专利名称：用于抑制流行性乙型脑炎病毒的siRNA的制作方法
技术领域：
本发明涉及能诱导RNA干扰的小干扰RNA(SiRNA)，特别是涉及能够抑制流行性乙型脑炎病毒的siRNA，及其设计方法和用途。
背景技术：
流行性乙型脑炎病毒简称乙脑病毒，是经蚊虫传播的人畜共患急性传染病，是在全球范围内引起人脑炎的最严重的病因之一。1871年，日本首次报道了该病的流行，1935 年日本学者从病死的脑炎病人的脑组织中分离到该病毒，所以国际上将该病原体命名为日本脑炎病毒(Japanese encephalitisvirus, JEV)。据WHO统计，全球每年平均发病50000 例，死亡15000例。大约三分之一的患者会因此而死亡，存活的患者中有神经系统后遗症的患者占40% -70%,该病主要流行于亚洲、东南亚地区约20多个国家。20世纪90年代以来， 乙脑的流行区域不断扩大，1995年巴布亚新几内亚及澳大利亚北部岛屿出现乙脑的爆发流行，1998年在澳大利亚本土出现乙脑病例。2005年乙脑在印度和尼泊尔爆发流行，数千人患病。我国地域广阔，占亚洲四分之一区域，中国的乙脑发病数占全世界总发病数的80%以上，是乙脑流行大国。根据《中华人民共和国传染病防治法》，流行性乙型脑炎属于乙类传染病。自1938年通过血清学实验证实乙脑在中国流行并于1940年在北京分离到第一株乙脑病毒后，乙脑多次在我国境内爆发。近十年来，虽然乙脑的发病数呈逐年降低的趋势，亦未发生大流行，但每年仍有2万-3万的病例数。乙型脑炎同时也是一种人畜共患的自然疫源性传染病，在动物中猪为本病的主要危害对象。据报道猪群的发病率一般为20-30%，初产母猪的死胎和木乃伊比例可达50% 左右。因此该病感染猪造成的主要经济损失是怀孕母猪发生繁殖障碍，严重危害养猪业的健康稳定发展。针对乙型脑炎尚无特殊治疗措施，接种疫苗依然是保护易感人群的最有效预防措施。虽然接种疫苗能有效地保护未感染人群，但对于已感染的乙脑病患者，缺乏有力的治疗手段，所以，应用现代科技手段发展方便有效的抑制乙脑病毒感染的治疗方法法就显得尤为重要。乙脑病毒在分类上属于黄病毒科，黄病毒属，其基因组为单股正链RNA分子， 长约111Λ，分子量约为4X IO6道尔顿，沉降系数为42s。整个基因组由5’端非翻译区 (5’ -untranslated regions, UTR)，一个几乎跨越整个基因组的单一开放阅读框(open reading frame, 0RF)和3，端非翻译区(3，-UTR)所构成。5，端95个核苷酸和3，端586 个核苷酸为非编码区，从5’末端至3’末端编码的基因顺序为三个结构蛋白，包括衣壳蛋白C(Capsid)，膜蛋白M(membrane，PrM为前体)和囊膜蛋白E (envelope)，七个非结构蛋白 NSl，NS2A, NS2B，NS3，NS4A，NS4B和NS5，共编码约；3430个氨基酸，其基因组结构见图1。根据乙脑病毒基因组的核苷酸序列差异性，可将已鉴定的乙脑病毒毒株分为四个确定的基因型以及另外一个推测的基因型。基因1型和基因3型主要分布于中国、韩国、印度、泰国、菲律宾等大多数亚洲国家，为主要的流行基因型。基因2型和基因4型主要分布于马来西亚、印度尼西亚和北澳大利亚等国家，为地方性的基因型。RNA干扰(RNA interfering, RNAi)技术是近年来新发展起来的一种高效的、特异性强的基因阻断技术，是一种由双链RNA (dsRNA)或微RNA(microRNA，mi RNA)介导的、转录后mRNA水平关闭相应基因表达的序列特异性基因沉默机制。它也是体内基因组抵御外在感染和内部转座的一种保护机制，广泛存在于各种生物，如植物、真菌、昆虫、后生动物和哺乳动物，包括人类。