一种抑藻菌dh46的固定化方法及其应用的制作方法
【专利摘要】一种抑藻菌DH46的固定化方法及其应用，涉及一种抑藻菌。一株可高效抑有害赤潮藻塔玛压力山大藻的细菌为Alteromonas?addita?DH46，保藏编号为CCTCC?NO：M2010177。将制粒、清洗、煮沸、烘干的聚氨酯泡沫颗粒与培养基共同灭菌后，加入对数生长期的抑藻菌DH46，摇瓶培养，抑藻菌DH46吸附在颗粒内外表面，而形成抑藻菌DH46与聚氨酯泡沫颗粒高度、紧密结合的产物，完成聚氨酯泡沫颗粒固定抑藻菌。在完成聚氨酯泡沫固定抑藻菌后，通过反复挤压、清洗处理和煮沸，对聚氨酯泡沫回收利用。所述固定抑藻菌的聚氨酯泡沫可在赤潮控制中应用。
【专利说明】一种抑藻菌DH46的固定化方法及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种抑藻菌，尤其是涉及一种抑藻菌DH46的固定化方法及其应用。
【背景技术】
[0002]赤潮(Red tide)是指在一定的环境条件下，海水中的某些浮游植物、原生动物或细菌在短时间内突发性增加或高度聚集而导致水体变色的生态异常现象。大多数赤潮是无毒的，那些有毒或能导致危害的赤潮又被称为有害藻华(Harmful algal blooms,HAB)或有害赤潮(Harmful red tide)。塔玛亚历山大藻(Alexandrium tamarense)是一种全球分布的有毒涡鞭毛藻，由于是重要的赤潮原因生物，而且其具有的毒素经食物链传递后形成麻痹性贝毒对水域环境和人类健康都具有极大的危害。厦门海域常年有塔玛亚历山大藻赤潮爆发，因此急切需要有效的手段进行赤潮的调控。
[0003]治理赤潮常用的方法有物理法、化学法和生物法。由于物理法效果不好、费用高，而化学法又容易造成二次污染和生物累积，因此新兴的生物抑藻越来越受到人们的关注。海洋微藻在生长过程中会 不断向周围环境中释放多种代谢产物，这些产物统称为胞外产物(Extracellular products,ECPs)。以ECPs介导的藻间拮抗作用有可能是藻华种群演替的重要原因之一。有报道在35种不同微藻培养液的提取物中筛选杀藻化合物，Alteromonas分泌的生物活性物质对部分藻类生长有抑制作用。本 申请人:的实验组苏建强博士于2003年赤潮973项目MC2003-2航次从东海赤潮区采集到的海水样品中分离并筛选得到抑藻菌，前期研究表明该菌可通过间接抑藻方式，对于引发赤潮的部分藻类具有一定的杀灭作用。在进行细菌抑藻的过程中，细菌容易受到环境其他物质的影响不能很好的作用于藻细胞，从而杀藻效果受到影响。因此通过研究菌体的固定化技术对于有毒藻的控制有重要作用。
[0004]生物固定化技术(immobilized biotechnology)是从20世纪60年代开始迅速发展起来的一项新技术，它是通过利用物理或化学手段将游离细胞或酶定位于限定的空间区域，并使其保持活性和可以反复使用的一种基础技术。固定化微生物技术具有微生物密度高、反应迅速、微生物流失少、产物易分离以及反应过程易控制等优点(Y._H.Kangl, B.-R.Kim, H.J.Choi, et al.Enhancement of algicidal activityby immobilization of algicidal bacteria antagonistic to Stephanodiscushantzschii (Bacillariophyceae) [J].Applied Microbiology, 2007, 1983-1994)。结合课题需要及技术进展，我们期待将其应用于抑藻菌DH46，并有效的提高杀藻率。
