在可回用两水相体系中利用固定化青霉素酰化酶催化合成头孢丙烯的方法
【专利摘要】本发明公开了一种可回用两水相体系中利用固定化青霉素酰化酶催化合成头孢丙烯的方法，包括将头孢丙烯母核、酰化试剂溶解在两水相聚合物溶液中，母核与酰化试剂摩尔比为1：1～4，加入固定化青霉素G酰化酶后再加入两相分配调节剂，调节pH＝4.5～7，在5～30℃反应1～80h，酶在反应体系中的浓度为50～150U/ml。本发明的方法可有效抑制青霉素酰化酶的水解活性，从而降低酰化试剂的水解和产物的水解程度。与用水作为介质的方法相比，本方法使得产物与酶分配在不同的两种水相中，反应物充分与酶接触，使得合成/水解比值得到了很大提高，头孢丙烯的产率可提高20%，最高得率达到78%。本发明采用新型的可回用两水相体系，体系回收再利用，降低了生产成本。
【专利说明】在可回用两水相体系中利用固定化青霉素酰化酶催化合成头孢丙烯的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及头孢丙烯的制备方法，尤其涉及一种在可回用两水相体系中利用固定化青霉素酰化酶催化合成头孢丙烯的方法。
【背景技术】
[0002]头孢丙烯(Cefprozil),是头孢菌素类广谱抗菌药。对G+、G—菌和厌氧菌的抗菌活性均很强，对G+菌尤为突出，对￠-内酰胺酶稳定，主要用于治疗中耳炎，呼吸道感染及皮肤和皮肤软组织感染等。头孢丙烯生物利用度高，胃肠道吸收完全，抗菌谱广，稳定性好，是一个发展前景很好的半合成头孢类药物。
[0003]头孢丙烯的化学合成主要有两种方法，一种是以头孢母核为起始原料，经Wittig反应在3-位引入丙烯基，7-位脱保护基团后引入侧链，最后在三氟乙酸作用下脱去7-位侧链氨基和4-位羧基上的保护基团；另一种是通过青霉素衍生物丙二烯氮杂环丁酮与Z-丙烯基有机铜试剂进行1，4_共轭加成形成头孢环，在3-位引入丙烯基，然后在7-位引入侧链而得头孢丙烯。
[0004]侧链和母核含有羟基、羧基等活泼基团，且化学合成的选择性低，在反应中往往会发生多种副反应。为了避免这些副反应，在合成时需要对活泼基团进行保护，通常选用硅烷化保护的母核与酸酐侧链。一些反应条件如溶剂为二氯甲烷或者二甲基甲酰胺，硅烷化反应温度为零下四十度，去保护基团时要用较多盐酸等都增加了化学合成的复杂性。
[0005]Vroom的研究中，将苯甘氨酸、对羟基苯甘氨酸制成相应的酰胺衍生物,利用固定在凝胶和氨基酸多聚体上的青霉素酰化酶的催化作用，合成了头孢丙烯等一系列药物。Usher研究了用侧链羧酸酯和含有`氨基的母核在青霉素酰化酶的作用下催化合成日-族抗生素。其中以7-氨基-3-丙烯基-3-头孢菌素-4-羧酸为起始原料，在固定化青霉素酰化酶的作用下，与对羟基苯甘氨酸乙二醇酯缩合得到头孢丙烯。冯胜昔以7-苯乙酰氨基-3-E-丙烯基-3-头孢菌素-4-羧酸(反式GPRA)为原料，在青霉素酰化酶作用下水解得到3-E-丙烯基-3-头孢菌素-4-羧酸(反式APRA)，将固相酶过滤后，调滤液pH分离得到反式APRA。然后将实验用量的反式APRA与对羟基苯甘氨酸乙二醇酯在青霉素酰化酶作用下缩合得到反式头孢丙烯。
[0006]酶催化合成反应在很多方面展现了比化学合成反应更大的优势，酶法合成具有工艺简单，无需基团保护，环境友好，反应条件温和等优点，但是酶催化反应其本身有一定的局限性，比如在应用中普遍存在产物的积聚对酶带来的反馈抑制，影响酶催化合成的能力并且容易造成产物的水解。为了克服这些弊端，需要选择一个合适的反应介质，可以及时转移酶周围的产物并且保持底物与酶的接触，这样有利于促进酶催化反应的能力并且提高产率。
[0007]有机溶剂可以实现产物的分离，但是对酶的稳定性有不利影响，两水相体系的生物相容度高，成相条件温和，不会破坏酶的活性，且在相界面处有低的界面能，振荡后一相在另一相中形成微小乳液，传质速率快，通常可以基于物质的分配系数不同而将其分离，实现生物转化反应与分离的耦合。所以两水相体系可以为酶催化反应提供一个良好的介质，基于对产物的分配作用可以将其及时转移，产物与酶的分配在不同的相可以减少自身的水解以及对酶的抑制。
[0008]对于青霉素酰化酶的催化合成头孢丙烯反应的研究较少，用于酶催化合成的两水相体系也是较为昂贵且为不易回收的聚乙二醇及盐的体系。头孢丙烯传统化学合成方法存在弊端，亟待改进，酶催化合成虽然有一定优势，但也有一定缺陷，传统两水相体系不能回收利用而限制了大规模生产。
【发明内容】
[0009]本发明的目的在于提供一种在可回用两水相体系中利用固定化青霉素酰化酶催化合成头孢丙烯的方法，该合成头孢丙烯的方法生产成本低，较为经济，是一种温和、有效、污染少、产率高的合成头孢丙烯的方法，最高得率达到78%。
