一种半滑舌鳎性别特异scar标记及应用方法
【专利摘要】本发明首先提供一种半滑舌鳎性别特异微卫星标记，包括有位于Z染色体上的微卫星标记，其核苷酸序列为SEQ?ID?NO:1。本发明还提供从上述微卫星标记设计的引物，其上、下游引物序列分别为SEQ?ID?NO:2和SEQ?ID?NO:3。本发明筛选到一种半滑舌鳎性别特异微卫星标记，并进行了其SCAR转化，设计了SCAR标记的引物用于半滑舌鳎遗传性别鉴定，能够快速、准确、有效的区分半滑舌鳎雌性、雄性和超雌个体。由于该标记具有在雌雄中都可扩增出目的条带并可以用琼脂糖电泳分辨的特点，明显缩短了准确鉴定半滑舌鳎遗传性别的时间，可在半滑舌鳎养殖场现场进行半滑舌鳎遗传性别的批量化鉴定，节约了检测成本，并提高了在养殖场现场检测半滑舌鳎遗传性别的工作效率和准确率。
【专利说明】—种半滑舌鳎性别特异SCAR标记及应用方法
【技术领域】
[0001]本发明属于水产生物技术中的鱼类遗传性别鉴定和性别控制【技术领域】，具体涉及一种半滑舌鳎性别特异SCAR标记及其在遗传性别快速鉴定中的应用。
【背景技术】
[0002]半滑舌鳎(Cynoglossus semiIaevis)是我国特有的近海温水性大型底栖鱼类,分布于以黄、渤海为主的我国沿海地区。半滑舌鳎肉质细嫩、味道鲜美、营养丰富，具有广阔的养殖前景，是重要的名贵海水养殖鱼类。
[0003]生产实践表明，半滑舌鳎雌、雄鱼生长速度差异巨大，雌性的生长速度是雄性的2-4倍。半滑舌鳎雄鱼生长慢、个体小的特点，降低了半滑舌鳎的养殖产量，增加了养殖成本，制约了半滑舌鳎养殖产业的可持续发展。因此，筛选半滑舌鳎性别特异标记，建立遗传性别鉴定的快速方法，进行半滑舌鳎性别控制，提高半滑舌鳎养殖群体的雌性比例，乃至研制出全雌苗种，是进一步推动半滑舌鳎养殖业可持续发展的有效途径。而实用有效的半滑舌鳎性别鉴定标记，则是实现这一目标的必要工具。
[0004]半滑舌鳎性别决定系统为ZZ/ZW型，即雄性为ZZ，雌性为ZW，具有异形的W染色体(周丽青等，2005)。半滑舌鳎可产生Z型精子和Z型、W型两种细胞。在自然条件下，得到正常的ZZ雄性和ZW雌性后代。通过人工雌核发育诱导，可产生ZZ雄鱼和Wff超雌鱼，理论上，超雌鱼是培育全雌苗种的必要条件。因此，鉴定ZZ雄鱼、ZW雌鱼和Wff超雌鱼的快速有效手段，具有重要的科学意义和应用价值。
[0005]在半滑舌鳎性别特异分子标记筛选和遗传性别鉴定方面，黄海水产研究所已经先后筛选到半滑舌鳎雌性特异AFLP标记(Chen et al.，2007)和性别连锁微卫星标记(Chenet al.，2012)。但是在实际应用中，这两种标记都有自身的不足。AFLP标记由于其显性的遗传特性，不能区分ZW雌性和Wff超雌个体，且在实际鉴定中有可能会出现由于假阴性，而对ZZ雄和ZW雌产生误判。而共显性的微卫星性别特异标记虽然可以准确鉴定ZZ雄、ZW雌和Wff超雌个体，但由于其两条DNA片段条带之间差异较小，无法用琼脂糖凝胶电泳分辨，只能通过分辨力更高的聚丙烯酰胺凝胶(PAGE胶)电泳的方法进行鉴别，而PAGE胶电泳的操作难度大、操作时间长、对实验设备和试剂等要求高、增加了遗传性别鉴定的成本、难度以及耗费的时间，难以在半滑舌鳎养殖场进行现场检测。因此，半滑舌鳎性别控制研究和高雌性苗种生产还需要一种能采用琼脂糖电泳方法准确分辨、能在养殖场现场应用的遗传性别快速鉴定的分子技术。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种半滑舌鳎性别特异性SCAR标记及其应用方法，即一种半滑舌鳎性别特异的微卫星SCAR标记，并建立一种能够在半滑舌鳎养殖场通过琼脂糖电泳的方法，快速准确鉴定出半滑舌鳎ZZ雄鱼、Zff雌鱼和Wff超雌鱼的分子方法。
