一种石油污染土壤中饱和烃降解基因AlkB含量测定的方法
【专利摘要】本发明提供了一种石油污染土壤中饱和烃降解基因AlkB含量测定的方法，以石油污染土壤中含量最高的饱和烃为目标降解组分，采用非培养的分子生物学技术实时荧光定量PCR对饱和烃降解基因AlkB进行定量。方法主要包括土壤中DNA的提取，设计特异性扩增饱和烃降解基因的简并引物，确定PCR条件，制作荧光定量PCR标准曲线，样品测定。本发明所述方法是一种能够检测饱和烃生物降解活性的新型方法，同时能准确反映微生物的降解代谢途径和区域石油污染状况，在油田污染监测和治理方面有重要的应用价值。
【专利说明】—种石油污染土壤中饱和烃降解基因AIkB含量测定的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于环境石油污染监测领域，具体地说是一种石油污染土壤中饱和烃降解基因AlkB含量的测定方法。
【背景技术】
[0002]石油是推动社会发展的重要能源，但是每年全世界约有I X 109t石油及其产品在
石油开采、炼制、贮运、使用以及各种泄露事故中进入地下水、地表水和土壤，其中我国占60多万吨，直接造成我国面积500万公顷土壤受石油污染，石油组分中的饱和烃组分能够破坏土壤的结构，且含量大，具有一定毒性，给当地带来植物减产、粮食安全隐患、生态环境破坏等一系列严重问题。
[0003]绿色经济高效的生物降解石油途径引起了国内许多学者研究和倡导，但是传统微生物筛选培养的方法只能分离占石油降解菌总数的1%~10%的微生物种类，根本无法体现微生物的真实降解水平和反映土壤中微生物多样性及分布。此外，编码代谢饱和烃的术端单加氧化酶和细胞色素P450虽已有很多研究和报道，但是他们在引物设计上往往受到降解菌类型的限制，合成的代谢酶不能代表大部分的降解菌所含的基因类型。
[0004]近十年兴起的分子生物学技术实时荧光定量PCR技术(RT-qPCR)能避免传统平板培养方式的弊端，直接对提取的土壤微生物总DNA进行分析，通过荧光染料和目标DNA在延伸过程结合所产生的荧光信号的强度，对关键的石油烃生物降解基因拷贝数进行定量测定，在国内外微生物种群的多样性和群落分布监测分析上有重要的应用。该技术在石油降解基因特异性扩增所需引物的合成上，对大部分能降解石油烃的菌株序列进行比对，设计同源性较高的石油烃降解基因扩增引物。此外，实时荧光定量PCR技术不用专门设计检测探针，具有比其他分析技术如杂交和克隆更加简便、经济、准确。
【发明内容】
[0005]本发明的目在于提供一种石油污染土壤中饱和烃降解基因AlkB含量的测定方法，可以对降解微生物的饱和烃烃代谢途径和降解活性进行准确检测，又能反映土壤石油污染程度。
[0006]本发明的技术方案:
[0007]一种石油污染土壤中饱和烃降解基因AlkB含量的测定方法，主要步骤如下:
[0008]I)采集石油污染O~20cm表层土壤进行_20°C保存，按照ZR Soil Microbe DNAMiniPrep? 土壤DNA提取试剂盒步骤进行DNA提取。
[0009]2)引物设计遵循引物设计原则，从土壤中能降解石油烃的菌株序列中比对设计同源性较高的饱和烃降解基因扩增引物alkBf/alkBr，见下表。
[0010]
【权利要求】
1.一种石油污染土壤中饱和烃降解基因AlkB含量的测定方法，其特征在于步骤如下: 1)采集石油污染O~20cm表层土壤进行-20°c保存，按照ZRSoil Microbe DNAMiniPrep? 土壤DNA提取试剂盒步骤进行DNA提取。 2)引物设计遵循引物设计原则，从土壤中能降解石油烃的菌株序列中比对设计同源性较高的饱和烃降解基因扩增引物alkBf/alkBr，见下表。
2.根据权利要求1所述的石油污染土壤中饱和烃降解基因AlkB含量的测定方法，其特征在于=AlkB降解基因PCR退火温度范围为50~52°C。
3.根据权利要求1所述的石油污染土壤中饱和烃降解基因AlkB含量的测定方法，其特征在于=AlkB降解基因PCR的最适变性温度为84°C。
4.根据权利要求1所述的石油污染土壤中饱和烃降解基因AlkB含量的测定方法，其特征在于:定量PCR温度设计为:95°C保持5min ;经过以下40个周期=AlkB降解基因变性温度为84°C，保持5s，退火温度为50°C，保持60s，后经过72°C的延伸30s。熔解曲线温度:50°C保持5s，然后升到95°C (增量为0.5°`C )。
【文档编号】C12Q1/68GK103882105SQ201310552671
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2013年11月7日 优先权日:2013年11月7日
【发明者】刘庆龙, 唐景春, 朱文英, 张海荣, 孙克静, 张凯 申请人:南开大学