引物。
背景技术：
流行性乙型脑炎病毒又称日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus, JEV),简称乙脑病毒，所引起的疾病简称乙脑，乙脑是一种人畜共患的病毒性传染病，可以感染人类和多种动物，可以导致人的中枢神经系统疾病和猪的繁殖障碍，严重危害着人类的健康和畜牧业的发展。乙脑病原学实验室诊断方法可以检测病例的脑组织、胎儿、胎盘以及体液等中的病毒抗原。目前的诊断方法有:免疫细胞化学法、反向被动血凝试验、荧光抗体染色法和RT-PCR技术。日本长崎大学运用基因扩增的传统方法，发展了实时环介导逆转录等温扩增技术(reverse transcription loop-mediatedisothemal amplification,RT-LAMP),检测JEV的敏感性可以达到IPFU。然而，上述现有技术仍存在着缺点和不足:①实验结果的判断不够迅速直观需要贵重仪器设备，不利于推广检出效率还不够高。
发明内容
本发明的主要目的是，针对上述现有技术存在的缺陷提供一种可以用肉眼迅速判定实验结果，并利用环引物加强反应的检测试剂盒。为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案:—对检测猪流行性乙型脑炎病毒的环引物，其应用于环介导逆转录等温扩增技术(RT-LAMP)中，其特征在于，该对环引物包括:上游环引物(FL)，其序列如序列表SEQ ID N0.5 所示:5’-CAGAAITTTCCTGGnTTCCCTGA-3’ ；下游环引物(BL)，其序列如序列表SEQ ID N0.6 所示:5’-GGTGGTAGCAGCAGAAATGGCA-3，。一组检测猪流行性乙型脑炎病毒的引物，其应用于环介导逆转录等温扩增技术(RT-LAMP)中，其特征在于，该组引物包括:上游内部引物(FIP)，其序列如序列表SEQ ID N0.1所示:5’ -CGCTGCTGGATAGCGTCCTT GAATTCGTGC TAGATTTGCA CCCTGG-3’ ；下游内部引物(BIP)，其序列如序列表SEQ ID N0.2所示:5’ -AAGAACAGCTGTGTTGGCAC CGGATATCGT ACTGGGAGCC CT-3’ ；上游外部引物(F3)，其序列如序列表SEQ ID N0.3所示:5’ -ACACCCCAAACATGTTGAGA-3’ ；下游外部引物(B3)，其序列如序列表SEQ ID N0.4所示:5’ -CTCTCTGCACTGCTGAAGTT-3’ ；上游环引物(FL)，其序列如序列表SEQ ID N0.5 所示:5’-CAGAAITTTCCTGGnTTCCCTGA-3’；下游环引物(BL)，其序列如序列表SEQ ID N0.6 所示:5’-GGTGGTAGCAGCAGAAATGGCA-3，。检测猪流行性乙型脑炎病毒的可视化试剂盒，其特征在于，其组成为:10 X Thermopol 反应缓冲液；10mmol /T, dNTPs ；乙脑病毒总RNA ；上游内部引物FIP，其序列如序列表SEQ ID N0.1所示；下游内部引物BIP，其序列如序列表SEQ ID N0.2所示；上游外部引物F3，其序列如序列表SEQ ID N0.3所示；下游外部引物B3，其序列如序列表SEQ ID N0.4所示；上游环引物FL，其序列如序列表SEQ ID N0.5所示；下游环引物BL，其序列如序列表SEQ ID N0.6所示；Bst DNA聚合酶大 片段；AMV反转录酶；20 X SYBR Green I ；DEPC ddH20。