一种具有胰脂肪酶抑制作用的儿茶素氧化聚合物的制备工艺的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种具有胰脂肪酶抑制作用的儿茶素氧化聚合物的制备工艺，采用生物体外酶催化氧化模型，模拟茶叶发酵时发生的催化氧化反应，制备具有胰脂肪酶抑制作用的儿茶素氧化聚合物，包括以下步骤：儿茶素溶液的制备、梨汁混悬液的制备、儿茶素氧化聚合物的制备、儿茶素氧化聚合物的精制。本发明的反应速度易于人工控制，儿茶素氧化聚合物也易于检测，具有较强的实践应用价值及市场前景。
【专利说明】一种具有胰脂肪酶抑制作用的儿茶素氧化聚合物的制备工
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种聚合物的制备工艺，具体涉及采用生物体外酶催化氧化模型，模拟茶叶发酵时发生的催化氧化反应，制备具有胰脂肪酶抑制作用的儿茶素氧化聚合物的制备工艺。
【背景技术】
[0002]近年来随着生活水平的提高，饮食结构以及生活习惯的变化，肥胖人群数量不断增加，并且呈上升趋势。目前，肥胖是人类最容易被忽视，但发病率却急剧上升的一种慢性疾病，它与许多疾病的发生发展具有密切的相关性，如脑卒中、II型糖尿病、高血压病、冠心病等。肥胖的根本原因是脂肪在体内积累过多，肥胖症是营养代谢障碍性疾病，目前大部分肥胖的发生是由于机体营养过剩而导致能量摄入大于能量消耗而形成的单纯性肥胖，其临床特征是脂肪细胞的增多和体积的增大。研究表明，肥胖症及其引起的多种疾病都伴随着脂肪代谢及脂肪细胞功能的障碍。肥胖人群的脂肪代谢特点是血浆游离脂肪酸升高，胆固醇、甘油三酯、总脂等血脂成分普遍增高，机体对游离脂肪酸的动员利用减少，血中的游离脂肪酸积累，血脂容量升高。因此，如何干预防止脂肪在体内的过度积累和脂肪细胞的变化是预防和治疗肥胖症的关键。脂肪酶抑制剂作为一种控制肠道脂肪吸收的药物，可以有效的控制脂肪过度摄取，预防肥胖症，因此以天然产物为原料研发具有安全、高效的脂肪酶抑制剂类医药保健品具有良好的市场和开发前景。茶叶作为我国的传统保健饮料有着三千多年的饮用历史，其植物来源茶的叶片中主要化学成分是以表没食子儿茶素没食子酸酯(简称EGCg)为代表的一类儿茶素类化合物，是茶的主要生物活性成分。近年来多项研究表明，经过发酵处理的乌龙茶以及红茶所含有的多酚类提取物对脂肪酶有着良好的抑制活性，可以有效的控制脂肪吸收，这类成分主要是儿茶素经过多酚氧化酶氧化反应形成的氧化聚合物。但是由于茶叶的发酵是一种茶叶片的内部自然发酵氧化过程，其反应速度不易人工控制，儿茶素氧化聚合物的生成也不易检测。
【发明内容】
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[0003]本发明的目的是提供一种儿茶素氧化聚合物的制备方法，采用生物体外酶催化氧化模型，模拟茶叶发酵时发生的催化氧化反应，制备具有胰脂肪酶抑制作用的儿茶素氧化聚合物，其反应速度易于人工控制，儿茶素氧化聚合物也易于检测，具有较强的实践应用价值及市场前景。
[0004]为达到上述目的，本发明一种具有胰脂肪酶抑制作用的儿茶素氧化聚合物的制备工艺包括以下步骤:
[0005]I)儿茶素溶液的制备:在21_25°C下，将儿茶素含量为98%绿茶提取物与蒸馏水按lmg/0.2ml混合，搅拌至全部溶解，使其呈现透明澄清液体状态；
[0006]2)梨汁混悬液的制备:称取梨，梨与儿茶素含量为98%的绿茶提取物的质量比为50:1，使用粉碎机对梨进行充分粉碎，得到粉碎的梨汁，四层纱布滤去沉淀物，得到梨汁混悬液；
[0007]3)儿茶素氧化聚合物的制备:将步骤I)制得的儿茶素溶液与步骤2)制得的梨汁混悬液混合，通入空气或氧气，同时搅拌，使儿茶素溶液与梨汁混悬液混匀，在21-25°C下反应3-5个小时，通过薄层色谱法(TLC)或高效液相色谱法(HPLC)确认儿茶素被充分氧化及儿茶素氧化聚合物产生； [0008]4)儿茶素氧化聚合物的精制:将步骤3)所得的液体冷却并过滤、浓缩后，逐渐加ADlOl大孔吸附树脂层析柱中，用蒸馏水进行洗脱至无浑浊液体流出，再用95%乙醇进行洗脱至FeCl3显色剂在洗脱液TLC薄层层析板不显色，收集乙醇洗脱液进行减压浓缩蒸馏，冷冻干燥处理，即得红褐色儿茶素氧化聚合物干燥粉末。
[0009]所述的梨为新鲜果实，DlOl大孔吸附树脂层析柱为医药级。
[0010]三氯化铁的乙醇溶液为多酚类化合物的显色剂，使用其对产品的TLC薄层层析板进行喷涂可以判断是否洗脱液中存在儿茶素氧化聚合物。
