专利名称：一种从组织中分离富集靶细胞的方法
技术领域：
本发明属于生物科学和药物研发领域。
背景技术：
靶细胞的分离，富集在细胞学，分子生物学和免疫学方面有着广泛的应用。报导的血液循环癌细胞的临床研究结果显示，癌症患者的血液循环癌细胞的数量可以用于癌症患者的早期检测，诊断，病患的跟踪和预后等。由于癌细胞在癌症患者的血液中以极少量存在，为了能准确检测血液中的癌细胞的存在和数量，需要对血液样品中的癌细胞进行富集， 以提高其检测的灵敏度和准确性。近年来，血液循环癌细胞的分离，富集越来越受到科研， 临床上的重视。以乳腺癌患者为例，血液中循环癌细胞的数量与患者的临床表现有着密切的关联。在切除肿瘤组织后的最初的一段时间内，临床上就没有多少其他指标可以用来跟踪病患的病情。而乳腺癌的特点之一就是有很高的复发率，有效跟踪病患的病情，在临床上作出及时的处理，血液循环癌细胞的检测可提供一行之有效的指标。分离富集靶细胞的方法很多。首先可以将其分为抗体依赖性和非抗体依赖性两种。非抗体依赖性方法，主要是利用细胞的物理学特性(如细胞大小，密度和重量等)来分离靶细胞。而抗体依赖性方法又分为阳性富集和阴性富集。阴性富集是把非靶细胞成分去除来达到富集靶细胞的目的。而阳性富集则是利用靶细胞的特殊标记物(一般指特异性抗原等)来富集靶细胞。近年来的报导多是用新鲜的组织样品来富集靶细胞。可是，临床上多种病理组织，细胞和正常组织，细胞等样品，多在不同状态下保存。病理切片后，对特定的细胞进行研究分析，单个细胞的DNA/RNA收集和分析，在临床研究和应用方面已很普遍，但从切片组织中收集单个细胞的DNA/RNA是不全面地，不完整的。在癌症标记物研发中，多是用癌组织与正常组织进行比较。可想而知，癌组织中也有象血管，血液细胞和其他一些正常组织，细胞等存在于癌组织中，这给研发工作带来了许多不定的因素。
发明内容
本实用新型的目的是解决上述问题而提供了一种从组织中分离富集靶细胞的方法，该方法可以从不同处理状态下的组织中分离富集靶细胞。本发明所采用的技术方案是
一种从组织中分离富集靶细胞的方法，包括以下步骤
(1)将组织块在缓冲液中制备成单细胞的悬浮液；
(2)对单细胞的悬浮液进行离心处理，除去上清液，加入胰蛋白酶处理；接着加入含有 10%动物血清的细胞培养基，离心处理，除去上清液；最后加入含有10%动物血清的细胞培养基，转移到试管内；
(3)向试管内加入磁珠，磁珠与悬浮液中的靶细胞相结合，在4°C或室温下培养30 60分钟；所述磁珠含有单一的靶细胞的表面抗体、细胞质内抗体或者两者都有，磁珠粒径为50nM 4. 5uM，磁珠的浓度为单细胞悬浮液浓度的十分之一到五百分之一；(4)利用磁场器械将靶细胞从细胞悬浮液中分离富集出来；
(5)加入缓冲液，清洗掉非特异性结合的非靶细胞；
(6)抽离磁场，让与磁珠结合的靶细胞从磁场中释放出来，从而得到靶细胞。进一步地，所述步骤(2)后，经保-80°C以下或液态氮罐中保存过的样品；当需要对保存的组织进行靶细胞的分离和富集时，从液态氮罐中取出阳样品，使组织样品溶解，加入相当于试管内样品体积的5 10倍的蛋白质复性缓冲液，培养10 60分钟后，就可以用来进行靶细胞的分离和富集。优选地，所述组织为血液、骨髓液、组织块。优选地，所述步骤(1)缓冲液为磷酸缓冲液或不含动物血清的细胞培养液。优选地，所述步骤(3)中表面抗体为上皮细胞粘附分子抗体，MUCl。优选地，所述步骤(3)中细胞质内抗体为抗细胞角蛋白抗体。
更优选地，所述靶细胞包括癌细胞。本发明具有以下优点