[0005]按照固定化载体与作用方式的不同，可分为吸附法、包埋法、共价结合法、交联法四大类(Peilian Wei, Jie Chen, Yinghua Lu, et al.High density cultivation ofDictyostelium discoideum in a rotating polyurethane foam-bed bioreactor[J].World J Microbiol Biotechnol, 2010，26:1117 - 1123)。其中以包埋法研究最多，应用最广。另有截留固定法、自絮凝等。包埋法是将微生物细胞包埋在凝胶的微小空格内或埋于半透膜聚合物的超滤膜内。包埋法可分为凝胶包埋法和微胶囊法两种。此法简单，条件温和，稳定性好，包埋细胞容量高，是目前应用最广泛的固定化方法(徐新阳，张轶，李海波，等.污染地表水修复用微球菌的化学包埋法固定化工艺[J].东北大学学报，2006，27(10):1146—1148)。吸附法操作简单，微生物固定过程对细胞活性的影响小，但细胞与载体作用力小，抗冲击负荷相对较低，易脱落，所固定的微生物数目受所用载体的种类及其表面积的限制。复合固定化技术的方法多种多样，主要有吸附一包埋法，包埋一交联法，聚集一交联法以及三法合用的吸附一包埋一交联法等(曲洋，张培玉，郭沙沙，等.复合固定化法固定化微生物技术在污水生物处理中的研究应用[J].四川环境，2009, 28(3):78-84)。根据以上固定化方法的特征并结合本抑藻细菌的生理特点，故选用吸附法作为细菌固定化的研究方法。
[0006]聚氨酯泡沫(Polyurethane Foam, PUF)是吸附法固定化常用载体之一。它具有孔径与细胞尺相比较大，内外表面都能作为固定化吸附界面；空隙率高，便于传质；载体为化学惰性，对细胞不具毒害作用；可与培养基共同灭菌，培养结束后易于迅速获取细胞；处理方便，价格低廉，适合作为工业化固定化载体等特点(Ory, 1.d.，Romero, L.E., Cantero, D.0ptimization of immobilization conditions for vinegar production.Siran, wood chips and polyurethane foam as carriers for Acetobacter aceti[J].Process Biochemistry, 2004，39 (5):547-555 ；Hiroshi Kurosawa, KouichirouYasumoto, Tetsuhiro Kimura, et al., Polyurethane membrane as an efficientimmobilization carrie r for high-density culture of rat hepatocytes in thefixed-bed reactor[J].Biotechnology and bioengineering, 2000.70(2):160-166)。由于物理吸附对菌体伤害小，相对包埋法，微胶囊等固定化方法，聚氨醋泡沫固定化培养菌体可以使菌体保持较强的生命力作为固定化载体。关于聚氨酯泡沫固定化的研究近年来出现了很多，刘幽燕等(刘幽燕，李青云，覃益民，韦炳努，何勇强，童张法.聚氨酯泡沫固定化产碱杆菌细胞生物转化氰化物[J].环境科学，2006，27(3):586-589)利用聚氨酯泡沫为载体进行固定化降氰菌株，研究其转化特性。