[0007]本发明首先提供一种半滑舌鳎性别特异微卫星标记，位于Z染色体上，全长169bp,其序列为:CCTAAATGATGGATGTAGATTCTGTCCTTGTTGCCTGTTGTTCTTACTCAGACCAGGCCTGCATGGGTGTATGTGTGTGTGCGTGTGTGTGTGCGTGTGTGTGCGCGCACGTGCATGTTCTGTGCTGATGTCCTTGTATAGTCAGGCCTGGGTTTATTTTCTCTGGATC (SEQ ID NO:1)。
[0008]上述微卫星标记还包括与SEQ ID NO:1相对应的W染色体上的序列。
[0009]本发明还提供一对SCAR标记引物，是基于SEQ ID NO:1的微卫星标记设计的，可以通过琼脂糖凝胶电泳清晰分辨雌、雄特异DNA片段，鉴定雌雄遗传性别，其中上、下游引物序列分别为:
[0010]5' -CCTAAATGATGGATGTAGATTCTGTC-3' ；SEQ ID NO:2
[0011]5' -GATCCAGAGAAAATAAACCCAGG-3' ；SEQ ID NO:3
[0012]将上述SCAR标记引物用于半滑舌鳎遗传性别快速鉴定，其步骤包括半滑舌鳎基因组DNA的提取、微卫星序列的PCR扩增、扩增产物的琼脂糖电泳检测。其特征为在雄性个体中扩增出一种大小为169bp的DNA片段；在雌性个体中扩增出两种大小分别为169bp和134bp的DNA片段；在超雌个体中扩增出一种大小为134bp的DNA片段。
[0013]本发明筛选到一种半滑舌鳎性别特异微卫星标记，根据其在Z染色体和W染色体上35bp的差别，设计SCAR标记引物进行半滑舌鳎遗传性别鉴定，快速、准确、有效区分半滑舌鳎雌性、雄性和超雌个体。由于该标记在雌雄中都可扩增出目的条带并可以用琼脂糖电泳分辨的特点，明显缩短了准确鉴定半滑舌鳎遗传性别的时间，可以在半滑舌鳎养殖场现场进行半滑舌鳎遗传性别的批量化鉴定，节约了检测成本，并提高了在养殖场现场检测半滑舌鳎遗传性别的工作效率和可操作性。本发明对半滑舌鳎超雌鱼的鉴定和筛选、伪雄鱼的鉴定和筛选及高雌性养殖 群体的规模化生产与养殖，对于提高养殖产量和经济效益、推动半滑舌鳎养殖业持续健康发展等都具有重要意义和产业应用价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1:本发明1%琼脂糖浓度电泳结果图，1-8泳道分别为Marker，ZW雌性个体X 3，ZZ雄性个体X 3，Marker ；
[0015]图2:本发明2%琼脂糖浓度电泳结果图，1-8泳道分别为Marker，ZW雌性个体X 3，ZZ雄性个体X 3，Marker ；
[0016]图3:本发明4%琼脂糖浓度电泳结果图，1-8泳道分别为Marker，ZW雌性个体X 3，ZZ雄性个体X 3，Marker ；
[0017]图4:本发明在性别鉴定中的实际效果图，1-14泳道分别为Marker，ZW雌性个体X 6，ZZ雄性个体X 6，Marker ；
[0018]图5:本发明在超雌个体鉴定中的应用，1-14泳道分别为Marker，Wff型超雌个体X 4，Zff型雌性个体X 4，ZZ型雄性个体X 4，Marker ；
[0019]其中电泳图片的泳道都是从左至右排列的。
【具体实施方式】
[0020]下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细的说明。
[0021]一、半滑舌鳎性别特异微卫星标记的筛选
[0022]本发明所用的微卫星标记序列来源于中国水产科学研究院黄海水产研究所水产基因组与细胞工程研究室完成的半滑舌鳎全基因组测序，随后从3000个微卫星位点中筛选到的159个性别特异微卫星标记。其中含有122个Type B型位点(雌性一条带，雄性没有带)和37个Type A型位点(雌性两条带,雄性一条带)。
[0023]取经鉴定的已知性别的雌、雄半滑舌鳎DNA样品各4个，对37个Type A型位点采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法进行基因分型，以分辨雌雄条带差异。其中一个A 型标记对应的引物为 5 ' -GTTGTGACCTTGTCTCTCAAAGTGT-3 ' (SEQ ID NO:4)和
