一种荚膜红细菌hemA基因的胞内高活性表达方法
【专利摘要】本发明公开了一种荚膜红细菌hemA基因的胞内高活性表达方法，该方法以荚膜红细菌（DSMNo.1710）基因组DNA为模板，扩增得到编码ALA合成酶的含有较多大肠杆菌稀有密码子的hemA基因，将其克隆到表达载体pET28a上，并利用E.coliRosetta(DE3)表达上述重组质粒，首次实现该荚膜红细菌hemA基因在E.coliRosetta（DE3）胞内高活性表达。本发明工程菌有非常高的可溶ALA合成酶表达，获得的ALA合成酶比活力高达198.2nmol-1?min-1?mgofprotein-1。将其应用于生产，所得胞外ALA产量高达8.61g/L，具有非常好的工业化前景。
【专利说明】—种荚膜红细菌hemk基因的胞内高活性表达方法
【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程和发酵工程领域，尤其涉及一种荚膜红细菌基因的胞内高活性表达方法。【背景技术】
[0002]5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid, ALA)广泛存在于生物体中，是生物体内四吡咯类化合物(如血红素、叶啉和维生素B12等)的共同前体。5-氨基乙酰丙酸在农业上可用作光合作用促进剂、抗逆剂、落叶剂和除草剂等，用途广泛、对人畜无毒性，是极具发展前途的无公害绿色农用化学品。在医学领域，5-氨基乙酰丙酸作为新一代光动力学药物，在脑瘤、皮肤癌、膀胱癌和结肠癌等疾病的诊断和治疗方面有着极大的应用价值。基于ALA广阔的应用前景，其合成已引起广泛的重视。
[0003]ALA的生产主要有化学合成法和生物合成法。前者步骤繁琐、副产物多且产率低；后者克服了前者的弊端，主要通过生物诱变法或基因工程法来实现。生物诱变法主要是优化类球红细菌iHhodobacter sphaeroides)突变株,但其培养周期长,成本较高；基因工程法主要是构建含有ALA合成酶基因的工程菌，至今报道的ALA合成酶基因来源主要有类球红细菌{Rhodobacter、大豆根瘤菌 iBradyrhizobium應)、沼泽红假单胞菌{Rhodopseudomonas palustris)等。
[0004]本发明利用万.Rosetta(DE3)表达含有较多大肠杆菌稀有密码子的荚膜红细菌{Rhodobacter capsulatus) AewA基因，通过胞内高活性表达ALA合成酶,进一步提高5-氨基乙酰丙酸的产量。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种荚膜红细菌基因的胞内高活性表达方法。
[0006]本发明的目的是通过以下技术方案来实现的:本发明的荚膜红细菌基因胞内高活性表达的方法是利用E.coli Rosetta (DE3)，表达含有较多大肠杆菌稀有密码子的荚膜红细菌基因。
[0007]上述荚膜红细菌基因的胞内高活性表达方法，包括以下步骤:
(O从荚膜红细菌的菌液中提取总基因组DNA ；
(2)PCR扩增ALA合成酶基因；
(3)采用双酶切法，将扩增得到的ALA合成酶基因与质粒pET28a连接，并转化至DH5α，筛选得到含有重组质粒pET28a-R.C.hemk的阳性克隆；
(4)将重组质粒pET28a-R.C.A￡?A转化至宿主菌Rosetta(DE3)中，筛选得到工程菌Rosetta (DE3) /pET28a-R.C.hemL.[0008](5)发酵培养工程菌Rosetta(DE3)/pET28a_R.C.hemk,使其胞内高活性表达荚膜红细菌基因。[0009]本发明的有益效果是，本发明将一种含有较多大肠杆菌稀有密码子的荚膜红细菌力6?A基因接入表达载体pET28a获得的重组质粒转化万.coli Rosetta (DE3),在诱导剂异丙基-β -D-硫代半乳糖苷(IPTG)作用下，实现胞内高活性可溶表达ALA合成酶。表达的ALA合成酶比活力高达198.2 nmoF1Hiin^mg of proteirT1,比现已投入工业化生产的含放射形土壤杆菌基因的工程菌获得的ALA合成酶(151.1 nmoF1Hiin-^g of proteirT1)提高31.2%。经初步优化后，将其应用于生产，胞外ALA产量高达8.61 g/L，处于国际化领先水平。
【专利附图】
【附图说明】
[0010]图1是重组质粒pET28a-R.C.hemk的构建图；图中，R.C.hemk为荚膜红细菌AeM基因，kana+为卡那霉素抗性基因，Hind III和NdeI为限制性内切酶位点。
