一种中华绒螯蟹性早熟个体活体分子检测方法
【专利摘要】本发明公布了一种中华绒螯蟹性早熟个体活体分子检测方法。利用本发明提供的引物组从中华绒螯蟹组织中克隆到了EsEcR基因全长cDNA序列，以此基因序列为基础，本发明提供了一种检测中华绒螯蟹性早熟个体活体分子检测方法，本发明不仅提供了一种中华绒螯蟹性早熟个体的活体检测方法，而且对中华绒螯蟹性早熟个体的早期发现提供了重要的检测手段。
【专利说明】一种中华绒螯蟹性早熟个体活体分子检测方法
【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程领域，特别涉及一种中华绒螯蟹EsEcR基因克隆方法及以EsEcR基因为基础的中华绒螯蟹性早熟个体的活体分子检测方法。
【背景技术】
[0002]中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)属节肢动物门，甲壳纲,十足目，爬行亚目，短尾族，方蟹科，弓腿亚科，绒螫蟹属，俗称河蟹，广泛分布于我国东南部沿海的咸淡水或淡水水域中，其肉质鲜美，风味独特，河蟹是中国养殖产量最大的淡水蟹类。作为一种甲壳动物，河蟹的生长是通过蜕皮形式体现的。蜕皮即蜕去旧的外骨骼并长出新的外骨骼的过程，是甲壳动物最显著的生理特征。河蟹性成熟对脱壳有抑制作用，也就不再生长，脱壳次数直接决定了河蟹个体的规格，大规格河蟹的经济价值远高于小规格河蟹，但目前在河蟹养殖生产中，普遍存在着有20%-30%的河蟹性早熟现象，早熟河蟹个体很小，性腺已经成熟不再脱壳，也即不再生长，商品价值极低。性腺成熟程度可以通过性腺成熟指数(gonadosomaticindex, GSI)直观反应，要获得性腺指数必须通过解剖称重性腺，无法活体检测。
[0003]ife兑皮激素受体(ecdysteroid receptor, ECR)是动物核受体(nuclear receptor)超家族成员之一，主要在无脊椎动物中发现。RXR具有重要的生物学功能，与维甲酸X受体(RXR, retinoid x receptor)作用形成异源二聚体，脱皮激素进入细胞内与之结合形成有功能的形式从而调控下游一系列蜕皮相关的基因的表达，最终触发动物的蜕皮反应。RXR-ECR异源二聚体是甲壳类等蜕皮分子信号途径必不可少的关键节点。
[0004]目前，有几种奸蟹类EcR基因已被克隆，包括:Marsupenaeus japonicas、Fenneropenaeus chinensis>Crangon crangon等，而中华绒螯蟹的EcR基因(这里命名为:EsEcR)还未见报道。`
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于为了克服现有技术的不足而提供一种中华绒螯蟹性早熟个体活体分子检测方法。
[0006]我们利用RACE(rapid-amplification of cDNA ends)克隆技术克隆了中华绒螯蟹的EcR基因全长cDNA，通过定量PCR分析发现性早熟个体中EcR基因的表达量显著低于正常个体，只有正常个体表达量的27% (P < 0.001)，该结果可应用于河蟹性早熟个体的活体分子检测。
[0007]本发明是通过以下技术手段实现的:
[0008]一种中华绒螯蟹EsEcR基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1或SEQ ID N0.2所示。
[0009]一种用于PCR扩增以上所述的中华绒螯蟹EsEcR基因的引物组，由如下引物组成:
[0010]3'正向外引物3aEsEcR-Fl:序列如SEQ ID N0.3所示；
[0011]3'正向内引物3aEsEcR-F2:序列如SEQ ID N0.4所示；[0012] 5'反向外引物5aEsEcR-Rl:序列如SEQ ID N0.5所示；
[0013]5'反向内引物5aEsEcR_R2:序列如SEQ ID N0.6所示。
[0014]一种扩增以上所述的中华绒螯蟹EsEcR基因的方法，其特征在于，包括如下步骤:
[0015]步骤1:获得中华绒螯蟹组织的总RNA ；
[0016]步骤2:从GenBank中华绒螯蟹核酸数据库中筛选到一个EcR基因同源序列，作为中间序列，以此序列作为模板，设计扩增EsECR基因的3’和5’端片段的特异性引物组；
[0017]步骤3:以步骤I所得总RNA反转录产物为模板，分别以SEQ N0.3和4所示的引物、和SEQ N0.5和SEQ ID N0.6所示的引物对模板的3’端和5’端进行巢式两轮PCR扩增，得到中华绒螯蟹EsEcR基因的3'和5'端片段；