结果表明，采用吸附生长法能有效实现菌株DN25的固定，对于高浓度氰化物，固定化细胞具有明显优势，不仅可耐受更高浓度的氰化物转化，其转化速率也高于游离细胞，通过初步的摇瓶模拟序列批式反应，固定化细胞活性可保持20天。梁兴超等(梁兴超，卢英华，陈杰，徐志南.聚氨酯泡沫半固定化培养盘基网柄菌[J].生物加工过程，2007,5(2):52-56)以简单处理过的聚氨酯泡沫为载体，实现盘基网柄菌的固定化培养。他们考察了载体粒径大小、载体量和摇床转速等对固定化培养的影响，在优化的培养条件和固定化条件下，盘基网柄菌的最大细胞密度是悬浮培养的2-4倍，取得了满意的培养效果。
【发明内容】
[0007]本发明的第一目的是提供一株可高效抑有害赤潮藻塔玛压力山大藻的细菌。
[0008]本发明的第二目的是提供一种通过聚氨酯泡沫固定抑藻菌的方法。
[0009]本发明的第三目的是提供一种聚氨酯泡沫固定化后再次回收利用的方法。
[0010]本发明的第四目的是提供一种固定抑藻菌的聚氨酯泡沫在赤潮控制中的应用。
[0011]所述一株可高效抑有害赤潮藻塔玛压力山大藻的细菌为Alteromonas additaDH46(以下简称为抑藻菌DH46)，该菌已于2010年7月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2010177，保藏中心地址为:中国武汉武汉大学，邮编430072。[0012]所述通过聚氨酯泡沫固定抑藻菌的方法的具体步骤为:
[0013]将制粒、清洗、煮沸、烘干的聚氨酯泡沫颗粒与培养基共同灭菌后，加入对数生长期的抑藻菌DH46，摇瓶培养，抑藻菌DH46吸附在聚氨酯泡沫颗粒内外表面，而形成抑藻菌DH46与聚氨酯泡沫高度、紧密结合的产物，完成聚氨酯泡沫固定抑藻菌。
[0014]所述培养基可采用2216E液体培养基，所述2216E液体培养基的组成为蛋白胨5g，酵母提取物lg，磷酸高铁0.lg, pH7.6-7.8，陈海水定容到1L。
[0015]所述聚氨酯泡沫颗粒可采用边长为3-6mm的立方体聚氨酯泡沫颗粒；所述聚氨酯泡沫颗粒的添加量可为lg，所述抑藻菌DH46的接种量可为聚氨酯泡沫颗粒总质量的1%。
[0016]所述聚氨酯泡沫固定化后再次回收利用的方法如下:
[0017]在完成聚氨酯泡沫固定抑藻菌后，通过反复挤压、清洗处理和煮沸，对聚氨酯泡沫回收利用。
[0018]本发明的吸附载体采用聚氨酯泡沫，通过挤压洗脱法对聚氨酯泡沫固定抑藻菌DH46密度进行测定，聚氨酯泡沫固定化菌体后抑藻的添加量可为2g，它能吸附已生长的抑藻菌DH46细胞高于游离的菌体4倍以上，并且在实验室条件下模拟的赤潮藻单细胞塔玛亚历山大藻(Alexandrium tamarense)生长环境中，对该藻在4天内的杀藻率达到88.7%, 10天内杀藻率稳定在96%-99%。
[0019]将聚氨酯泡沫切成指定大小的方块,使用前经过沸水煮沸，以除去泡沫中含有可能对细胞有害的聚醚类物质，之后烘干。经过处理的聚氨酯泡沫，凭借它孔隙强吸附能力、无毒副污染、传质传能效果良好等特点，可以作为安全有效的吸附载体。聚氨酯泡沫在震荡中吸附游离抑藻菌DH46的同时，其表面也被`磨成近似球状，间接地增加其比表面积，也提高了其吸附能力。
[0020]聚氨酯泡沫的回收利用有助于资源的节约和环境的保护。用过的聚氨酯泡沫可通过反复挤压清洗、超声波清洗、去离子水清洗及煮沸后烘干的方法进行回收再利用，这也降低了使用成本，提高了该固定方法的经济效益。
[0021]本发明克服了在吸附过程中，由于固定化材料或者聚氨酯泡沫的密度、尺寸及固定化时间选择不当而造成细菌固定化效果不好的缺陷，以及游离海洋细菌实际应用价值不高的难题，提供一种不仅有效解决包埋法固定化细胞的缺点，而且以聚氨酯泡沫作为吸附载体，可有效持久使抑藻菌DH46表现高效杀藻活性的细胞固定化制备方法，并且将固定化的抑藻菌应用到赤潮的控制中去。