[0011]图2是工程菌Rosetta(DE3)/pET28a_R.C.hemk发酵、诱导表达、纯化得到的ALA合成酶的电泳图。
【具体实施方式】
[0012]以下结合实施例进一步说明本发明，本发明的目的和效果将更加明显。
[0013]实施例1:构建本发明的工程菌，包括以下步骤:
1.从荚膜红细菌的菌液中提取总基因组DNA，该步骤由以下子步骤来实现:
1.1、将荚膜红细菌培养至菌液0D_大于1，收集备用；
1.2、按AxyPrep细菌基因组DNA小量试剂盒的标准步骤，提取基因组DNA ；
可以取5 μ?提取得到的基因组DNA,加I μι 6X loading buffer,用1% (w/v)琼脂糖凝胶电泳鉴定。
[0014]2.PCR扩增得到ALA合成酶基因，该步骤由以下子步骤来实现:
2.1、设计引物 Primerl (SEQ ID N0.1:5，-GGGAATTCCATATGGACTACAATCT CGCGCTC-3，)和 Primer2 (SEQ ID N0.2:5，-CCCAAGCTTAGGCCTCGGCGCGATT CAC-3’)，合成，两种引物分别溶于不含RNase (核糖核酸酶,Ribonuclease)的水中，配制成两个浓度均为10 μΜ的溶液；
2.2、取2 μ?步骤I提取的基因组DNA至PCR管，加入步骤2.1配制的两种引物各2μ1、10 μ? 的 5Χ PrimeSTAR GXL Buffer,4 μ? 的 dNTP Mixture (2.5 mM each)U μ? 的PrimeSTAR GXL DNA Polymerase,最后用灭菌蒸懼水补足至50 Ml，得反应液；
2.3、将上述50 μ?反应液放入PCR仪中，反应条件为:首先98°C预变性10 min，然后98°C变性10 s，58°C退火15 s，72°C延伸1.2 min，共30个循环，最后72°C延伸10 min，得PCR扩增产物；
2.4、在上述PCR扩增产物中加入5 μ?的10Χ loading buffer,混匀，经1%琼脂糖凝胶电泳，鉴定出一条约1.2kb的条带。
[0015]2.5、用SanPr印柱式DNA胶回收试剂盒(上海生工)回收上述条带，即得到ALA合成酶基因henA。
[0016]2.6、对上述ALA合成酶AeM基因进行DNA测序，得到SEQ ID N0.3所示的核苷酸序列。该序列含有较多的大肠杆菌稀有密码子，见附表1 ;
表13.采用双酶切法，将扩增得到的ALA合成酶基因hemk与质粒pET28a连接，并转化至DH5 α，筛选得到含有重组质粒pET28a-R.C.hemk的阳性克隆，该步骤由以下子步骤来实现:
3.1、取上述ALA合成酶基因和pET28a质粒各24 μ?，分别加入限制性内切酶HindIII和NdeI (TaKaRa)各 1.5 μ?, IOXK buffer 3 μ? ；
3.2、将上述两个双酶切反应体系置于37°C水浴中反应3 h，加入3 μ? IOXloadingbuffer停止反应,经1%琼脂糖凝胶电泳，并用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒(上海生工)回收，分别得到ALA合成酶和pET28a质粒的双酶切产物；
3.3、根据电泳条带的亮度以及片段的大小，确定连接时目的片段与载体的体积比为2:3。分别取上述ALA合成酶和pET28a的酶切产物2 μ?和3 μ?，与5 μ? Solution I(TaKaRa)混匀；
3.4、将上述10 μ?连接体系置于16°C，连接过夜，得到的连接产物转化感受态细胞DH5a ；
3.5、经卡那霉素抗性平板筛选出阳性克隆，挑取6个单菌落进行培养，并用AxyPrep质粒小量制备试剂盒提取重组质粒；
3.6、将上述6个重组质粒双酶切(Hind III和NdeI )，其中5个分别在5kb和1.2kb处有条带，认为连接成功，命名为重组质粒pET28a-R.C.hemk ;另外一个只有在5kb处有条带，说明目的基因没有连接上；
4.将重组质粒pET28a-R.C.A￡?A转化至宿主菌Rosetta(DE3)中，筛选得到含有上述重组质粒的工程菌，命名为Rosetta(DE3)/pET28a-R.C.AemA,即为本发明的工程菌。
[0017]实施例2:荚膜红细菌基因的胞内高活性表达