如上所述的可视化试剂盒在非活体样品的猪流行性乙型脑炎病毒检测中的应用，其特征在于，其步骤为:(I)在反应管中加入以下组分并混匀:10 X Thermopol 反应缓冲液，2.5 U L ；待测样品总RNA5.25 U L，阳性对照反应管中则加入阳性样品总RNA5.25 U L ；8U/管Bst DNA聚合酶大片段，IuL ；AMV 反转录酶 0.25 ii L ;10mmol /T, dNTPs, 2.5 U L ；20pmol/管上游内部引物，0.8iiL ;20pmol/管下游内部引物，0.8iiL ;5pmol/管上游外部引物,0.2 ii L ;5pmol/管下游外部引物,0.2 ii L ;20pmol/管上游环引物，0.L ;20pmol/管下游环引物，0.L ;DEPC ddH20 补齐至 25 ii L ;(2)置于42°C下保温30min，进行逆转录反应；(3)置于6(T65°C下保温3(T90min，进行LAMP扩增反应；(4)置于 80°C下 IOmin,灭活 Bst DNA 聚合酶；(5)悬置I ii L20XSYBR Green I于反应管盖，将之弹入反应液中并混匀；(6)将反应管置于紫外透射仪下，可见绿色荧光产生则待测样品为阳性。
如上所述的应用，步骤(4)后得到的LAMP扩增反应产物也可以利用凝胶成像系统进行检测，其特征在于:在检测时，使用TAE/TBE缓冲液试验伴侣配制琼脂胶，添加约20g/LGoldView 核酸染料染色，对反应产物进行电泳检测，电泳(260V/2000mA)约45分钟，观察结果，出现如图4所示的特异条带则待测样品为阳性。本发明的有益效果为:本发明提供了一种猪乙型脑炎病毒诊断环引物加强型可视化试剂盒，同时提供了一种检测程序简单、灵敏度和特异性较高的基因检测手段。本发明设计并使用了 RT-LAMP引物和环引物，优化反应体系，结果判定实现可视化，环引物加强反应。对猪乙型脑炎检测诊断防治具有较大意义。
图1为NS3基因保守区LAMP扩增结果。图2为LAMP扩增后产物的可视化结果，a为可见光下的结果，b为紫外光下的结果。图3为LAMP扩增后产物的酶切鉴定结果。图4为不同反转录时间的LAMP扩增结果。图5为不同反应时间LAMP扩增的结果。图6为NS3基因的LAMP检测特异性凝胶成像结果。图7a、b、c依次为RT-LAMP、RT-PCR和荧光RT-PCR的检测结果图。图8为乙型脑炎病毒检测实时RT-LAMP荧光走势图。
具体实施例方式一、JEV NS3基因保守区的LAMP扩增:以JEV总RNA为模板，用本发明提供的引物进行JEV NS3基因保守区的扩增，反应体系为:25 U L反应体系中含有:IOXThermopol 反应缓冲液(NEB 公司)，2.L ；JEV 总 RNA5.25 U L ；8U/管Bst DNA聚合酶大片段(NEB公司)，IiiL;AMV 反转录酶(NEB 公司)0.25 ii L ;10mmol /T, dNTPs, 2.5 U L ；20pmol/ 管上游内部引物(FIP)，0.8 ii L ；20pmol/ 管下游内部引物(BIP)，0.8 ii L ；5pmol/ 管上游外部引物(F3)，0.L ；5pmol/ 管下游外部引物(B3)，0.2 ii L ；20pmol/ 管上游环引物(FL)，0.4 ii L ；
20pmol/ 管下游环引物(BL)，0.4 ii L ；(上述引物均为宝生物工程(大连)有限公司合成)DEPC ddH20 补齐至 25 ii L。
按上述反应体系分多组进行实验，各组一同在42°C下逆转录反应30min后；然后分别在温度为63°C、64°C、65°C的水浴锅中保温进行LAMP扩增反应Ih，80°C下灭活Bst DNA聚合酶IOmin后，进行电泳检测；检测结果显示，在63°C、64°C条件下，都能扩增到条带，电泳条带呈梯状分布，与理论结果相符，阴性对照的扩增结果只有引物聚体带出现。如图1所示，M道为DNA分子量标记DL2000 ;1、2、3道分别为63°C、64°C、65°C条件下的扩增结果；4道为阴性对照。若在反应管中加入L20X的SYBR Green I，可见阳性管出现黄绿色，阴性管为褐色。将加入了 20X的SYBR Green I的反应管放置到紫外灯下照射，阳性反应管发出荧光，而阴性对照无明显变化。4000rpm离心30s后，可见阳性管的反应液有明显白色沉淀，这是因为扩增后形成的焦磷酸离子和溶液中的镁离子结合而形成焦磷酸镁沉淀所致。如图2所示，N管为阴性对照，P管为LAMP的扩增产物。