本发明的方法可以从任何处理状态下的组织中分离富集靶细胞，例如从缓冲液(PBS， 细胞培养基等)处理过的新鲜组织块、血液、骨髓样品等，固定液(10%福尔马林固定液、4% 多聚甲醛固定液、70%乙醇固定液、100%甲醇固定液等)固定过的组织样品，低温保存(10% 二甲基亚砜液氮处理液)过的活体组织中分离富集靶细胞。该方法应用范围包括分离富集， 鉴定不同的靶细胞，提供纯化足够量的活的或固定过的靶细胞。利用该方法可以提高靶细胞检测的灵敏度，同时通过分离富集过程，可以收集到足够量的靶细胞，提供高纯度的靶细胞作为研究、临床诊断和分析研究的材料。同时对细胞的鉴定，准确的临床诊断以及药物研发有着非常重要的意义。
下面结合附图和实施方式对本发明作进一步详细的说明。图1为实施例1中经过10% 二甲基亚砜处理后富集癌细胞的显微镜图； 图2为实施例1中分离富集新鲜血液循环癌细胞的显微镜图3为实施例1中癌细胞的抗细胞角蛋白抗体的FITC荧光标记成像图； 图4为实施例1中血液白细胞表达⑶45显微镜图； 图5为实施例1中显示癌细胞和白细胞的细胞核被DAPI染色的显微镜图； 图6为实施例1中显示白光下的癌细胞和白细胞的形态学特征和整体结构显微镜图； 图7为实施例2中分离富集骨髓液中癌细胞的显微镜图。
具体实施例方式实施例1
利用有上皮细胞粘附分子抗体结合的磁珠来分离，富集用10%二甲基亚砜培养基处理过的，在液态氮保存过的癌细胞。(1)把新鲜的癌组织块加入到磷酸缓冲液(PBS)中，尽量拉细，制成有单细胞的悬浮液。(2)对单细胞的悬浮进行离心处理，离心速度为lOOOrpm，时间为5分钟，除去上清液，加入胰蛋白酶(Tripsin)处理5分钟；接着加入含有10%小牛血清的细胞培养基 ’离心处理，离心速度为lOOOrpm，时间为5分钟，除去上清液；最后加入含有10%DMS0的小牛血清，转移到2mL试管内。(3)将试管保存在_80°C下12小时，然后转移到液态氮罐中进行保存。(4)从液态氮罐中取出所需癌组织，使癌组织溶解；加入10倍体积的蛋白质复性缓冲液，培养60分钟；最后再加入与上述体积等量的，含10%小牛血清的细胞培养基。(5)加入有上皮细胞粘附分子抗体结合的磁珠(StemCellTechnology)，于4°C或室温下培养30分钟到一小时。(6)用磁棒将癌细胞从悬浮液中分离富集出来。(7)用缓冲液清洗掉非特异性结合的非靶细胞。(8)抽离磁场，让与磁珠结合的靶细胞从磁场中释放出来，从而得到靶细胞。图1是经过10% 二甲基亚砜培养基处理后富集癌细胞的显微镜图，从图1中可以看出，超低温保存过的癌细胞，单个的癌细胞或一群癌细胞，可以被癌细胞的特异性抗体结合，由磁珠富集出来。从而得出的结论是本发明的靶细胞的分离富集方法，在功能上是多方面的，在应用上是成功的。对上述分离富集出来的癌细胞进行血液循环癌细胞荧光免疫鉴定。(1)将分离富集到的含有血液循环癌细胞的样品用离心机离心到PLL载玻片 (Sigma)上(800rpm, 3min Cytospin)。(2)让载玻片上的样品在室温或在Slide warmer (Fisher)上干燥30-60分钟。(3)用-20°C的100%丙酮固定样品10分钟。(4)在空气中干燥30分钟。(5)用磷酸缓冲液(PBS)洗涤2次，每次3分钟。(6)用异硫氰酸荧光素(FITC)标记的CAM5. 2或PAN抗体，TexasRed标记的CD45 抗体混合物对细胞进行染色30分钟到一小时。(7)用pH7. 0-的磷酸缓冲液(PBS)缓冲液洗涤载玻片样品5分钟。(8)用上述缓冲液稀释了的苏木精依红染色液(50%浓度)，将上述载玻片样品染色 3分钟。(9)用上述缓冲液，加热到37度，洗涤载玻片样品3次。(10)加一滴DAPI安装试剂(Vector Laboratories)，盖上盖玻片，10分钟后，就可以在荧光显微镜下观察结果。(11)该载玻片样品在-20°C密封度保存。通过以上步骤，可以获得以下结果，参照图2至图6。从图2中可以看出，分离富集到的新鲜血液循环癌细胞(方形框内的细胞)。用这一染色法，不仅可以观察荧光标记到的蛋白质标记物，同时还可以观察到白光下的细胞形态结构。图3为癌细胞的抗细胞角蛋白抗体的FITC荧光标记成像(这意味癌细胞的抗细胞角蛋白抗体阳性);图4显示只有血液白细胞表达⑶45 (Texas红色)，癌细胞则没有；图5显示癌细胞和白细胞的细胞核都可以被 DAPI染色；图6显示白光下的癌细胞和白细胞的形态学特征和整体结构。从而得出的结论是本实施例的染色方法，采用局部特征和整体特征相结合，对癌细胞和血液白细胞的鉴定是最可靠的。