-GCACAGCTGTAACCTTCGAGC-3' (SEQ ID NO:5)引物，从聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果可以看出，这个微卫星标记的雌雄差异最大。
[0024]二、半滑舌鳎性别特异微卫星标记的SCAR转化及SCAR引物的设计
[0025]I半滑舌鳎性别特异微卫星标记的电泳分离与回收:取已知性别的半滑舌鳎雌、雄鱼DNA，以SEQ ID N0:4、5为引物，进行50 μ L反应体系PCR，其中双蒸水33.7 μ L ;dNTP2.7 μ L ；10XBuffer5.4μ L ;rTap 酶 0.5μ L ;上下游引物各 2μ L ;模板 DNA3.7μ L。涡旋、离心使其充分混匀，进行PCR扩增，扩增程序为95°C 10分钟，随后进行变性(95°C 30秒)、复性(57.50C 30秒)、延伸(72°C 30秒)35个循环，72°C延伸10分钟，4°C保存。扩增产物进行1%琼脂糖电泳，将目的条带用刀片切下，使用胶回收试剂盒回收。
[0026]2选定标记雌雄条带的克隆
[0027]将回收的PCR产物连接到PMD18-T载体，转化至感受态细胞中，培养后挑取阳性克隆，送至测序公司测序。根据测序结果，获得了 Z染色体特异的SCAR标记序列，比其在W染色体上的相对应片段大35bp。
[0028]3.SCAR标记引物的设计
[0029]通过微卫星标记的分离、回收和测序，从而将所选性别特异微卫星标记转化为SCAR标记，进而设计了 SCAR标记的引物SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:3。采用SEQ ID NO:2和SEQ ID NO: 3引物可从ZZ雄鱼基因组DNA中扩增出169bp的DNA条带，从ZW雌鱼基因组DNA中扩增出169bp和134bp的2条DNA条带，其中134bp的DNA条带位于W染色体上。
[0030]4.PCR扩增产物电泳条件的建立
[0031]使用序列为SEQ ID N0:2和SEQ ID NO:3的SCAR标记引物进行PCR扩增，反应体系 15yL，其中 IOXbufferl.5 μ L、dNTP0.8 μ L、上下游引物各 0.6 μ L、模板 DNAl μ L、CldH2OlL 3 μ L，最后加入rTaq酶0.2 μ L。反应程序为95°C 10分钟，95°C变性、54°C复性、72°C延伸35个循环，72°C 10分钟，4°C保存。
[0032]已知较大的琼脂糖浓度更易于分辨小片段DNA的微小差别。在同一电泳条件下(150V, 15min),设置琼脂糖浓度梯度，摸索可以分辨35bp差别DNA片段的适宜琼脂糖浓度。将摸索梯度设为1%、2%和4%，上样量为10 μ L，结果如图1、图2、图3所示。经验证，在4%浓度下，可以清晰区分两种DNA片段，进而分辨遗传性别。
[0033]三、SCAR标记的应用
[0034]1.实验室条件下半滑舌鳎遗传性别鉴定
[0035]使用SCAR标记引物和常规方法,检测半滑舌鳎遗传性别。PCR反应体系15 μ L,其中 IOXbufferl.5 μ L、dNTP0.8 μ L、上下游引物各 0.6 μ L、模板 DNAl μ L (50ng/yL)、ddH2011.3 μ L，最后加入rTaq酶0.2 μ L。反应程序为95。。10分钟，95°C变性、54°C复性、72°C延伸35个循环，72°C 10分钟，4°C保存。[0036]加入6 X Loading Buffer3 μ L,4%琼脂糖电泳，150V, 15分钟,凝胶成像仪下记录鉴定结果。可清晰分辩ZW雌性含有169bp和134bp两种DNA条带，ZZ雌性仅有169bp条带，如图4所示。
[0037]2.Wff超雌个体的鉴定
[0038]鉴定方法与上述实验室常规性别鉴定方法相同，所得结果超雌个体仅能得到134bp的DNA条带。如图5所示。
[0039]3.养殖场条件下的现场性别鉴定