[0022]所述固定抑藻菌的聚氨酯泡沫可在赤潮控制中应用。
[0023]本发明的有益效果是，采用安全、环保、高效、低廉的固定化技术将抑藻菌DH46吸附在聚氨酯泡沫内壁或孔隙中生长，防止其流失，有效地提高杀藻率的同时，也为杀藻菌提供了一个相对稳定的生长环境，从而使其在实际赤潮治理中的应用性能显著提高。并且聚氨酯泡沫的回收利用，对于环境保护和经济发展都有一定的作用。
【专利附图】
【附图说明】
[0024]图1为固定化载体内菌体计数方法的比较(超声法和挤压法)。在图1中，横坐标是实验的次数，纵坐标是载体内的菌体密度(lO'ell/g) ;a是超声法，b是挤压法。
[0025]图2为抑藻菌DH46在聚氨酯泡沫固定化载体上的吸附情况。在图2中，横坐标是实验时间/min，纵坐标是吸附效率/%。
[0026]图3为聚氨酯泡沫载体尺寸对固定化培养的影响。在图3中，横坐标是PUF泡沫载体的大小/mm3，左纵坐标是细胞密度(10lclcell/g)，右纵坐标是细胞的固定比率/% ；a是细胞密度，b是细胞的固定比率。[0027]图4为不同尺寸的聚氨酯泡沫载体杀藻效果。在图4中，横坐标是PUF泡沫载体的大小/mm3，纵坐标是杀操率/100% ；a是PUF载体大小，b是杀操率。
[0028]图5为聚氨酯泡沫添加量对固定化培养抑藻菌DH46的影响。在图5中，横坐标是PUF泡沫载体的数量/g，左纵坐标是细胞密度(lO'ell/g)，右纵坐标是细胞的固定比率/% ；a是细胞密度，b是细胞的固定比率。
[0029]图6为不同添加量的聚氨酯泡沫载体对抑藻效果影响。在图6中，横坐标是横坐标是PUF泡沫载体的数量/g,纵坐标是杀藻率/100%。
[0030]图7为接种量对固定化培养的影响。在图7中，横坐标是菌体的接种量/%，左纵坐标是细胞密度(101(lcell/g)，右纵坐标是细胞的固定比率/%;a是细胞密度，b是细胞的固定比率。
[0031]图8为不同接种量对抑藻效果的影响。在图8中，横坐标是菌体的接种量/%，纵坐标是杀藻率/100%。
[0032]图9为固定化培养抑藻菌DH46的投加量对抑藻效果的影响。在图9中，横坐标是被PUF固定后的菌体加入量/g，纵坐标是杀藻率/100% ；a是处理6h，b是处理24h，c是处理 48h。
[0033]图10为PUF固定化细菌DH46的抑藻过程。在图10中，a:正常藻细胞；b:添加空白PUF的藻细胞；c、d:作用24h后的藻液；e、f:作用48h后的藻液。
[0034]图11为聚氨酯泡沫固定化抑藻菌DH46的扫描电镜图。在图11中，A、B空白泡沫载体，C、D培养24h的固定化载体，E、F培养48h的固定化载体。
[0035]图12为PUF固定化抑藻菌模拟实验的抑藻效果。在图12中，横坐标是实验时间/d,纵坐标是杀藻率/100%。
【具体实施方式】
[0036]1、抑藻菌DH46的活化和扩大培养
[0037]从斜面保存的抑藻菌DH46中挑取一接种环接入装有5mL2216E液体培养基(蛋白胨5g，酵母提取物lg，磷酸高铁0.lg，pH7.6-7.8，陈海水定容到1L)的试管中，摇床培养12-16小时。取ImL活化好的菌液接入IOOmL培养基中摇瓶培养，培养温度25°C，转速150r/mino
[0038]2、聚氨酯泡沫载体的前处理
[0039]将聚氨酯泡沫其剪成不同大小的立方体，使用前用去离子水清洗除杂质，沸水煮30min以上，60°C烘干至恒重，灭菌备用。
[0040]3、固定化载体内菌体计数方法比较