对外源dsRNAs来说，当dsRNAs被导入体内后，dsRNA被Dicer切割成 21-25nt 的小干扰 RNAs (small interfering RNAs, siRNAs)。这些 siRNAs 结合 RNA 依赖性沉默复合体(RISC)后特异性降解序列上同源的靶标mRNAs。对于内源性miRNAs来说，RNA 的源转录本(primary RNAtranscripts，pri-miRNAs)在细胞核内被Drosha切割成60_70nt 的miRNA前体(miRNA precursors, pre-miRNAs)后被Exportin-5转运至细胞质中，在细胞质中，pre-miRNAs被Dicer切割成成熟的miRNAs。成熟的miRNAs行使切割靶标mRNA或者抑制翻译的作用。大多数的pri-miRNA转录本都以成簇的形式排列在RNA聚合酶II启动子下，以多顺反子的形式表达多个不同的miRNAs。在哺乳动物细胞中，外源导入化学合成的 21-29nt 的 siRNAs 或者短发卡 RNA (short hairpin RNA, shRNA)表达载体均能诱导 RNAi。 它的作用在基因功能研究领域和各种疾病的治疗领域尤其是病毒性疾病的治疗领域已显现出不可估量的价值。通过RNAi技术，选择不同的靶位点应用SiRNA抑制病毒复制与侵染已在多种病毒中公开。针对乙脑病毒，以往的研究已有报道能有效抑制乙脑病毒复制的siRNAs或者 shRNAs。但这些报道的siRNAs或者shRNAs均只针对基因3型中的某一株乙脑病毒，这一特性使其效果受到极大的限制，因为，由于乙脑病毒基因组RNA序列的多变性，针对基因三型中某一株病毒有效的siRNA很难保证在基因3型中的其它株中有效，即使能在基因3型中适用，也很难保证其能在其他三种基因型中适用。另外，长期处于RNAi抑制下的病毒会在其靶序列的位置出现逃逸突变，单个或两个siRNAs很容易会由于逃逸突变的产生而失去效果。所以，最有效的抑制病毒复制的手段是针对乙脑病毒保守区靶序列的多条siRNAs 的联合用药。而这一方案在以往针对乙脑病毒的siRNAs的设计中并未涉及到。
发明内容
本发明应用RNAi技术，通过针对乙脑病毒基因组保守区的siRNA进行乙脑病毒的抑制研究，并验证了多个siRNA同时应用的有效性。具体地，本发明包括以下几个方面本发明的一个方面涉及诱导RNA干扰的分子，其包括正义链和反义链，其特征在于所述正义链或反义链选自以下(1)-(5)的序列(I)SEQ ID NO :1 SEQ ID NO :9 以及 SEQ ID N0:33 SEQ IDNO :50 所示任一序列；(2)与 SEQ ID NO 1 SEQ ID NO :9、SEQ ID NO :33 SEQ IDNO 50 中任一序列的同一性至少为70%的序列；(3)经过改造的选自(1)或(2)中的序列，其是在所述序列的5’方向和3’方向、 5’方向或3’方向上添加有至多60个核苷酸的序列；(4)将选自(1)-(3)的序列按照5’ -3’方向可操作地串联得到的序列，其中可操作地串联的序列为1种，其拷贝数为2个或者2个以上；和
(5)将选自(1)-(3)的序列按照5’ -3’方向可操作地串联得到的序列，其中可操作地串联的序列为2种以上，每1种的拷贝数至少为1。其中(2)的同一性优选至少80%，更优选至少84%，更优选至少89%，更优选至少 94%。其中( 中添加的核苷酸个数为至多50个，优选至多40个，更优选至多30个，更优选至多20个，最优选至多10个。