[0010]为了实现上述目的，本发明采用如下的技术方案:
一种在可回用两水相体系中利用固定化青霉素酰化酶催化合成头孢丙烯的方法，包括如下步骤:
(1)将头孢丙烯母核、酰化试 剂溶解于可回用两水相聚合物溶液中，其中加入的头孢丙烯母核与酰化试剂的摩尔比为1:1-4 ;
(2)将固定化青霉素酰化酶加入步骤(I)获得的溶液中，再加入使头孢丙烯在两相之间进行分配的调节剂，调节反应体系pH值为4.5-7.0，反应体系在5-30°C反应I-80 h，分离获得所述头孢丙烯，其中青霉素酰化酶在反应体系中的浓度为50-150U/ml (IU=I个酶活单位)，头孢丙烯母核在反应体系中的浓度为10-80mM。
[0011]本发明步骤(I)中，所述头孢丙烯母核为具有结构式(I)的化合物或其盐酸盐，可从市售够得，也可通过化学合成方法获得，结构式(I )的化合物为7-氨基-3-丙烯基头孢烷酸:
【权利要求】
1.一种在可回用两水相体系中利用固定化青霉素酰化酶催化合成头孢丙烯的方法，其特征在于:包括如下步骤: (1)将头孢丙烯母核、酰化试剂溶解于可回用两水相聚合物溶液中，其中加入的头孢丙烯母核与酰化试剂的摩尔比为1:1-4 ; (2)将固定化青霉素酰化酶加入步骤(I)获得的溶液中，再加入使头孢丙烯在两相之间进行分配的调节剂，调节反应体系pH=4.5-7.0，反应体系在5-30°C反应I-80 h，分离获得所述头孢丙烯，其中青霉素酰化酶在反应体系中的浓度为50-150U/ml，头孢丙烯母核在反应体系中的浓度为10-80mM。
2.根据权利要求1所述的在可回用两水相体系中利用固定化青霉素酰化酶催化合成头孢丙烯的方法，其特征在于:步骤(I)中，所述头孢丙烯母核为具有结构式(I )的7-氨基-3-丙烯基头孢烷酸或其盐酸盐:
3.根据权利要求1所述的在可回用两水相体系中利用固定化青霉素酰化酶催化合成头孢丙烯的方法，其特征在于:步骤(I)中，所述酰化试剂为具有结构式(II)的化合物:
4.根据权利要求1所述的在可回用两水相体系中利用固定化青霉素酰化酶催化合成头孢丙烯的方法，其特征在于:所述可回用两水相体系是由两种可回用的聚合物形成的，每种可回用聚合物在两水相体系中的浓度为2%-5% (w/w)。
5.根据权利要求4所述的在可回用两水相体系中利用固定化青霉素酰化酶催化合成头孢丙烯的方法，其特征在于:所述可回用两水相体系是温度响应的聚合物Pnb与PH响应的聚合物Padb形成的两水相体系，或者是两种PH响应的聚合物Padb与Padba形成的两水相体系，或者是PH响应的聚合物PADB与柠檬酸钠形成的两水相体系。
6.根据权利要求1、4或5所述的在可回用两水相体系中利用固定化青霉素酰化酶催化合成头孢丙烯的方法，其特征在于:所述聚合物Pnb通过调节温度至其低温临界溶解温度对其进行回收利用，所述聚合物Padb与Padba通过调节PH值至相应聚合物的等电点进行回收利用。
7.根据权利要求1所述的在可回用两水相体系中利用固定化青霉素酰化酶催化合成头孢丙烯的方法，其特征在于:步骤(2)中，使头孢丙烯在两相之间进行分配的调节剂为硫酸铵、磷酸二氢钠或者磷酸二氢钾，其浓度为IOmM-lOOmM。
8.根据权利要求1所述的在可回用两水相体系中利用固定化青霉素酰化酶催化合成头孢丙烯的方法，其特征在于:所述头孢丙烯母核在反应体系中的浓度为30-50mM ;所述头孢丙烯母核与酰化试剂的摩尔比为1:3。
9.根据权利要求1所述的在可回用两水相体系中利用固定化青霉素酰化酶催化合成头孢丙烯的方法，其特征在于:步骤(2)中，反应体系的反应温度为10-20°C ;反应体系的反应时间为30-80h ;反应体系的pH值为5.0-6.5。
10.根据权利要求1所述的在可回用两水相体系中利用固定化青霉素酰化酶催化合成头孢丙烯的方法，其特征在于，所述固定化青霉素酰化酶为固定化的青霉素G酰化酶；该青霉素G酰化酶来源于大肠埃希氏菌(Escherichia coli)、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)或幾产 喊菌(Alcaligenes faecalis)。
【文档编号】C12P35/04GK103451259SQ201310341198
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2013年8月7日 优先权日:2013年8月7日
【发明者】曹学君, 祝超慧, 唐子安, 赵志炎, 李玉丹, 陈佳伶 申请人:南通康鑫药业有限公司, 华东理工大学