专利名称：一种去除细菌荚膜多糖中内毒素的方法
技术领域：
本发明涉及一种去除细菌荚膜多糖中内毒素的方法。
背景技术：
细菌毒素可分为两类，一类为外毒素(Exotoxin)，它是一种毒性蛋白质，是细菌在生长过程中分泌到菌体外的毒性物质，产生外毒素的细菌主要是革兰氏阳性菌，如白喉杆菌、破伤风杆菌、肉毒杆菌、金黄色葡萄球菌以及少数革兰氏阴性菌；另一类为内毒素 (Endotoxin)，它是革兰氏阴性菌细胞壁上的一种脂多糖(Lipoply Saccharide, LPS)和微量蛋白的复合物，它的特殊性不是细菌的代谢产物，而是细菌死亡或解体后才释放出来的一种具有内毒素生物活性的物质，其化学成份主要是由0-特异性链、核心多糖、类脂A三部分组成。许多生物工程制品由革兰氏阴性细菌如E. coli表达，细菌破碎后，样品中会含有大量的内毒素，内毒素对哺乳类动物有显著的致热性，当内毒素含量超过一定标准时，可能导致较严重的发热及过敏性紫癜等副反应，因此各国药审部门均对生物制品中的内毒素含量有严格的规定。由于革兰氏阴性菌的内毒素是一种脂多糖，与细菌荚膜多糖结构很相似，因此从细菌性疫苗特别是革兰氏阴性菌为基础的荚膜多糖疫苗制品生产中去除内毒素十分困难， 目前，常用的分离细菌荚膜多糖和内毒素的方法包括亲和层析法、活性炭吸附法、微孔膜分离法，这些方法都难以达到分离细菌荚膜多糖和内毒素的目的，世界卫生组织推荐的在革兰氏阴性细菌多糖产品中的内毒素的去除工艺为在IOOOOOg离心力的条件下超速离心4到 6个小时，但该工艺不但需要价格昂贵的超速冷冻离心机，而且一次处理的样品量受到限制。
发明内容
本发明的目的即在于克服现有技术的不足，提供一种利用荚膜多糖的亲水性和内毒素的疏水性，采用TritonX-114作为萃取剂，对b型流感嗜血杆菌荚膜多糖溶液中的内毒素进行进行一次或多次萃取，较好地去除荚膜多糖溶液中的内毒素，采用TritonX-114萃取法，一次萃取使b型流感嗜血杆菌荚膜多糖溶液中的内毒素含量下降90%，荚膜多糖回收率在85%以上，可有效、简便地降低细菌荚膜多糖产品中内毒素含量的一种去除细菌荚膜多糖中内毒素的方法。本发明的目的是通过以下技术方案来实现一种去除细菌荚膜多糖中内毒素的方法，它包括以下步骤
(1)在细菌荚膜多糖溶液中逐渐加入浓度为8 12%v/v的TritonX-114，直到混合溶液的终浓度为0. 8 1. 2%v/v，搅拌混合25 35分钟；
(2)搅拌混合均勻后，置于50 60°C条件下，5 15分钟后观察分层情况；
(3)待溶液分层后，置于自动离心装置内进行自动离心，自动离心装置的转速为3000 5000转/分，离心时间为8 12分钟，离心完成后收集上清液，完成一次萃取；
(4)用凝胶法鲎试剂检测(3)中所得上清液中内毒素含量，重复以上萃取步骤，直至内毒素含量小于50 EU/ μ g ；
(5)用无热原的注射用水透析(4)中所得上清液，透析时间20 观小时，透析去除残余的 TritonX-114。本发明的有益效果是本发明提供一种去除细菌荚膜多糖中内毒素的方法，利用荚膜多糖的亲水性和内毒素的疏水性，采用TritonX-114作为萃取剂，对b型流感嗜血杆菌荚膜多糖溶液中的内毒素进行一次或多次萃取，较好地去除荚膜多糖溶液中的内毒素，采用TritonX-114萃取法，一次萃取使b型流感嗜血杆菌荚膜多糖溶液中的内毒素含量下降 90%，荚膜多糖回收率在85%以上，可有效、简便地降低细菌荚膜多糖产品中内毒素含量。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明做进一步的描述，但本发明的保护范围不局限于以下所述。实施例1
一种去除细菌荚膜多糖中内毒素的方法，它包括以下步骤
(1)在细菌荚膜多糖溶液中逐渐加入浓度为8%v/v的TritonX-114，直到混合溶液的终浓度为1. 2%v/v，搅拌混合35分钟；