[0018]步骤4:将步骤2中所述中间序列、步骤3中所述中华绒螯蟹EsEcR基因的3'和5'端片段拼接，即得扩增后的中华绒螯蟹EsEcR基因。
[0019]以上所述的扩增中华绒螯蟹EsEcR基因的方法，其中3’端和5’端进行巢式两轮PCR 扩增的 3’端第一轮 PCR 扩增的条件为 94°C,3min ；94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 2min，20 个循环；72°C, 1Omin ;4°C保存。
[0020]以上所述的扩增中华绒螯蟹EsEcR基因的方法，其中3’端和5’端进行巢式两轮PCR 扩增的 3’端第二轮 PCR 扩增的条件为 94°C,3min ；94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 2min，30 个循环；72°C, 1Omin。
[0021]以上所述的扩增中华绒螯蟹EsEcR基因的方法，其中3’端和5’端进行巢式两轮PCR 扩增的 5’端第一轮 PCR 扩增的条件为 94°C,3min ；94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 2min，20 个循环；72°C, IOmin ;4°C保存。
[0022]以上所述的扩增中华绒螯蟹EsEcR基因的方法，其中3’端和5’端进行巢式两轮PCR 扩增的 5’端第二轮 PCR 扩增的条件为 94°C,3min ；94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 2min，25 个循环；72°C, IOmin0
[0023]对所得序列用NCBI网站进行blastx在线分析,与EsEcR序列一致性(Sequencesproducing significant alignments)最高的前100个序列都是EcR的同源蛋白(e〈lX 10_144)，其中前16个序列分别来自于9种不同的虾蟹类:Uca pugilator (召潮蟹)、Scylla paramamosain (拟穴青蟹)、Homarus americanus (美洲海鳌虫下)、Callinectessapidus (蓝蟹)、Portunus trituberculatus (三抚梭子蟹)、Crangon crangon (褐虫下)、Gecarcinus lateralis (地蟹)Marsupenaeus japonicus (日本囊对虫下)和 Carcinus maenas(普通滨蟹)的EcR (包括不同的可变剪切体)，显著性检验达到极大(e=0)，可以确定所得序列为中华绒螯蟹EcR基因。中华绒螯蟹EsEcR基因推测的氨基酸序列具有典型的EcR核受体序列特征，包括N端DNA结合结构域(DNA binding domain, DBD), C端配体结合结构域(ligand binding domain, LBD)。
[0024]通过对中华绒螯蟹EsEcR，包括两种可变剪切体EsEcR-L和EsEcR-S所编码的氨基酸序列与其他物种EcR氨基酸序列利用Clustalxl.81软件进行序列比对分析和使用MEGA3.1软件构建NJ系统发育树(如图1)，由系统发育树可见，甲壳类EcR聚类在一个大的分支上。
[0025]以克隆到的EsEcR基因序列为基础，本发明还提供了一种用于PCR检测以EsEcR基因为基础的中华绒螯蟹性早熟个体的特定引物组，其由如下引物组成:[0026]正向引物preco-EsEcR-F:序列如 SEQ ID N0.7 所不；
[0027]反向引物preco-EsEcR-R:序列如 SEQ ID N0.8 所不。
[0028]以克隆到的EsEcR基因序列为基础，本发明还提供了一种以EsEcR基因为基础的中华绒螯蟹性早熟个体的活体分子检测方法，包括如下步骤:
[0029]步骤1:获得中华绒螯蟹幼蟹肌肉组织的总RNA并反转录；
[0030]步骤2:以步骤I所得总反转录产物为模板，以如上所述的特定引物组为引物，通过定量PCR扩增获得EsEcR基因的相对表达水平；
[0031]步骤3:以性腺成熟指数小于1%的中华绒螯蟹蟹个体为正常个体，当检测个体EsEcR基因表达水平低于正常个体50%时，确定为中华绒螯蟹性早熟个体。