其中(4)所述的序列为将3个、6个或9个拷贝的SEQ ID NO :2、SEQID NO 34或 SEQ ID NO 43的序列可操作地串联得到的序列，例如为SEQID NO 51 SEQ ID NO 53所示序列；其中(5)所述的序列为将SEQ ID NO :1 4、SEQ ID NO 5 9、SEQ ID NO :1 9、SEQ ID NO 33 36、SEQ IDNO 37 41、SEQ ID NO 33 41、SEQ ID NO 42 45、SEQ ID NO 46 50或SEQ ID NO 42 50的序列可操作地串联得到的序列，例如为SEQ IDNO 54 SEQ ID NO 56所示序列。本发明的另一方面涉及一种重组载体，其可操作地连接有本发明所述的诱导RNA 干扰的分子。本发明的还一方面涉及一种组合物，其含有本发明所述的诱导RNA干扰的分子或者重组载体，以及药学上可接受的载体。本发明的还一方面涉及获得抑制流行性乙型脑炎病毒的诱导RNA干扰的分子的方法，其包括(1)根据流行性乙型脑炎病毒的全基因组序列，选取在基因1型、2型、3型和4型分离株中的保守序列，作为潜在的靶序列；(2)将(1)中的潜在的靶序列与人类基因组数据库进行比对，排除和人类基因组中其它编码序列或表达序列标签同源的序列，将剩余的序列作为靶序列；和(3)根据步骤(2)获得的靶序列合成诱导RNA干扰的分子。其中所述的保守序列是指在基因1型、2型、3型和4型分离株的全基因组序列中 80%以上保守的序列，并且在基因1型和3型分离株的全基因组序列中90%以上保守的序列。在本发明的一个实施方案中，为在基因1型和3型分离株的全基因组序列中95%以上保守的序列。其中，步骤(3)中所述的靶序列选自两种或两种以上流行性乙型脑炎病毒蛋白的转录子序列。在本发明的实施方案中，其中所述两种或两种以上流行性乙型脑炎病毒蛋白的转录子序列选自(1)膜蛋白M和NSl蛋白；(2)赂2八、赂28、赂3、赂4六和赂48蛋白；或(3)膜蛋白M、NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A和NS4B蛋白。本发明的还一方面涉及本发明所述的诱导RNA干扰的分子或者重组载体在制备用于抑制流行性乙型脑炎病毒基因表达的组合物中的用途。本发明的还一方面涉及本发明所述的诱导RNA干扰的分子或者重组载体在制备用于治疗和/或预防流行性乙型脑炎的药物中的用途。本发明的还一方面涉及本发明所述的诱导RNA干扰的分子在制备用于抑制流行性乙型脑炎病毒的SiRNA中的用途。本发明的还一方面涉及抑制流行性乙型脑炎病毒的SiRNA所针对的靶序列，所述靶序列用cDNA表示为以下序列中的至少一种(1) SEQ ID NO :1 SEQ ID NO 9 以及 SEQ ID NO 33 SEQ IDNO 50 所示任一序列；(2)与 SEQ ID NO :1 SEQ ID NO :9、SEQ ID NO :33 SEQ IDNO 50 中任一序列的同一性至少为70 %的序列；优选至少80 %，更优选至少84 %，更优选至少89 %，更优选至少 94%。本发明的还一方面涉及SiRNA分子，其含有与本发明所述的靶序列对应或互补的 RNA序列。所述对应是指将用cDNA表示的靶序列中的T替换为U ；所述互补是指按照本领域公知的A-U、G-C、C-G、T-A原则与靶序列进行互补，得到RNA序列。在本发明中，诱导RNA干扰的分子在细胞或机体内被转换为实施抑制基因表达的效应siRNA分子。siRNA分子包括正义链和反义链，适用于本发明的siRNA分子可以通过本领域常用的方法制备。可以在体外制备siRNA，然后将其直接导入细胞中(例如通过转染)。更具体地，例如可以通过化学合成、体外转录或由siRNA表达质粒或病毒载体在细胞中表达，来制备本发明的的siRNA分子。