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二、LAMP扩增产物的酶切鉴定:扩增的产物是环状的重复的长度不等的哑铃状的DNA双链，需经酶切后产生大小特异的条带以进一步验证其LAMP扩增的特异性。酶切反应的反应体系为:25 U L反应体系中含有:IOX内切酶反应缓冲液，2 ii L ；EcoR I 酶，I U L ;RT-LAMP 的扩增产物，5u L ；ddH20 补至 25 U L。将上述反应物混匀离心后，37 °C反应2h。反应后取5iiL反应液，用含0.5iig/mL的EB的2%琼脂糖凝胶电泳对酶切反应产物进行检测。LAMP扩增产物酶切鉴定的结果如图3所示，其中M道为DNA分子量标准DL2000 ； I道为NS3基因LAMP扩增后产物经EcoR I酶消化后的结果；2道为NS3基因LAMP扩增后产物。理论上，LAMP扩增产物存在两个EcoRI内切酶位点，酶切后生成两种产物，大小分别为IlObp和130bp。由图3可见，检测结果与理论值相符。三、逆转录时间的优化:将反应物分为六组，一同放入42 °C水浴锅中反应，分别在反应后Omin、IOmin、20min、30min、40min和50min后取出，再在63°C反应lh，待反应产物全部取出后，取5 y L反应液，用含0.g/mL EB的2%琼脂糖凝胶电泳对反应产物进行检测。电泳检测结果如图4所示，其中，M道为DNA分子量标准DL2000 ;1_6道分别为反转录时间为Omin、10min、20min、30min、40min和50min的反应物；7道为阴性对照。由图4结果可见，省略逆转录步骤会对后续的等温扩增有一定的影响，但逆转录反应10-50min后，不同的逆转录时间对后续的反应没有显著的影响。四、LAMP扩增反应时间的优化:在相同的反转录条件下，采用不同反应时间进行环介导等温扩增，反应结果如图5所示，其中，M道为DNA分子量标准DL2000 ；1道为阴性对照；2_5道分别为NS3基因在反应30min、40min、50min、60min后的LAMP扩增结果。由图5结果可见:在反应时间为30min左右时，可见微弱的梯状条带；反应时间在30-60min之间时，梯状条带逐渐变亮；反应时间在60min左右时，梯状条带表现最明显。因此，LAMP扩增反应的最佳时间为60mim。五、特异性试验:分别提取猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪细小病毒、蓝耳病病毒、口蹄疫病毒、猪圆环2型病毒的RNA或DNA，用本发明的RT-LAMP试剂盒及方法进行检测。检测结果如图6所示，其中M道为DNA分子量标准DL2000 ；1道为流行性乙型脑炎病毒；2道为阴性对照；3道为猪瘟病毒；4道为猪伪狂犬病毒；5道为猪细小病毒；6道为蓝耳病病毒；7道为口蹄疫病毒；8道为猪圆环2型病毒；9道为猪丹毒；10道为猪大肠杆菌。由图6结果可见，本发明的试剂盒及检测方法特异性较好，与其它疾病没有交叉反应。六、敏感性对比实验:取JEV总RNA (8.13 X 108PFU/mL),按5倍比例连续稀释后，将各组RNA分别应用于RT-LAMP、RT-PCR和荧光定量PCR反应。其中:RT-LAMP的实验条件与具体实施方式
第一部分相同。RT-PCR所用引物为:JE-E-Pl:5，-TGCTGTTGGTCGCTCCGG CT TA-3，；JE-E-P2:5， -TGTCAATGGCACATCCAGTG-3，；使用一步法RT-PCR试剂盒(TaKaRa公司，大连)，按说明书进行操作。荧光定量PCR使用荧光定量PCR试剂盒(华银公司，广州)，按说明书进行操作。如图7a_c所示，RT-LAMP的检测极限为稀释57倍，RT-PCR的检测极限为稀释55倍，荧光定量PCR为53倍(结果显示稀释53倍的检测结果出现华银公司试剂盒阳性判定曲线)。因此，RT-LAMP比RT-PCR大约敏感25倍，比荧光定量PCR大约敏感625倍。七、乙型脑炎病毒检测的实时RT-LAMP方法:按照具体实施方式
第一部分记载的方法配制反应体系，在反应管中添加I u LQuant-1T PicoGreen,置于 Roche LightCycle2.0 荧光定量 PCR 仪中，每隔 I 分钟收集一次荧光。结果如图8所示。结果表明，在反应的第37分钟，荧光值开始迅速上升。在反应I小时左右，荧光值达到最大值。结果与具体实施方式