1、将本发明工程菌Rosetta(DE3)/pET28a-R.C.hemk接种至含50 ml LB培养基的250ml摇瓶，置于37°C、200 rpm摇床，培养2 h后降温至28°C，用25 μ? 0.1M异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导，继续培养6 h。
[0018]2、取2 ml菌液至离心管,4°C、12000 rpm离心I min,弃上清液;
3、用I ml 50 mM Tris-HCl (ρΗ7.5)重悬,4°C、12000 rpm 离心 I min,弃上清液；
4、用Iml 50mM Tris-HCl (ρΗ7.5)重悬后进行超声破胞，其条件为:200 W，工作5 s,间歇7 S，重复10次；
5、4°C、12000rpm离心10 min，取上清液进行10%SDS_聚丙烯酰胺凝胶电泳；
6、根据电泳结果，在47kDa附近有蛋白条带(见图2)，此蛋白即为5-氨基乙酰丙酸合成酶融合蛋白。[0019]实施例3:5-氨基乙酰丙酸合成酶的纯化和比活力测定
1、将实施例2中的菌液破胞，离心后得到的上清液即为ALA合成酶的粗酶；
2、将上述粗酶通过QIAGENN1-NTA亲和层析和S印hadex G-25凝胶过滤层析，纯化得到ALA合成酶的纯酶；
3、用BCAProtein Assay Kit测定上述纯酶的蛋白浓度；
4、将上述纯酶稀释至蛋白浓度为0.1 mg/ml，加入终浓度为50 mM的Tris-HCl(pH7.5)、0.1 M的甘氨酸、0.27 mM的磷酸吡哆醛、0.2 mM的琥珀酰辅酶A，配成500 μ?反应体系，于37°C振荡反应10 min，加入150 μ? 10%三氯乙酸终止反应；
5、取300μ?上述反应液与400 μ? I M乙酸盐缓冲液(ρΗ4.6)和35 μ?乙酰丙酮混匀，沸水浴反应15 min ；
6、待其冷却后取200μ?，加入200 μ?新配制的Ehrlich试剂，显色30 min，用紫外分光光度计测量其在554 nm处的吸光度，ALA的浓度(mg/L) =14.251 XOD554-0.2808(R2=0.9998)；
7、计算得到5-氨基乙酰丙酸合成酶纯酶的比活力为198.2 nmoF1Hiin^mg ofprotein^1 (一个酶活力单位定义为在37°C条件下，每分钟产生I nmol 5-氨基乙酰丙酸所需的酶量；比活力为每毫克蛋白所含的酶单位)。
[0020]8、按照上述步骤1-7，用CN101063105所述的工程菌代替本发明的工程菌，进行5-氨基乙酰丙酸合成酶的纯化和比活力测定，得到CN101063105所述的工程菌表达的5-氨基乙酰丙酸合成酶比活力为 151.1 nmoF1Hiin^mg of protein—1。
[0021]该实施例说明本发明的工程菌能高活性表达ALA合成酶，其比活力比CN101063105所述的工程菌(已投入工业化生产)提高31.2%。
[0022]实施例4:工程菌发酵生产5-氨基乙酰丙酸
按照CN101063105所述的方法，利用本发明的工程菌Rosetta(DE3)/pET28a_R.C.hemk发酵生产5-氨基乙酰丙酸。经过28.5 h的发酵，5-氨基乙酰丙酸的产量高达8.61 g/L。
[0023]上述实施例用来解释说明本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。
【权利要求】
1.一种荚膜红细菌基因的胞内高活性表达方法，其特征在于，该方法利用万.coliRosetta (DE3)表达含有较多大肠杆菌稀有密码子的荚膜红细菌基因。
2.根据权利要求1所述的荚膜红细菌基因的胞内高活性表达，其特征在于，该方法包括以下步骤: (O从荚膜红细菌的菌液中提取总基因组DNA ； (2)PCR扩增ALA合成酶基因hetnk ； (3)采用双酶切法，将扩增得到的ALA合成酶基因与质粒pET28a连接，并转化至DH5α，筛选得到含有重组质粒pET28a-R.C.hemk的阳性克隆； (4)将重组质粒pET28a-R.C.A￡?A转化至宿主菌Rosetta(DE3)中，筛选得到工程菌Rosetta(DE3)/pET28a-R.C.hemk ; (5)发酵培养工程菌Rosetta(DE3)/pET28a-R.C.使其胞内高活性表达荚膜红细菌hemk基因。
【文档编号】C12N15/54GK103468736SQ201310449211
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2013年9月27日 优先权日:2013年9月27日
【发明者】林建平, 漏佳伟, 朱力, 吴绵斌, 杨立荣, 岑沛霖 申请人:浙江大学