[0040]为获得半滑舌鳎高雌性比例养殖群体，在亲鱼培育和苗种繁育过程中，剔除ZW型伪雄性亲鱼、筛选出ZZ型优质雄性亲鱼，对于提高半滑舌鳎苗种中的生理雌鱼比例至关重要。而在筛选过程中，要求快速、准确、一一对应，以保证在鉴定出优质雄鱼的同时，尽可能减少对亲鱼的损伤。这就要求亲鱼的遗传性别鉴定工作必须在半滑舌鳎养殖场现场进行。
[0041]3.1现场鉴定的准备
[0042]准备实验仪器PCR仪、离心机、电泳仪、电泳槽、水浴锅、稳压器、微波炉、凝胶成像
仪以及实验所需各种试剂、工具、耗材。在养殖场布置好实验室。
[0043]3.2待鉴定亲鱼鳍条的采集
[0044]提前准备好编号的离心管和标签二者编号一一对应。在亲鱼养殖车间，逐条现场采集少量待鉴定亲鱼的鳍条，放置于编号离心管中。将采过鳍条的亲鱼放入圆柱形塑料袋中，加入海水和和氧气，二者比例为1: 2，密封后贴上与离心管对应的标签，置于避光阴凉处暂时保存。
[0045]3.3基因组DNA的提取
[0046]在每个装有鳍条的离心管中加入500 μ L裂解液和15 μ L蛋白酶K，55°C水浴裂解I小时，期间轻摇数次以加速裂解。将裂解好的离心管取出，加入500μ L酚:氯仿:异戊醇，颠倒轻摇lOmin，12000转离心lOmin，取上清液450 μ L加入提前准备好对应编号装有500 μ L酒精的离心管中，轻摇30次，12000转离心5min，可见白色DNA沉淀于离心管底部。倒掉离心管中的液体，将DNA沉淀晾干，加入100 μ LddH2O,涡旋两次使DNA充分溶解。
[0047]3.4待测亲鱼DNA的PCR扩增和检测
[0048]采用性别鉴定SCAR标记对提取的基因组DNA进行PCR扩增，PCR反应体系为 15yL，包括 IOXbufferL 5 μ L、dNTP0.8 μ L、上下游引物各 0.6 μ L、模板 DNAl μ L、CldH2OlL 3 μ L，最后加入rTaq酶0.2 μ L。反应程序为95°C 10分钟，95°C变性、54°C复性、72°C延伸35个循环，72 °C 10分钟后冷却。
[0049]加入6 X Loading Buffer3 μ L,4%琼脂糖电泳，150V, 15分钟,在凝胶成像仪下观察。记录个编号对应反应结果，出现I条DNA带的鱼为ZZ型优质雄性亲鱼，可用于高雌比例苗种的繁育，出现两条DNA带的鱼为ZW型伪雄鱼，应该淘汰。
[0050]根据所得鉴定结果，将车间里暂时保存的亲鱼分类，并放回相对应的养殖池中。整个过程耗时6小时左右，可保证检测亲鱼的存活和接下来的正常繁殖。
[0051]本发明的SCAR标记引物已在山东海阳黄海水产有限公司和山东昌邑三新水产苗业试验场等单位用于半滑舌鳎优质雄性亲鱼筛选，通过筛选优质雄性亲鱼从而将半滑舌鳎苗种的生理雌鱼比例提高了 20%左右，产生了显著的经济和社会效益。
【权利要求】
1.一种半滑舌鳎性别特异微卫星标记，其特征在于，所述的微卫星标记的核苷酸序列为 SEQ ID NO:1。
2.权利要求1所述的微卫星标记在检测半滑舌鳎遗传性别中的应用。
3.一种用于检测半滑舌鳎遗传性别的SCAR标记引物，所述的SCAR标记引物是从权利要求I所述的微卫星标记上设计的。
4.如权利要求3所述的SCAR标记引物，其特征在于，所述的引物的上、下游引物序列分别为 SEQ ID NO:2, SEQ ID N0:3。
5.如权利要求4所述的引物在鉴定半滑舌鳎遗传性别中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的引物在雄性个体中扩增出一种大小为169bp的DNA片段；在雌性个体中扩增出大小分别为169bp和134bp的2个DNA片段；在超雌个体中扩增出一种大小 为134bp的DNA片段。
【文档编号】C12Q1/68GK103525814SQ201310517382
【公开日】2014年1月22日 申请日期:2013年10月28日 优先权日:2013年10月28日
【发明者】陈松林, 刘洋, 高峰涛, 孟亮, 邵长伟, 宋文涛 申请人:中国水产科学研究院黄海水产研究所