拟穴青蟹抗真菌型抗脂多糖因子及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种拟穴青蟹抗真菌型抗脂多糖因子SpALF4及其制备方法与应用，该抗脂多糖因子的基因序列为SEQ?ID?NO1，其氨基酸序列为SEQ?ID?NO2。通过构建拟穴青蟹抗脂多糖因子SpALF4的重组表达载体，将重组表达载体导入宿主细胞，并诱导宿主细胞表达，获得含SpALF4的表达产物，经分离纯化后，获得重组蛋白，即SpALF4。所述抗真菌型抗脂多糖因子SpALF4蛋白不但对多种水生动物细菌具有明显的抑制作用，可以应用于水产动物抗微生物新药和抗病原微生物饲料添加剂，且对高等哺乳动物的真菌病原如白色念珠球菌也具有明显抑制效果，可用于高等哺乳动物抗真菌药物的开发。
【专利说明】拟穴青蟹抗真菌型抗脂多糖因子及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种水产甲壳动物抗真菌型抗菌肽，尤其涉及到一种拟穴青蟹抗真菌型抗脂多糖因子及其制备方法与应用。
【背景技术】
[0002]抗脂多糖因子(Ant1-lipopolysaccharide factor, ALF)首次发现于當体内，因该因子具有抗凝血作用，能够抑制细菌脂多糖(LPS)引发的凝集反应，故命名为抗脂多糖因子。最早发现的鲎LALF对R-型革兰氏阴性菌具有强烈的抑制作用。随后对ALF的分子结构进一步研究表明，ALF对LPS具有高亲和力，能够结合LPS类脂A并中和其生物学活性。此外，研究表明，ALF对于抵抗内毒素血症和内毒素休克具有重要的治疗作用。目前，多种甲壳动物ALF在对虾、螯虾、蟹等动物体内相继被鉴定。研究显示，在受到不同病原或病原分子模式刺激时，该类分子在转录水平上呈现不同的上调表达模式，并且通过表达或合成的ALF蛋白常具有广谱的抗微生物活性，对革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌、真菌及WSSV等具有不同程度的杀灭或抑制作用。由此表明，ALF是动物体内重要的免疫效应因子。因而对来源于不同动物不同类型类的ALF进行功能研究，鉴定其各自特异的抗微生物功能，能进一步揭示甲壳动物抗感染免疫的机理，丰富抗感染免疫理论；同时，研究结果亦有利于新型抗微生物药物或饲料添加剂的开发，为甲壳类乃至高等动物疾病的防治提供新的防治方法。
[0003]跟据FAO统计结果，目前全世界甲壳动物(虾蟹为主)的产值占到整个水产产值的近1/4，而甲壳动物每年因疾病造成的损失为5-10%。针对我国虾蟹养殖面临严峻疾病威胁的挑战，要实现虾蟹健康养殖和生态养殖的目的，开展虾蟹免疫系统及其功能研究，挖掘具有重要免疫功能的免疫效应因子(如抗菌肽)替代目前大量使用化学药品治疗疾病的方法，成为目前一个可行且有效地控制疾病的方法。拟穴青蟹Scylla paramamosain是我国乃至世界重要的海水经济蟹类。
【发明内容】
[0004]本发明的提供了一种拟穴青蟹抗真菌型抗脂多糖因子SpALF4的成熟肽，其氨基酸序列如SEQ ID N0:6所示。
[0005]本发明还提供了一种编码基因，其编码如SEQ ID N0:6所示的氨基酸序列。
[0006]本发明还提供了一种拟穴青蟹抗真菌型抗脂多糖因子SpALF4的全长氨基酸，其序列如SEQ ID N0:2所示。
[0007]本发明还提供了一种拟穴青蟹抗真菌型抗脂多糖因子SpALF4的全长cDNA，其碱基序列如SEQ ID NO:1所示。
[0008]本发明还提供了一种拟穴青蟹抗真菌型抗脂多糖因子SpALF4的制备方法，其特征在于包括以下步骤:
[0009](a)根据成熟肽序列SEQ ID NO: 6，设计引物扩增成熟肽序列片段；[0010](b)构建拟穴青蟹抗脂多糖因子SpALF4的重组表达载体；
[0011](c)将步骤(b)所获得重组表达载体导入宿主细胞，并诱导宿主细胞表达，获得含SpALF4的表达产物；
[0012](d)将步骤(C)所获得表达产物经分离纯化后，获取重组蛋白，即SpALF4。
[0013]本发明还提供了拟穴青蟹抗真菌型抗脂多糖因子SpALF4在制备抗真菌药物中的应用。
