抗病促生的绿针假单胞菌剂的制备方法与用途
【专利摘要】本发明公开了一种抗病促生的绿针假单胞菌剂的制备方法与用途；该菌株为绿针假单胞菌(Psedunomonas?chlororaphis)HT66CCTCC?NO：M2013467。该菌株的主要代谢产物为吩嗪-1-羧酸和吩嗪-1-甲酰胺。将该菌株接种到微生物培养基中，经过发酵后获得高浓度的菌体与代谢产物，可与粉末活性炭、皂土、膨润土、高岭土、硅藻土、沸石和碳酸钙等材料混合而制备成微生物菌剂，成品中活菌数量为1～8.5×109cfu／mL。通过平板实验证实，所述菌剂对水稻纹枯病、棉花枯萎病、小麦全蚀病菌、西瓜枯萎病的病原菌具有良好的防治效果，同时对部分植物的生长还具有良好的促进作用。
【专利说明】抗病促生的绿针假单胞菌剂的制备方法与用途
【技术领域】
[0001]本发明属于生物农药和生物肥料领域，涉及防病促生的微生物制剂的制备方法及应用；具体涉及一种抗病促生的绿针假单胞菌剂的制备方法与用途。
【背景技术】
[0002]联合国粮农组织的研究结果表明，农作物病虫害自然损失率在37%以上，严重影响粮食安全和环境生态的安全。据调查，我国常见农作物的病害生物达1600种，每年造成近1000亿人民币的损失，严重地阻碍了我国农业的发展。目前，由于农业生产中各种化学农药的大量使用，很多种类的病虫害已经对这类药物产生了严重的耐药性，导致防治效果不断降低。据报道，十年来我国爆发的病虫害种类增加一倍以上。同时，一些农药不同程度地残留在土壤、植物和水体中，对人体健康造成了潜在的威胁。我国许多农副产品出口国外时，常常因为农药残留超标而遭遇国外的“绿色壁垒”封杀，每年的损失高达百亿美元，引起了全社会的广泛关注。
[0003]在农作物浸染性病害中，主要有真菌性病害、细菌性病害、病毒性病害和线虫病害等。其中，真菌病害是目前已知植物病害中种类最多的病害，约占病害种类的80%-90% ；且真菌病害可以出现在植物的各个部位，症状类型也最多。
[0004]水稻纹枯病又称云纹病，俗名花足杆、烂脚瘟、眉目斑。是由立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)感染得病，多在高温、高湿条件下发生。在亚洲、美洲、非洲种植水稻的国家普遍发生。我国各稻区均有分布，但在南方稻区为害最严重，引起结实率和千粒重显著降低，甚至植株例伏枯死，是当前水稻生产上的主要病害之一。由于发生面积广、流行频率高，其所致损失往往超过稻瘟病。
[0005]西瓜枯萎病又称蔓割病、萎凋病，其病原为镰刀菌(Fusarium oxysporum f.sp.niveum)，属于半知菌类的真菌，归属于丛梗孢目，瘤座孢科在土壤中存活时间可达10年之久。西瓜自幼苗期到成株期均可发病，但发病的高峰时期是开花座果期。近年来，我国西瓜枯萎病发生严重，造成西瓜大量减产，一般病田减产30 %~40 %，重病田则可减产80 %以上甚至绝收，给西瓜生产造成严重的经济损失。
[0006]终极腐霉(Pythium ultimum Trow)最初从英国腐败的水疗幼苗上分离出，目前报道分布甚广，它不仅栖息在土壤中，还广泛侵染大豆、菜豆、豌豆、甘薯、松苗、咖啡、苹果、柑橘、桃、棉花、菊花、大丽花、南瓜、西瓜、甘蔗、苜蓿、番茄等150余种经济植物，引起苗枯，猝倒、根腐、脚腐、枯萎等多种病害。
[0007]植物根际促生细菌(plantgrowth-promoting rhizobacteria, PGPR)是一群定植于植物根际、与植物根密切相关的根际细菌。大量温室和大田试验结果表明，许多PGPR菌株在温室、大田条件下表现出明显的促进植物生长、防治土传病害、提高植物对非生物胁迫的抗逆性、促进土壤生物修复等效果。PGPR是根治作物连作障碍(重茬病)的有效途径之
O