在本发明的实施方案中，将SEQ ID NO 11 SEQ ID NO 28所示序列分别连接入 siRNA表达载体中，将载体导入细胞以表达siRNA分子，干扰乙脑病毒基因的表达。本发明的实施方案中，将siRNA表达载体导入细胞后，siRNA以类似于内源性 miRNA的方式来表达，即RNA的源转录本在RNA聚合酶II的作用下转录后，在细胞核内被 Drosha切割成60_70nt的前体后被Exportin-5转运至细胞质中，在细胞质中，siRNA前体被Dicer切割成成熟的siRNA分子，成熟的siRNA分子行使切割靶标mRNA的作用。在本发明的实施方案中，根据抑制效果，挑选出抑制效果最好的、针对一种靶序列的siRNA分子，例如NS1-447，采用多拷贝，例如3个、6个、9个拷贝进行串联，以进一步增强抑制效果。在本发明的实施方案中，将针对不同基因的、部分或全部靶序列的siRNA分子进行串联，例如本发明中的siRNAX4，siRNAX5或siRNAX9，并在细胞中表达，实验证明，其具有更好的抑制基因表达的效果。可以采用将以上两种方法联合应用的方式，针对多个基因、同时采用多拷贝，以增强抑制效果。在本发明中，术语“可操作地连接”是指将核酸与另外的核酸序列置于在功能上具有关系的状态。这可以是相互连接的基因和控制序列以这样的方式连接，使得当适当的分子被结合到控制序列时，该基因的表达变得可行。例如，如果启动子控制编码序列的转录， 那么该启动子将可操作性地与该序列结合。通常，术语“可操作地连接”是指被连接的DNA 序列是相邻的，并且在分泌性前导序列的情况中，是相邻的且在阅读框内。所述序列的连接是通过在适当的限制酶位点上进行连接来实施的。如果所述位点不存在，可以使用根据常规方法合成的寡聚核苷酸衔接子或接头。
在本发明中，小干扰RNA (siRNA)指包括约10_60个核苷酸(或核苷酸类似物)，能够指引或介导RNA干扰的RNA (或RNA类似物)。siRNA包括双链siRNA和单链siRNA，在本发明中一般是指双链siRNA，包括正义链和反义链。在本发明中，靶序列除包括SEQ ID NO :1 SEQ ID NO :9所示序列以外，还包括与此序列不同的其它乙脑病毒株的全基因组序列中与SEQ IDNO :1 SEQ ID NO 9所示序列相对应的序列。在本发明中，所述同一性是指在比较的两条序列的对应窗口中相同核苷酸所占的比例，所述窗口的大小是指15个以上核苷酸组成的窗口，优选至少17，更优选至少约18或 19至21-23或24- 个核苷酸的窗口，所述同一性至少70%，是指在对应窗口中至少70% 的核苷酸相同，优选至少80 %，更优选至少84%，更优选至少89 %，更优选至少94 %，例如 95%，96%，97%，98%，99%或100%。其中不同的核苷酸优选位于序列的5'和/或3' 端，例如位于距5'和/或3'端1-4个核苷酸序列内。在本发明中，所述抑制流行性乙型脑炎病毒基因表达，是指蛋白，DNAJP /或RNA 水平可观察到的降低或消失，例如减少至少约50 %，60 %，70 %，80 %，90 %，95 %，99 %或更多的表达。抑制的结果可通过检测细胞或机体的表型或生化技术而证实，所述生化技术例如为Northern杂交，基因芯片，酶联免疫吸附试验(ELISA)，Western Blot，荧光激活细胞分选(FACS)或放射免疫试验(RIA)等。发明的有益效果在本发明中，应用RNAi技术，通过针对乙脑病毒基因组保守区的siRNA进行乙脑病毒的抑制研究，为抑制各种不同基因型乙脑病毒复制引起的感染提供了新的途径，也为乙脑的预防与治疗提供了新的思路。有效的siRNA靶位点不仅可以作为新的化学药物靶位点，而且siRNA可以直接作为强有效的药物用于乙脑的预防与治疗，特异性强，不易引起副反应，给药方便、快捷。多条siRNAs的联合用药不仅进一步增加了其广谱的抗乙脑病毒的效果，而且对于预防病毒的逃逸突变提供了保证。本发明目前研制和开发治疗乙脑的siRNA 药物不但具有实际可操作性而且拥有良好的应用前景。