(2)搅拌混合均勻后，置于50°C条件下，15分钟后观察分层情况；
(3)待溶液分层后，置于自动离心装置内进行自动离心，自动离心装置的转速为3000 转/分，离心时间为12分钟，离心完成后收集上清液，完成一次萃取；
(4)用凝胶法鲎试剂检测(3)中所得上清液中内毒素含量，重复以上萃取步骤，直至内毒素含量小于50 EU/ μ g ；
(5)用无热原的注射用水透析(4)中所得上清液，透析时间20小时，透析去除残余的 TritonX-114。实施例2:
一种去除细菌荚膜多糖中内毒素的方法，它包括以下步骤
(1)在细菌荚膜多糖溶液中逐渐加入浓度为12%v/v的TritonX-114，直到混合溶液的终浓度为0. 8%v/v，搅拌混合25分钟；
(2)搅拌混合均勻后，置于60°C条件下，5分钟后观察分层情况；
(3)待溶液分层后，置于自动离心装置内进行自动离心，自动离心装置的转速为5000 转/分，离心时间为8分钟，离心完成后收集上清液，完成一次萃取；
(4)用凝胶法鲎试剂检测(3)中所得上清液中内毒素含量，重复以上萃取步骤，直至内毒素含量小于50 EU/ μ g ；
(5)用无热原的注射用水透析(4)中所得上清液，透析时间观小时，透析去除残余的 TritonX-114。实施例3:
一种去除细菌荚膜多糖中内毒素的方法，它包括以下步骤
(1)在细菌荚膜多糖溶液中逐渐加入浓度为10%v/v的TritonX-114，直到混合溶液的终浓度为1. 0%ν/ν，搅拌混合30分钟；
(2)搅拌混合均勻后，置于55°C条件下，10分钟后观察分层情况；
(3)待溶液分层后，置于自动离心装置内进行自动离心，自动离心装置的转速为4000 转/分，离心时间为10分钟，离心完成后收集上清液，完成一次萃取；
(4)用凝胶法鲎试剂检测(3)中所得上清液中内毒素含量，重复以上萃取步骤，直至内毒素含量小于50 EU/ μ g ；
(5)用无热原的注射用水透析(4)中所得上清液，透析时间M小时，透析去除残余的 TritonX-114。
权利要求
1. 一种去除细菌荚膜多糖中内毒素的方法，其特征在于它包括以下步骤(1)在细菌荚膜多糖溶液中逐渐加入浓度为8 12%v/v的TritonX-114，直到混合溶液的终浓度为0. 8 1. 2%v/v，搅拌混合25 35分钟；(2)搅拌混合均勻后，置于50 60°C条件下，5 15分钟后观察分层情况；(3)待溶液分层后，置于自动离心装置内进行自动离心，自动离心装置的转速为 3000 5000转/分，离心时间为8 12分钟，离心完成后收集上清液，完成一次萃取；(4)用凝胶法检测(3)中所得上清液中内毒素含量，重复以上萃取步骤，直至内毒素含量小于50 EU/ μ g ；(5)用无热原的注射用水透析(4)中所得上清液，透析时间20 28小时，透析去除残余的 TritonX-114。
全文摘要
本发明公开了一种去除细菌荚膜多糖中内毒素的方法，它包括以下步骤(1)在细菌荚膜多糖溶液中加入浓度为8～12%v/v的TritonX-114，直到终浓度为0.8～1.2%v/v；(2)混合后置于50～60℃下5～15分钟；(3)溶液分层后，在转速为3000～5000转/分的装置内离心，收集上清液，完成一次萃取；(4)用凝胶法检测上清液中内毒素含量，重复萃取，直至内毒素含量小于50EU/μg；(5)透析去除残余的TritonX-114。本发明提供一种去除细菌荚膜多糖中内毒素的方法，采用TritonX-114，具有萃取后细菌荚膜多糖中内毒素含量下降90%，荚膜多糖回收率在85%以上等优点。
文档编号A61P31/04GK102504042SQ201110365650
公开日2012年6月20日 申请日期2011年11月17日 优先权日2011年11月17日
发明者关晓峰, 吴强, 张丽莺, 李靖, 王子龙, 罗力心, 赵丹, 陈庚, 韩炼, 魏新 申请人:成都欧林生物科技股份有限公司