第四部分中的LAMP扩增时间梯度电泳图基本一致。八、本发明RT-LAMP检测方法对不同JEV毒株的检测结果:
采用本发明RT-LAMP方法对SA14-14-2株、SA103株、⑶06株3株不同毒株的检测结果均为阳性。且与RT-PCR检测结果一致。说明本发明的RT-LAMP试剂盒及检测方法在病毒流行性乙型脑炎病毒的检测中具有较好的适用性和应用前景。
权利要求
1.一对检测猪流行性乙型脑炎病毒的环引物，其特征在于，该对环引物包括: 上游环引物，其序列如序列表SEQ ID N0.5所示； 下游环引物，其序列如序列表SEQ ID N0.6所示。
2.一组检测猪流行性乙型脑炎病毒的引物，其特征在于，该组引物包括: 上游内部引物，其序列如序列表SEQ ID N0.1所示； 下游内部引物，其序列如序列表SEQ ID N0.2所示； 上游外部引物，其序列如序列表SEQ ID N0.3所示； 下游外部引物，其序列如序列表SEQ ID N0.4所示； 上游环引物，其序列如序列表SEQ ID N0.5所示； 下游环引物，其序列如序列表SEQ ID N0.6所示。
3.检测猪流行性乙型脑炎病毒的可视化试剂盒，其特征在于，其组成为: IOXThermopol反应缓冲液；`10mmol /T, dNTPs ； 乙脑病毒RNA ； 上游内部引物，其序列如序列表SEQ ID N0.1所示； 下游内部引物，其序列如序列`表SEQ ID N0.2所示； 上游外部引物，其序列如序列表SEQ ID N0.3所示； 下游外部引物，其序列如序列表SEQ ID N0.4所示； 上游环引物，其序列如序列表SEQ ID N0.5所示； 下游环引物，其序列如序列表SEQ ID N0.6所示； Bst DNA聚合酶大片段； AMV反转录酶； 20XSYBR Green I ；DEPC ddH20。
4.如权利要求3所述的可视化试剂盒在非活体样品的猪流行性乙型脑炎病毒检测中的应用，其特征在于，其步骤为: (I)在反应管中加入以下组分并混匀: `10 X Thermopol 反应缓冲液，2.5 u L ； 待测样品总RNA5.25 u L，阳性对照反应管中则加入阳性样品总RNA5.25 u L ； 8U/管Bst DNA聚合酶大片段，IuL ； AMV反转录酶0.25u L ；10mmol /T, dNTPs, 2.5 U L ； 20pmol/管上游内部引物,0.8 u L ； 20pmol/管下游内部引物,0.8 u L ； 5pmol/管上游外部引物，0.2uL； 5pmol/管下游外部引物，0.2uL； 20pmol/管上游环引物,0.4u L ； 20pmol/管下游环引物,0.4u L ； DEPC ddH20 补齐至 25u L ；(2)置于42°C下保温30min，进行逆转录反应；(3)置于6(T65°C下保温3(T90min，进行LAMP扩增反应；(4)置于80°C下IOmin,灭活BstDNA聚合酶；(5)悬置Iii L20XSYBR Green I于反应管盖，将之弹入反应液中并混匀；(6)将反应管置于紫 外透射仪下，可见绿色 荧光产生则待测样品为阳性。
全文摘要
本发明提供了一组检测猪流行性乙型脑炎病毒的引物，包括上游内部引物、下游内部引物、上游外部引物、下游外部引物、上游环引物和下游环引物，其序列依次如序列表SEQ ID No.1-6所示。本发明还提供了包含该组引物的检测猪流行性乙型脑炎病毒的可视化试剂盒及利用该试剂盒检测非活体样品上是否含有猪流行性乙型脑炎病毒的方法。本发明提供的引物、试剂盒和检测方法，优化了反应体系，结果判定实现了可视化，对猪乙型脑炎检测诊断防治具有较大意义。
文档编号C12Q1/70GK103103294SQ20131005376
公开日2013年5月15日 申请日期2013年2月19日 优先权日2013年2月19日
发明者林志雄, 田纯见, 何晓明, 罗琼, 鱼海琼, 罗长保, 陈茹, 刘志玲, 王宏, 吴晓薇, 毕英佐, 马静云 申请人:广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心