图 IsiRNAs 表达载体 pcDNA 6. 2-Gff/EmGFP-miR 示意2萤火虫荧光素酶siRNAs报告质粒载体示意3siRNAs表达载体对靶序列表达的抑制效果图，其中NC对照为转染无关siRNA 及荧光素酶表达载体的细胞，mock为转染荧光素酶表达载体未转染siRNAs表达载体的细胞，其它为转染能表达针对PrM，NSl, NS2A, NS2B, NS3, NS4A和NS4B基因不同靶位点特异 siRNA及荧光素酶表达载体的细胞。纵坐标表示以转录活性内对照的海肾荧光素酶为标准化的萤火虫荧光素酶活性。图4siRNAs表达框架的串联示意5流式细胞仪检测siRNA转染阳性的细胞百分比，其中左图为未转染siRNA的细胞，右图为转染了 siRNA表达载体NS1-447的细胞。图6瞬时转染特异siRNAs表达载体对乙脑病毒SA14_14_2株基因组RNA抑制情况。其中NC为转染阴性对照siRNA表达载体，Mock为未转染siRNAs的对照。图中的每一
8个数据表示三个重复实验的平均值。图7siRNA表达载体对病毒囊膜蛋白E蛋白表达的抑制情况图。其中，泳道1_13 依次表示 BHK-21 细胞在转染 PrM-54，NS1-447，NS1-630，NS1-1207，NS2A-461，NS2B-123， NS3-1112，NS4A-289，NS4B-115，siRNAs X 4，siRNAs X 5，siRNAs X 9 和 NC 对照后感染乙脑病毒SA 14-14-2囊膜蛋白E蛋白的表达情况；泳道14表示未转染质粒的BHK-21细胞中囊膜蛋白E蛋白的表达情况；泳道15为未转染质粒未感染乙脑病毒的BHK-21细胞对照。Actin 作为内对照。图 8 感染后 24 小时稳定表达 NS1-447、(NS1-447) X6、siRNAsX9 禾Π NC 的 ΒΗΚ-21 细胞对乙脑病毒SA14-14-2株基因组RNA的抑制情况比较。其中，Mock为普通ΒΗΚ-21感染病毒的对照。图中的每一个数据表示三个重复实验的平均值。图9稳定表达细胞系对病毒囊膜蛋白E蛋白的抑制情况。其中，泳道1-4分别依次代表稳定表达siRNAsX9、(NS1-447) X6、NS1_447和NC对照的细胞系对病毒囊膜蛋白E 蛋白的抑制情况，泳道5为普通BHK-21感染病毒的对照，泳道6为普通BHK-21细胞未感染病毒的对照。Actin为内对照。图 10 感染后 48 小时稳定表达NS1-447、(NS1-447) X6、siRNAsX9 和 NC 的 BHK-21 细胞对乙脑病毒SA14-14-2株扩增滴度的抑制情况比较。Mock为普通BHK-21感染病毒的对照。图中的每一个数据表示三个重复实验的平均值。图 11 感染后 96 小时稳定表达NS1-447、(NS1-447) X6、siRNAsX9 和 NC 的 BHK-21 细胞的存活情况对比。Mock为普通BHK-21感染病毒的对照。Cell control为未感染病毒的BHK-21细胞。图中的每一个数据表示三个重复实验的平均值。图12稳定表达细胞系对病毒SA14、SH53以及SHlOl囊膜蛋白E蛋白的抑制情况。 图中，泳道1-3分别依次代表稳定表达siRNAsX9、(NS1-447) X6和NC对照的细胞系对病毒囊膜蛋白E蛋白的抑制情况，泳道4为普通BHK-21感染病毒的对照，泳道5为普通BHK-21 细胞未感染病毒的对照。Actin为内对照。