[0041]测定吸附固定化菌体生物量的方法主要有三种:干重法、超声法和挤压洗脱法。由于在固定化培养过程中聚氨酯泡沫因相互摩擦的剪切力作用会出现物理磨损，致使利用质量变化来考察生物量变得不准确，故舍弃该法，只比较超声法和挤压法对菌体计数的影响，每次平行比较重复3次操作。由图1可以看出由挤压洗脱法洗脱的PUF内的固定化细胞效果比较好，效率是超声法的3-4倍。连续挤压、洗脱两三次后，洗脱液内的菌体浓度以及较低，故选择挤压洗脱法作为测定固定化的抑藻菌菌体密度。
[0042]4、抑藻菌DH46在PUF上的固定化生长
[0043]将25mL预先培养好、菌体密度为3.0 X 108cell/mL的菌悬液加入到含有1.0g聚氨酯立方颗粒的250mL摇瓶中，28°C, 150r/min摇床转速下进行吸附实验,定时取样测定载体内外的菌体密度，计算吸附率。由图2可见，菌体在固定化载体上的吸附率先随吸附时间的增加而急剧升高，在120min达到57.8%的最高吸附率，吸附菌细胞数可达1.44X IO11ceIl/g,而后吸附率逐渐降低。经过360min左右载体内外菌体浓度变化不再明显，吸附率趋于稳定，即固定化载体上的吸附基本达到平衡。
[0044]5、影响固定化因子的考察
[0045]分别考察了聚氨酯泡沫载体尺寸、添加量、接种量对固定化培养的影响，见图3-8。通过将PUF切成5、10、15、20mm3大小的立方体，取1.0g聚氨酯泡沫置于装有50mL2216E液体培养基的250mL三角瓶中。发现5mm3立方体泡沫吸附的菌体密度最大，载细胞数达到了 5.4 X IOici Cel Ι/g，吸附效率为63.8%，固定化效果最好且杀藻率可达84.9%(图3和4)，故PUF载体体积确定为5mm3。通过分别添加0.5、1、1.5、2g添加量的PUF泡沫载体，来研究不同添加量的抑藻菌DH46的生长，结果证实添加量为Ig PUF时，固定化菌体密度和吸附率最大，分别为1.07X 10ncell/g和53.6%且抑藻率最高，为分别为87.4%(图5和6)。故确定PUF载体添加量为Igo按照不同比例(0.05%, 0.5%，1%，5%和10%)接入含有50ml培养基的250mL锥形瓶中，28°C，150r/min，培养24h，来检查最佳接种量。结果发现1%的菌体接种量可吸附3.7X1010cell/g的菌体，吸附率为69.8%，其抑藻效果亦较为明显，可去除89.1%的藻细胞数(图7和8)。择优选择1%的接种量。
[0046]6、PUF固定化的抑藻实验
[0047]根据已经确定的固定化条件，在250mL摇瓶中添加1.0g的5mm3PUF载体，接入1%初始菌体浓度为I-2X106cell/mL的抑藻菌DH46，在28°C，150r/min摇床转速下培养，取固定化颗粒进行抑藻测试。将培养24h的固定化有抑藻菌DH46细胞的PUF载体于风机下阴干20-24h，吸附有菌体的聚氨酯泡沫质量较之吸附前增加了 6-8倍。取风干后不同质量的固定化泡沫载体(0.5g、l.0g、2.0g)加入IOOmL处于稳定期生长的塔玛亚历山大藻液中(I-2X104cell/mL)，作用期间取样计数，观察抑藻效果。观测发现添加量为2.0g的实验组反应48h后抑藻率达到了 86.1%，随着作用时间逐渐延长，抑藻效果进一步增加，凝聚的藻细胞会进一步裂解、减少(图9)。通过显微镜直接镜检固定化的抑藻菌DH46对塔玛亚历山大藻的杀害过程，见图10。根据已经确定的固定化条件，在250mL摇瓶中添加