[0032]本发明利用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、嵌套聚合酶链式反应(nested-PCR)、3 '端 cDNA 快速扩增(3 ' RACE)以及 5 '端 cDNA 快速扩增(5 ' RACE)的方法，对中华绒螯蟹EsEcR基因进行了研究，首次从中华绒螯蟹中克隆到了 EsEcR基因全长cDNA序列，并对其所编码的EsEcR的序列特征、同源性及进化地位进行了分析，确定其为EsEcR 基因。、
[0033]以获得的EsEcR基因为基础，用定量PCR方法研究了性早熟个体和正常个体EsEcR基因表达水平的差异，发现性早熟个体中EcR基因的表达量显著低于正常个体，只有正常个体表达量的27%(p < 0.001)，以该结果为基础建立了一种河蟹性早熟个体的活体分子检测方法。
【专利附图】
【附图说明】
`[0034]图1是不同种类的动物EcR核受体的NJ系统进化树；
[0035]图2是中华绒螯蟹性早熟个体与正常个体EsEcR基因表达水平的差异。
【具体实施方式】
[0036]下面结合实施例，进一步阐述本发明。
[0037]本发明中中华绒螯蟹由无锡太湖渔民提供，试剂均可由市场购得，RNA纯化等试剂购自美国Promega公司等，3' RACE和V RACE试剂盒购自宝生物(大连)有限公司(Takara)0
[0038]扩增中华绒螯蟹EsEcR基因的方法，包括如下步骤:
[0039]( I)总 RNA 提取:
[0040]取IOOmg中华绒螯蟹组织在研钵中加液氮研磨,用Trizol法提取总RNA, Trizol试剂采用Invitrogen公司，提取方法根据使用说明书。
[0041](2)中华绒螯蟹EsEcR基因全长cDNA序列的克隆:
[0042]从GenBank中华绒螯蟹核酸数据库中筛选到一个217bp的EcR基因同源序列(GenBank accession number: JR736395.1),以此序列作为中间序列，设计扩增EsEcR基因的3'端和5'端片段的特异性引物组，用于3'端和5'端快速扩增:
[0043](a)EsEcR基因cDNA3/端快速扩增(3/ RACE):
[0044]根据EsEcR基因部分序列，设计特异性3'正向外引物3aEsEcR_Fl和3'正向内引物3aEsEcR-F2，其中，3'正向外引物3aEsEcR-Fl与3' RACE试剂盒中提供的3' RACEOuter Primer组成引物对进行第一轮PCR扩增，对扩增产物用3'正向内引物3aEsEcR_F2和:V RACE Inner Primer进行第二轮PCR扩增，获得中华绒螯蟹EsEcR基因的3’端片段；
[0045]3aEsEcR-Fl:5/ TTCTTTGATATTGCACCACATTTTAG3' (SEQ ID N0.3)
[0046]3aEsEcR-F2:5/ GTAACTACGGTGCCGACTCCTAC3' (SEQ ID N0.4)
[0047]3' RACE Outer Primer:5/ TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT3' (SEQ ID N0.9)
[0048]3 ' RACE Inner Primer:5 ' CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG3 ' (SEQIDN0.10)
[0049](b)反转录:
[0050]按照3' RACE试剂盒中的使用说明书进行，获得3'反转录液，反应体系如下:
[0051]
Total RNAI μ§
3fRACE Adaptor (5 μΜ)I μL
5XM-M LV Buffer2 pL
dNTP Mixture (10 mM each)I μ?
RNase Inhibitor (40 U/pL)0.25 μ?
Reverse Transcriptasc M-MLV (RNase H-) (200 U/pL)0.25 |iL
RNasc Free dH20up 1 10 μ?
[0052]反应条件为:42°C，60min；70°C，15min ；-20°C，保存。
[0053]第一轮PCR:
[0054]扩增反应体系如下:
[0055]
3*反料?液0.6μΙ.1xcDNADilLilion EiuiTcrII2.4uL
3aEsEcR-Fl (10 μΜ)0.6μΙ
3,RACE Outer Primer (10 μΜ)0.6μ?
IOxLA PCR Buffer II (Mg2— Free)1.2μ?