图13感染后48小时稳定表达siRNAsX9、(NS1-447) X6禾Π NC的ΒΗΚ-21细胞对乙脑病毒SA14、SH53以及SHlOl滴度的抑制情况。Mock为普通ΒΗΚ-21感染病毒的对照。 图中的每一个数据表示三个重复实验的平均值。图14稳定表达细胞系在SA14、SH53或者SHlOl病毒感染96小时候存活率检测。 感染后96小时稳定表达siRNAsX9、(NS1-447) X6和NC的BHK-21细胞的存活情况对比。 Mock为普通BHK-21感染病毒的对照。Cell control为未感染病毒的BHK-21细胞。图中的每一个数据表示三个重复实验的平均值。
具体实施例方式下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。实施例IsiRNA靶位点的选择分析GenBank中收录的所有乙脑病毒的全基因组序列共计64条，其中包括34条中国分离株。使用SeqMan软件做同源性比对，选取在80%以上全球分离株、95%以上中国分离株中保守的序列作为靶序列设计siRNAs。靶序列设计使用INVITR0GEN根据其siRNAs 表达载体提供的相应在线设计软件进行设计(http://rnaidesiRner. invitroRen. com/rnai express/ set Option, do ？ designQption = mirna&pid = 509133211138749536)。设计完成后使用 BLAST (www, ncbi. nlnuiiik^i)，将潜在的靶序列与人类基因组数据库进行比对，排除那些和其他编码序列或EST同源的序列。同时设计一组阴性对照siRNAs (negative control,NC)。表1为针对乙脑病毒ft"M，NSl, NS2A, NS2B, NS3, NS4A和NS4B基因编码区的siRNAs的靴序列。表1针对乙脑病毒基因编码区的siRNAs的靶序列
权利要求
1.诱导RNA干扰的分子，其包括正义链和反义链，其特征在于所述正义链或反义链选自以下(1)-(5)的序列(1)SEQID NO :1 SEQ ID NO 9 以及 SEQ ID NO 33 SEQ IDNO 50 所示任一序列；(2)与SEQ ID NO :1 SEQ ID NO :9、SEQ ID NO :33 SEQ IDNO 50 中任一序列的同一性至少为70%的序列；(3)经过改造的选自⑴或(2)中的序列，其是在所述序列的5’方向和3’方向、5’方向或3’方向上添加有至多60个核苷酸的序列；(4)将选自(1)-(3)的序列按照5’-3’方向可操作地串联得到的序列，其中可操作地串联的序列为1种，其拷贝数为2个或者2个以上；和(5)将选自(1)-(3)的序列按照5’-3’方向可操作地串联得到的序列，其中可操作地串联的序列为2种以上，每1种的拷贝数至少为1。
2.权利要求1的诱导RNA干扰的分子，其中(2)的同一性优选至少80%，更优选至少 84 %，更优选至少89 %，更优选至少94 %。
3.权利要求1的诱导RNA干扰的分子，其中( 中添加的核苷酸个数为至多50个，优选至多40个，更优选至多30个，更优选至多20个，最优选至多10个。
4.权利要求1的诱导RNA干扰的分子，其中(4)所述的序列为将3个、6个或9个拷贝的SEQ ID NO 2,SEQ ID NO 34或SEQ ID NO :43的序列可操作地串联得到的序列，例如为 SEQ ID N0:51 SEQ ID NO :53所示序列；其中(5)所述的序列为将SEQ ID N0:1 4、 SEQ ID NO 5 9、SEQ ID NO :1 9、SEQ ID NO 33 36、SEQ ID NO 37 41、SEQ ID NO 33 41、SEQ ID NO :42 45、SEQ ID NO :46 50 或 SEQ ID NO 42 50 的序列可操作地串联得到的序列，例如为SEQ ID N0:54 SEQ ID N0:56所示序列。