[0014]本发明还提供了拟穴青蟹抗真菌型抗脂多糖因子SpALF4在制备动物抗病原微生物饲料添加剂中的应用。
[0015]本发明在鉴定出拟穴青蟹的抗真菌型抗脂多糖因子SpALF4的基础上，根据获得的SpALF4序列成功构建了重组表达载体并在大肠杆菌Rosetta (DE3)中表达，最后通过亲和柱纯化获得重组蛋白SpALF4,该重组蛋白对真菌白色念珠球菌Candida albicans和多种革兰氏阴性和阳性病原菌具有明显的抑制和杀伤作用，因此，SpALF4在抗微生物感染新药和新型抗病饲料添加剂的开发方面具有非常诱人的应用前景。
[0016]附图简要说明
[0017]图1为PGEX-4T-1载体双酶切前后电泳图谱。I为酶切前电泳条带；2为酶切后电泳条带；M为DNA Marker。
[0018]图2为扩增SpALF4成熟肽对应DNA序列全长。M为DNA Marker, I为扩增片段。
[0019]图3为含pGEX-4T-l/SpALF4重组表达系统诱导前、诱导后及纯化SpALF4的蛋白电泳图谱。I为诱导前大肠杆`菌Rosetta(DE3)蛋白表达情况；2为诱导后大肠杆菌Rosetta(DE3)蛋白表达情况；3为纯化后SpALF4蛋白样品；M为蛋白Marker。
【具体实施方式】:
[0020]以下通过实施例结合附图详细说明本发明的技术方案。
[0021]实施例1:拟穴青蟹抗真菌型抗脂多糖因子SpALF4全长cDNA序列的获得
[0022]提取拟穴青蟹血细胞和肝胰腺混合组织样品总RNA，经检测符合要求后，由上海南方基因中心利用二代测序技术进行RNA样品的转录组测序及数据分析，获得了大量基因的cDNA序列。利用在线生物信息学在线软件blastx对序列其中一个全长756bp序列分析，发现该序列与据库Genbank中ALF家族基因相似性最高，其中与三疣梭子蟹PtALF5的同源性高达72%，表明该序列为存在于拟穴青蟹体内的ALF家族的新成员，命名为SpALF4，其核苷
酸序列及由其推导出的氨基酸序列如下所示。
[0023]
【权利要求】
1.一种拟穴青蟹抗真菌型抗脂多糖因子SpALF4成熟肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。
2.一种编码基因，其编码权利要求1所述的成熟肽。
3.一种拟穴青蟹抗真菌型抗脂多糖因子SpALF4全长氨基酸，其序列如SEQ ID N0:2所/Jn ο
4.一种拟穴青蟹抗真菌型抗脂多糖因子SpALF4的全长cDNA，其碱基序列如SEQ IDNO:1所示。
5.拟穴青蟹抗真菌型抗脂多糖因子SpALF4的制备方法，其特征在于包括以下步骤: (a)根据成熟肽序列SEQID N0:6，设计引物扩增成熟肽序列片段； (b)构建拟穴青蟹抗脂多糖因子SpALF4的重组表达载体； (c)将步骤(b)所获得重组表达载体导入宿主细胞，并诱导宿主细胞表达，获得含SpALF4的表达产物；及 (d)将步骤(c)所获得表达产物经分离纯化后，获取重组蛋白，即SpALF4。
6.如权利要求5所述的制备方法，其中，在步骤(b)中，所述表达载体选用PGEX-4T-1；步骤(C)中，所述宿主菌为大肠杆菌Rosetta (DE3)。
7.如权利要求5或6所述的制备方法，其中，获得所述成熟肽序列包括如下步骤:对拟穴青蟹血细胞和肝胰腺组织混样`进行转录组测序，并对测定序列进行数据分析，通过与已有ALF家族比对，得到拟穴青蟹的抗真菌型抗脂多糖因子的cDNA序列SEQ ID NO: 1，确定其开放阅读框SEQ ID N0:5，编码SpALF4蛋白序列SEQ ID NO: 2，并推测其中的成熟肽序列SEQ ID NO:6。
8.拟穴青蟹抗真菌型抗脂多糖因子SpALF4在制备抗真菌药物中的应用。
9.如权利要求8所示应用，其中所述真菌为白色念珠球菌。
10.拟穴青蟹抗真菌型抗脂多糖因子SpALF4在制备动物抗病原微生物饲料添加剂中的应用。
【文档编号】C12N15/12GK103601795SQ201310552464
【公开日】2014年2月26日 申请日期:2013年11月8日 优先权日:2013年11月8日
【发明者】李新苍, 房文红, 周俊芳, 仉晓文, 朱磊 申请人:中国水产科学研究院东海水产研究所