1.0g5mm3PUF立方状载体，接种抑藻菌DH46后在28°C，150r/min条件下培养24h和48h。取样测定载细胞数，并于扫描电镜下观察表面，见图11。结果显示，培养12h的固定化泡沫载体可吸附1.47X1010cell/g的菌细胞，24h吸附细胞数达5.26X 101Qcell/g，培养48h后随菌体衰亡及解吸附其固定化细胞有所下降，为2.44X 109cell/go游离培养24h后菌细胞密度为2.45X 108cell/mL，相同条件下1.0g固定化培养的PUF载体可载细胞1.05 X IO9ceIl/mL，较之游离培养方式细胞数提高了近4倍。扫描电镜下显示聚氨酯泡沫具有疏松多孔的特性，但孔径大小和粗糙程度各异，孔径与细胞尺寸相比较大，且内外表面都能作为固定化吸附的界面。菌细胞在固定化材质表面分布并不均匀，既有单个成簇存在，生长的后期结团积聚现象明显，泡沫表面和内部都吸附有菌体细胞。
[0048]7、固定化菌体的应用
[0049]为了实现聚氨酯泡沫吸附法固定化抑藻菌DH46的实际应用，将藻培养规模扩大至10L，按照PUF:藻液=2g: IL的比例进行抑藻实验。模拟实验的抑藻结果如图12。在实验室条件下模拟的单细胞赤潮藻塔玛亚历山大藻(Alexandrium tamarense)的生长环境，PUF固定化细菌作用于目标藻4d后抑藻率达到了 88.7%。连续观察检测10d，抑藻率稳定在96%-99%。
[0050]8、PUF的回收利用
[0051]使用过的聚氨酯泡沫可通过反复挤压清洗、超声波清洗、去离子水清洗及煮沸后烘干的方法进行回收再利用，这也降低了使用成本，提高了该固定方法的经济效益。
【权利要求】
1.一株可高效抑有害赤潮藻塔玛压力山大藻的细菌为Alteromonas addita DH46,该菌已于2010年7月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2010177，保藏中心地址为:中国武汉武汉大学，邮编430072。
2.通过聚氨酯泡沫固定抑藻菌的方法，其特征在于其具体步骤为: 将制粒、清洗、煮沸、烘干的聚氨酯泡沫颗粒与培养基共同灭菌后，加入对数生长期的Alteromonas addita DH46,摇瓶培养，Alteromonas addita DH46 吸附在聚氨酯泡沫颗粒内外表面，而形成Alteromonas addita DH46与聚氨酯泡沫高度、紧密结合的产物,完成聚氛酷泡沫固定 Alteromonas addita DH46。
3.如权利要求2所述通过聚氨酯泡沫固定抑藻菌的方法，其特征在于所述培养基采用2216E液体培养基，所述2216E液体培养基的组成为蛋白胨5g，酵母提取物lg，磷酸高铁0.lg, pH7.6-7.8，陈海水定容到1L。
4.如权利要求2所述通过聚氨酯泡沫固定抑藻菌的方法，其特征在于所述聚氨酯泡沫颗粒采用边长为3-6mm的立方体聚氨酯泡沫颗粒。
5.如权利要求2所述通过聚氨酯泡沫固定抑藻菌的方法，其特征在于所述聚氨酯泡沫颗粒的添加量为Ig,所述Alteromonas addita DH46的接种量为聚氨酯泡沫颗粒总质量的1%。
6.聚氨酯泡沫固定化后回收利用的方法，其特征在于其具体步骤如下: 在完成聚氨酯泡沫固定Alteromonas addita DH46后,通过反复挤压、清洗处理和煮沸，对聚氨酯泡沫回收利用。
7.固定抑藻菌的聚 氨酯泡沫在赤潮控制中的应用。
【文档编号】C12R1/01GK103451140SQ201310450603
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2013年9月27日 优先权日:2013年9月27日
【发明者】郑天凌, 李祎, 林婧, 李 东, 张化俊, 陈章然, 郑伟 申请人:厦门大学