5.重组载体，其可操作地连接有权利要求1-4任一项所述的诱导RNA干扰的分子。
6 组合物，其含有权利要求1-4任一项所述的诱导RNA干扰的分子或者权利要求5的重组载体，以及药学上可接受的载体。
7.获得抑制流行性乙型脑炎病毒的诱导RNA干扰的分子的方法，其包括(1)根据流行性乙型脑炎病毒的全基因组序列，选取在基因1型、2型、3型和4型分离株中的保守序列，作为潜在的靶序列；(2)将(1)中的潜在的靶序列与人类基因组数据库进行比对，排除和人类基因组中其它编码序列或表达序列标签同源的序列，将剩余的序列作为靶序列；和(3)根据步骤(2)获得的靶序列合成诱导RNA干扰的分子。
8.权利要求7的方法，其中所述的保守序列是指在基因1型、2型、3型和4型分离株的全基因组序列中80%以上保守的序列，并且在基因1型和3型分离株的全基因组序列中 90%以上保守的序列，优选为在基因1型和3型中95%以上保守的序列。
9.权利要求7的方法，其中，步骤C3)中所述的靶序列选自两种或两种以上流行性乙型脑炎病毒蛋白的转录子序列。
10.权利要求9的方法，其中所述两种或两种以上流行性乙型脑炎病毒蛋白的转录子序列选自(1)膜蛋白M和NSl蛋白；(2)NS2A、NS2B、NS3、NS4A禾口 NS4B 蛋白；或(3)膜蛋白 M、NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A 和 NS4B 蛋白。
11.权利要求1-4任一项所述的诱导RNA干扰的分子或者权利要求5的重组载体在制备用于抑制流行性乙型脑炎病毒基因表达的组合物中的用途。
12.权利要求1-4任一项所述的诱导RNA干扰的分子或者权利要求5的重组载体在制备用于治疗和/或预防流行性乙型脑炎的药物中的用途。
13.权利要求1-4任一项所述的诱导RNA干扰的分子在制备用于抑制流行性乙型脑炎病毒的siRNA中的用途。
14.抑制流行性乙型脑炎病毒的siRNA所针对的靶序列，所述靶序列用cDNA表示为以下序列中的至少一种(1)SEQID NO :1 SEQ ID NO 9 以及 SEQ ID NO 33 SEQ IDNO 50 所示任一序列；(2)与SEQ ID NO :1 SEQ ID NO :9、SEQ ID NO :33 SEQ IDNO 50 中任一序列的同一性至少为70%的序列；优选至少80%，更优选至少84%，更优选至少89%，更优选至少 94%。
15.siRNA分子，其含有与权利要求14所述的靶序列对应或互补的RNA序列。
全文摘要
本发明涉及用于抑制流行性乙型脑炎病毒的siRNA，及其设计方法和用途。具体地，本发明根据流行性乙型脑炎病毒的全基因组序列，选取在基因1型、2型、3型和4型分离株中的保守序列作为靶序列。根据靶序列设计的siRNA分子在导入细胞后，能够有效抑制乙脑病毒基因的表达；当不同的siRNA分子串联后导入细胞，能获得更好的抑制效果。本发明还涉及所述的siRNA分子用于抑制流行性乙型脑炎病毒基因表达的用途以及用于制备治疗和/或预防流行性乙型脑炎的药物的用途。本发明为抑制各种不同基因型乙脑病毒引起的感染提供了新的途径。
文档编号C12N15/11GK102154290SQ20111000510
公开日2011年8月17日 申请日期2011年1月12日 优先权日2011年1月12日
发明者吴志强, 金奇 申请人:中国医学科学院病原生物学研究所