[0008]假单胞菌是一类广泛分布于自然界中的革兰氏阴性细菌，也是植物根际的常见微生物种群。许多假单胞菌能产生铁载体、抗生素、胞外水解酶和氢氰酸等代谢产物，保护植物免受病原微生物的侵害，诱导植物抗性，同时它也能分泌吲哚类的化合物，促进植物生长。作为植物根际促生细菌，假单胞菌被全世界的科学家广泛研究。假单胞菌产生的抗生素种类很多，包括硝吡咯菌素(prorolnitrin,Prn)，吩嗪-1-羧酸(phenazine-1-carboxylicacid, PCA)，2，4_ 二乙酰藤黄酌.(2, 4-diacetylphloroglucinol, DAPG)，藤黄绿菌素(pyoluteorin,Plt),绿脓菌素(pyocyanin, PYO),脂多肽等。吩嗪类化合物可以作为电子载体，消耗细胞里面的NAD(P)H等还原性物质，同时产生活性氧(reactive oxygen species,ROS)，使靶细胞中毒死亡。因此吩嗪类化合物具有广谱的抗真菌活性，而且不易产生耐药性。由此可见，在大力发展高效、低毒的化学农药的同时，筛选和应用能分泌吩嗪类化合物的假单胞菌用于农作物真菌性病害的防治是一条经济的、有利于农业生产可持续发展的有效途径。
【发明内容】
[0009]本发明的目的在于克服上述现有技术中防治植物真菌性病害的化学农药生产过程污染严重，在土壤、水体和农作物中残留量高，以及日益严重的耐药性等问题，提供一种抗病促生的绿针假单胞菌剂的制备方法与用途。本发明提供了一种能同时防治多种植物病原性真菌并促进植物生长的微生物菌株——绿针假单胞菌HT66 (Psedunomonaschlororaphis),并利用该菌株制备微生物菌剂，以及利用该菌株防治水稻纹枯病、西瓜枯萎病、甜菜菊斑枯萎病等植物病害。
[0010]为实现上述目的，发明人首次分离纯化到一株产绿色色素的假单胞菌HT66，对其16S rDNA进行PCR克隆并测序，分析其进化关系，结果表明该菌与绿针假单胞菌的相似度为99%。经过全细胞脂肪酸分析并与MIDI公司的Sherlock数据库比对，该菌与环境样品中绿针假单胞菌的相似度SI为0.343。
[0011]所述的绿针假单胞菌HT66在固体琼脂培养基上生长时，菌落圆形，边缘整齐且规贝1J，表面湿润、光滑；在其生长的I~2天，菌落呈现土黄色，在第3~4天，菌落表面会出现较多深绿色的物质。
[0012]所述的绿针假单胞菌HT66在液体培养2天后，菌液比较浓稠，且呈现明显的土黄色；静置过夜后，发酵液的底层会出现大量的绿色沉淀。经分离纯化和鉴定，该沉淀为吩嗪-1-羧酸和吩嗪-1-酰胺的混合物。
[0013]本发明的目的是通过以下技术方案来实现的:
[0014]第一方面，本发明涉及一种绿针假单胞菌HT66 (Psedunomonas chlororaphisHT66) CCTCC N0:M2013467。
[0015]优选地，所述绿针假单胞菌的16S rDNA的部分序列如SEQ ID N0.1所示。
[0016]进一步优选地，绿针假单胞菌的所述16S rDNA的部分序列是以细菌的通用引物27F和1429R进行PCR扩增后经测序获得的，其中27F和1429R的序列分别如SEQ ID N0.2和 SEQ ID N0.3 所示。
[0017] 优选地，所述绿针假单胞菌的主要代谢产物为吩嗪-1-羧酸(phenazine-1-carboxylic acid, CAS 号为 2538-68-3,简称 PCA)和吩嚷-1-甲酸胺(Phenazine-1-carboxamide, CAS 号为 550-89-0,简称 PCN)。[0018]优选地，所述绿针假单胞菌可平板抑制植物病原真菌中的立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、尖抱键刀菌(Fusarium oxysporum f.sp.niveum)、终极腐霉(Pythium ultimum Trow)和舌甘叶菊壳针抱(Septoria steviae Ishiba Yokoyama et Tani)。
[0019]第二方面，本发明涉及一种抗病促生的绿针假单胞菌剂，以微生物培养基为原料，绿针假单胞菌 HT66 (Psedunomonas chlororaphis HT66) CCTCC N0:M2013467 经细胞扩大培养后制备而得。
[0020]优选地，所述菌剂的载体为粉末活性炭、皂土、膨润土、高岭土、硅藻土、沸石、碳酸钙中的一种或几种。