MgCl2 (25 mM)0.9μ￡
TaKaRa LA Taq (5 U/pL)0.1 μΕ
dH?0up to 15pL
[0056]第一轮PCR 反应条件为:94°C，3min ；94°C 30s，55°C 30s, 72 °C 2min，20 个循环；72°C, IOmin ;4°C保存。
[0057]第二轮 PCR:
[0058]扩增反应体系如下:[0059]
【权利要求】
1.一种中华绒螯蟹EsEcR基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1或SEQ IDN0.2所示。
2.一种用于PCR扩增如权利要求1所述的中华绒螯蟹EsEcR基因的引物组，其特征在于，由如下引物组成: 3'正向外引物3aEsEcR-Fl:序列如SEQ ID N0.3所示； 3'正向内引物3aEsEcR-F2:序列如SEQ ID N0.4所示； 5'反向外引物5aEsEcR-Rl:序列如SEQ ID N0.5所示； 5'反向内引物5aEsEcR-R2:序列如SEQ ID N0.6所示。
3.一种扩增如权利要求1所述的中华绒螯蟹EsEcR基因的方法，其特征在于，包括如下步骤: 步骤1:获得中华绒螯蟹组织的总RNA ； 步骤2:从GenBank中华绒螯蟹核酸数据库中筛选到一个EcR基因同源序列，作为中间序列，以此序列作为模板，设计扩增EsECR基因的3’和5’端片段的特异性引物组； 步骤3:以步骤I所得总RNA反转录产物为模板，分别以SEQ N0.3和4所示的引物、和SEQ N0.5和SEQ ID N0.6所示的引物对模板的3’端和5’端进行巢式两轮PCR扩增，得到中华绒螯蟹EsEcR基因的3'和5'端片段； 步骤4:将步骤2中所述中间序列、步骤3中所述中华绒螯蟹EsEcR基因的3'和5'端片段拼接，即得扩增后的中华绒螯蟹EsEcR基因。
4.根据权利要求3所述的扩增`中华绒螯蟹EsEcR基因的方法，其特征在于，3’端和5’端进行巢式两轮PCR扩增的3’端第一轮PCR扩增的条件为94°C，3min ；94°C 30s, 55°C30s, 72°C 2min，20 个循环；72°C，10 min ;4°C保存。
5.根据权利要求3所述的扩增中华绒螯蟹EsEcR基因的方法，其特征在于，3’端和5’端进行巢式两轮PCR扩增的3’端第二轮PCR扩增的条件为94°C，3min ；94°C 30s, 55°C30s, 72°C 2min，30 个循环；72°C，10 min。
6.根据权利要求3所述的扩增中华绒螯蟹EsEcR基因的方法，其特征在于，3’端和5’端进行巢式两轮PCR扩增的5’端第一轮PCR扩增的条件为94°C，3 min ；94°C 3 Os, 55°C30s, 72°C 2min，20 个循环；72°C，10 min ;4°C保存。
7.根据权利要求3所述的扩增中华绒螯蟹EsEcR基因的方法，其特征在于，3’端和5’端进行巢式两轮PCR扩增的5’端第二轮PCR扩增的条件为94°C，3min ；94°C 30s, 55°C30s, 72°C 2min，25 个循环；72°C，10 min。
8.一种用于PCR检测以EsEcR基因为基础的中华绒螯蟹性早熟个体的特定引物组，其特征在于，其由如下引物组成: 正向引物preco-EsEcR-F:序列如SEQ ID N0.7所示； 反向引物preco-EsEcR-R:序列如SEQ ID N0.8所示。
9.一种以EsEcR基因为基础的中华绒螯蟹性早熟个体的活体分子检测方法，其特征在于，包括如下步骤: 步骤1:获得中华绒螯蟹幼蟹肌肉组织的总RNA并反转录； 步骤2:以步骤I所得总反转录产物为模板，以如权利要求8所述的特定引物组为引物，通过定量PCR扩增获得EsEcR基因的相对表达水平；步骤3:以性腺成熟指数小于1%的中华绒螯蟹蟹个体为正常个体，当检测个体EsEcR基因表达水平低于正常个体50`%时，确定为中华绒螯蟹性早熟个体。
【文档编号】C12N15/12GK103555727SQ201310478940
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年10月14日 优先权日:2013年10月14日
【发明者】沈怀舜, 周鑫 申请人:中国水产科学研究院淡水渔业研究中心