实施例2
本实施例是从骨髓液中分离富集的癌细胞，并对癌细胞进行检测，其具体步骤如下 (1)用癌症患者的临床抽取的骨髓液，用PBS稀释3倍。(2)混合后，加入十分之一体积的有上皮细胞粘附分子抗体的磁珠，4度或常温下培养30分钟到一个小时。(3)用磁铁吸附管中的有磁珠结合的靶细胞。用PBS缓冲液清洗三次。(4)抽离磁铁，让有磁珠结合的靶细胞释放。(5)收集靶细胞，鉴定癌细胞。细胞鉴定方法与实施例1相同。通过以上步骤，可以获得以下结果，参照图7。从图7中可以看到上皮细胞粘附分子抗体阳性的骨髓癌细胞，被有效地富集到，从而得出的结论是本实施例的癌细胞富集方法可以有效的应用到临床癌症病患的骨髓液样品。最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
权利要求
1.一种从组织中分离富集靶细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤(1)将组织块在缓冲液中制备成单细胞的悬浮液；(2)对单细胞的悬浮液进行离心处理，除去上清液，加入胰蛋白酶处理；接着加入含有 10%动物血清的细胞培养基，离心处理，除去上清液；最后加入含有10%动物血清的细胞培养基，转移到试管内；(3)向试管内加入磁珠，磁珠与悬浮液中的靶细胞相结合，在4°C或室温下培养30 60分钟；所述磁珠含有单一的靶细胞的表面抗体、细胞质内抗体或者两者都有，磁珠粒径为50nM 4. 5uM，磁珠的浓度为单细胞悬浮液浓度的十分之一到五百分之一；(4)利用磁场器械将靶细胞从细胞悬浮液中分离富集出来；(5)加入缓冲液，清洗掉非特异性结合的非靶细胞；(6)抽离磁场，让与磁珠结合的靶细胞从磁场中释放出来，从而得到靶细胞。
2.根据权利要求1所述的从组织中分离富集靶细胞的方法，其特征在于，所述步骤(2)后，经保-80°C以下或液态氮罐中保存过的样品；当需要对保存的组织进行靶细胞的分离和富集时，从液态氮罐中取出阳样品，使组织样品溶解，加入相当于试管内样品体积的 5 10倍的蛋白质复性缓冲液，培养10 60分钟后，就可以用来进行靶细胞的分离和富集。
3.根据权利要求1所述的从组织中分离富集靶细胞的方法，其特征在于，所述组织为血液、骨髓液、组织块。
4.根据权利要求1所述的从组织中分离富集靶细胞的方法，其特征在于，所述步骤 (1)缓冲液为磷酸缓冲液或不含动物血清的细胞培养液。
5.根据权利要求1所述的从组织中分离富集靶细胞的方法，其特征在于，所述步骤(3) 中表面抗体为上皮细胞粘附分子抗体，MUCl。
6.根据权利要求1所述的从组织中分离富集靶细胞的方法，其特征在于，所述步骤(3)中细胞质内抗体为抗细胞角蛋白抗体。
7.根据权利要求1至6任意一项所述的从组织中分离富集靶细胞的方法，其特征在于， 所述靶细胞包括癌细胞。
全文摘要
本发明公开了一种从组织中分离富集靶细胞的方法，属于生物科学和药物研发领域。该方法将组织制备成单细胞的悬浮液，利用阳性富集法将靶细胞从该细胞悬浮液中分离富集出来。本方法可以从不同处理状态下的组织中分离富集出靶细胞，为基础研究，临床研究，诊断，以及药物研发等提供足够量的，高度纯化的实验材料。
文档编号C12N5/07GK102174465SQ20111000537
公开日2011年9月7日 申请日期2011年1月12日 优先权日2011年1月12日
发明者邓亚光, 邓伟平, 邓存常 申请人:武汉格蓝丽富科技有限公司