[0021]第三方面，本发明涉及一种上述的抗病促生的绿针假单胞菌剂在制备生物农药中的用途。
[0022]优选地，所述生物农药为防治水稻纹枯病、西瓜枯萎病、甜叶菊斑枯病或大豆、菜豆、豌豆、甘薯、松苗、咖啡、苹果、柑橘、桃、棉花、菊花、大丽花、南瓜、西瓜、甘鹿、苜猜、番茄作物的根腐病的生物农药。
[0023]第四方面，本发明涉及一种上述的抗病促生的绿针假单胞菌剂在制备微生物肥料中的用途。
[0024]与现有的技术相比，本发明具有如下有益效果:
[0025]1、用于生物防治的假单胞菌有荧光假单胞菌、铜绿假单胞菌、恶臭假单胞菌、施氏假单胞菌和绿针假单胞菌等种类；除了铜绿假单胞菌和绿针假单胞菌外，其余的假单胞菌均不能产生吩嗪类化合物，因此其生防机理也不同；进一步，与铜绿假单胞菌相比，绿针假单胞菌至今未有致病性的报道，因此其环境友好，安全可靠。
[0026]2、本发明中使用的绿针假单胞菌，其野生株液体培养时吩嗪-1-甲酰胺浓度高达420mg/L,为目前国际上吩嗪-1-甲酰胺产量最高的野生菌株，因此其生防功能强大。
[0027]3、本发明菌剂的开发成本低:绿针假单胞菌的营养需求不高，稳定性较好，加工菌剂选用的载体和助剂价格低廉，生产工艺简单易行。
[0028]4、本发明的菌剂能有效防治水稻纹枯病、小麦全蚀病菌、西瓜枯萎病、棉花枯萎病
等真菌性病害。
【专利附图】
【附图说明】
[0029]通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显:
[0030]图1为绿针假单胞菌HT66的固体琼脂平板培养特性示意图；
[0031]图2为绿针假单胞菌HT66的进化树分析示意图；
[0032]图3绿针假单胞菌HT66代谢产物的液相色谱图；
[0033]图4为绿针假单胞菌HT66的抗菌实验图片，其中，左上图为水稻纹枯病原菌，右上图为甜叶菊斑枯病菌，左下图为终极腐霉，右下图为西瓜枯萎病菌。
【具体实施方式】
[0034] 下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。
[0035]本发明的绿针假单胞菌HT66 (Psedunomonas chlororaphis HT66),该菌株已在中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)保藏，保藏单位地址为:中国.武汉.武汉大学，邮编为:430072，保藏日期为:2013年10月12日，保藏编号为=CCTCC N0:M2013467o
[0036]实施例1
[0037]一、绿针假单胞菌HT66的获得与鉴定
[0038]首先在放干水的水稻田中选取一株生长旺盛、无任何可见病变的水稻植株，去除水稻杆莖部分及5cm厚的表层土，以无菌药勺挖取根际土样；称取I克土样，置于装有50mLKMB培养基的250mL三角瓶中，并在其中加入氨苄青霉素(终浓度为50 μ g/mL)、氯霉素(终浓度为15 μ g/mL)以及放线菌酮(终浓度为100 μ g/mL)减少土壤中真菌的污染。接着将三角瓶置于转速为200rpm的摇床上28°C振荡培养2h ;取样，稀释1000倍后涂布在含有相同抗生素的固体KMB平板上，将获得的单菌落以异步培养法进行抗水稻纹枯病原菌的实验，获得的最高抗菌活性菌株即为绿针假单胞菌HT66，见图1。
[0039]图1为绿针假单胞菌HT66的固体琼脂平板培养特性示意图。菌株HT66在KMB固体培养基上生长12小时后形成乳白色的菌落，直径为1.5_左右，圆形，表面凸起，光滑，较粘稠，易挑起，边缘整齐；随着培养时间的延长，菌落逐渐变成黄色；在显微镜下观察，细菌呈现杆状，0.3 μ m-0.7 μ mX 1.0 μ m-1.2 μ m,革兰氏染色阴性，无芽孢。24小时后，菌落表面逐渐出现绿色晶体，即为吩嗪-1-羧酸和吩嗪-1-甲酰胺的混合物。
[0040]将菌株HT66在KMB培养基中培养到对数生长末期，以细菌基因组DNA快速提取试剂盒(上海捷瑞生物工程有限公司产品)抽提其基因组DNA。以该基因组样品为模板，使用细菌的 16s rDNA 通用引物 27F(5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’)和 1429R(5’-TACGGHTACCTTGTTACGACTT-3’)进行PCR实验，扩增后经测序获得的16s rDNA序列，如SEQ ID N0.1所示。将该序列在NCBI的核酸数据库中进行Blast分析，结果显示与HT66高度同源的微生物绝大部分均为假单胞菌属，选择前15个物种，下载其16S rDNA序列，用MEGA5软件构建进化树。图2为菌株HT66的进化树分析示意图。由图2可知，菌株HT66与绿针假单胞菌GP72同源的置信度为93，因此初步证明该菌为一株绿针假单胞菌。
[0041]二、绿针假单胞菌HT66的全细胞脂肪酸分析
[0042]使用四区划线法，把已充分活化过的HT66菌株接种到KMB平板上，24h后使用接种环收集第三区域的菌体约40mg。通过皂化，甲基化，正己烷萃取和碱洗涤获得HT66的全细胞脂肪酸的提取样品，然后使用MIDI公司的微生物自动鉴定系统分析脂肪酸的组成。接着使用协方差矩阵分析，主成分分析和模式识别分析技术，将气相色谱的分析结果与MIDI公司临床微生物数据库和环境微生物数据库相比对，结果如表1所示。
[0043]表1.Sherlock MIS微生物自动鉴定系统报告
[0044]
【权利要求】
1.一种绿针假单胞菌 HT66 (Psedunomonas chlororaphis HT66) CCTCC NO:M2013467。
2.如权利要求1所述的绿针假单胞菌，其特征在于，所述绿针假单胞菌的16SrDNA的部分序列如SEQ ID N0.1所示。
3.如权利要求2所述的绿针假单胞菌，其特征在于，绿针假单胞菌的所述16SrDNA的部分序列是以细菌的通用引物27F和1429R进行PCR扩增后经测序获得的，其中27F和1429R的序列分别如SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.3所示。
4.如权利要求1所述的绿针假单胞菌，其特征在于，所述绿针假单胞菌的主要代谢产物为吩嗪-1-羧酸和吩嗪-1-甲酰胺；所述吩嗪-1-羧酸的CAS号为2538-68-3，所述吩嗪-1-甲酰胺的CAS号为550-89-0。
5.如权利要求1所述的绿针假单胞菌，其特征在于，所述绿针假单胞菌可平板抑制植物病原真菌中的立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、尖抱键刀菌(Fusarium oxysporumf.sp.niveum)、终极腐霉(Pythiumultimum Trow)和甜叶菊壳针抱(Septoria steviae IshibaYokoyama et Tani)。
6.一种抗病促生的绿针假单胞菌剂，其特征在于，以微生物培养基为原料，绿针假单胞菌 HT66 (Psedunomonas chlororaphis HT66) CCTCC NO:M2013467 经细胞扩大培养后制备而得。
7.如权利要求6所述的抗病促生的绿针假单胞菌剂，其特征在于，所述菌剂的载体为粉末活性炭、皂土、膨润土、高岭土、硅藻土、沸石、碳酸钙中的一种或几种。
8.—种如权利要求6所述的抗病促生的绿针假单胞菌剂在制备生物农药中的用途。
9.如权利要求8所述的抗病促生的绿针假单胞菌剂在制备生物农药中的用途，其特征在于，所述生物农药为防治水稻纹枯病、西瓜枯萎病、甜叶菊斑枯病或大豆、菜豆、豌豆、甘薯、松苗、咖啡、苹果、柑橘、桃、棉花、菊花、大丽花、南瓜、西瓜、甘蔗、苜蓿、番茄作物的根腐病的生物农药。
10.一种如权利要求7所述的抗病促生的绿针假单胞菌剂在制备微生物肥料中的用途。
【文档编号】C12N1/20GK104017744SQ201310552337
【公开日】2014年9月3日 申请日期:2013年11月7日 优先权日:2013年11月7日
【发明者】彭华松, 张平原, 张雪洪, 王威, 胡洪波 申请人:上海交通大学