[0011]由于采取了以上技术方案，本发明的优点在于:(1)本发明使用的儿茶素含量为98%绿茶提取物主要化学成分经高效液相色谱法(HPLC)分析，结果显示其主要化学成分是儿茶素类化合物，是日常饮用茶叶的主要化学成分，这类化合物具有高度的生物安全性，未见任何毒性及副作用报道，同时具有抗氧化等多种生物学功能，将其作为原料用于胰脂肪酶抑制剂的研发具有高度的安全性和可靠性。(2)本发明涉及的氧化酶是一类来源于天然水果梨中的多酚氧化酶，它们大量地存在于新鲜的梨果实中，是一种来源稳定、氧化作用良好的多酚氧化酶。经过多项研究表明，新鲜梨汁在不加入任何物质的条件下，可以在室温条件下稳定高效的催化氧化儿茶素类化合物。新鲜梨汁适合催化氧化具有酚羟基的多酚类化合物，儿茶素正是一类这样的化合物。(3)利用新鲜梨汁中的多酚氧化酶进行催化的反应，反应底物及催化酶均来自天然产物，反应介质为水，反应过程中不产生其他具有毒副作用的化学副产物。同时在处理得到的儿茶素氧化聚合物时使用的大孔吸附树脂层析柱为医药级，洗脱溶剂为蒸馏水和95%乙醇，符合食品及医药原料制备标准。(4)利用本发明的制备方法制备的儿茶素氧化聚合物经过实验验证具有较好的胰脂肪酶抑制活性。
【具体实施方式】
[0012]实施例1:
[0013]I)将Ig儿茶素含量为98%的绿茶提取物和200ml蒸馏水加入带有搅拌磁子的烧杯中，在21-25°C下使用磁力搅拌器均匀搅拌，搅拌至其呈现澄清透明液体状态；
[0014]2)在粉碎机中加入50g梨新鲜果实及300ml蒸馏水，充分粉碎，得到粉碎的梨汁，四层纱布滤去沉淀物，得到梨汁混悬液；
[0015]3)将步骤2)制得的梨汁混悬液加入到步骤I)配置好的溶液中，在烧杯中通入氧气，同时用磁力搅拌器搅拌，使梨汁均匀分布于烧杯液体中，在21-25°C下反应3小时，通过薄层色谱法(TLC)或高效液相色谱法(HPLC)确认儿茶素完全被氧化，及儿茶素氧化聚合物
产生；
[0016]4)将步骤3)所得的液体冷却并过滤、浓缩后，逐渐加入装有医药级DlOl大孔吸附树脂的层析柱中，用3倍柱体积蒸馏水进行洗脱，至无浑浊液体流出，再加入95%乙醇进行洗脱至至FeCl3显色剂在洗脱液TLC薄层层析板不显色，收集乙醇洗脱液进行减压浓缩蒸馏，冷冻干燥处理，即得红褐色儿茶素氧化聚合物干燥粉末，其产率为89%。
[0017]实施例2:
[0018]I)将2g儿茶素含量为98%的绿茶提取物和400ml蒸馏水加入带有搅拌磁子的烧杯中，在21-25°C下使用磁力搅拌器均匀搅拌，搅拌至其呈现澄清透明液体状态；
[0019]2)在粉碎机中加入100g梨新鲜果实及600ml蒸馏水，充分粉碎，得到粉碎的梨汁，四层纱布滤去沉淀物，得到梨汁混悬液；
[0020]3)将步骤2)制得的梨汁混悬液加入到步骤I)配置好的溶液中，在烧杯中通入氧气，同时用磁力搅拌器搅拌，使梨汁均匀分布于烧杯液体中，在21-25°C下反应4小时，通过薄层色谱法(TLC)或高效液相色谱法(HPLC)确认儿茶素完全被氧化，及儿茶素氧化聚合物
产生；
[0021]4)将步骤3)所得的液体冷却并过滤、浓缩后，逐渐加入装有医药级DlOl大孔吸附树脂的层析柱中，用3倍柱体积蒸馏水进行洗脱，至无浑浊液体流出，再加入95%乙醇进行洗脱至FeCl3显色剂在洗脱液TLC薄层层析板不显色，收集乙醇洗脱液进行减压浓缩蒸馏，冷冻干燥处理，即得红褐色儿茶素氧化聚合物干燥粉末，其产率为84%。
[0022]实施例3:
[0023]I)将5g儿茶素含量为98%的绿茶提取物和1000ml蒸馏水加入带有搅拌磁子的烧杯中，在21-25°C下使用磁力搅拌器均匀搅拌，搅拌至其呈现澄清透明液体状态；
[0024]2)在粉碎机中加入250g梨新鲜果实及1000ml蒸馏水，充分粉碎，得到粉碎的梨汁，四层纱布滤去沉淀物，得到梨汁混悬液；
`[0025]3)将步骤2)制得的梨汁混悬液加入到步骤I)配置好的溶液中，在烧杯中通入氧气，同时用磁力搅拌器搅拌，使梨汁均匀分布于烧杯液体中，在21-25°C下反应5小时，通过薄层色谱法(TLC)或高效液相色谱法(HPLC)确认儿茶素完全被氧化，及儿茶素氧化聚合物
产生；
[0026]4)将步骤3)所得的液体冷却并过滤、浓缩后，逐渐加入装有医药级DlOl大孔吸附树脂的层析柱中，用3倍柱体积蒸馏水进行洗脱，至无浑浊液体流出，再加入95%乙醇进行洗脱至FeCl3显色剂在洗脱液TLC薄层层析板不显色，收集乙醇洗脱液进行减压浓缩蒸馏，冷冻干燥处理，即得红褐色儿茶素氧化聚合物干燥粉末，其产率为80%。
[0027]实验例:将上述实施例1~实施例3制备的儿茶素氧化聚合物与胰脂肪酶抑制剂药物奥利司他和98%茶多酚的胰脂肪酶抑制效果进行比较。
[0028]将实施例1~实施例3制备的儿茶素氧化聚合物分别精密称量lmg/ml，并分别稀释至0.5mg/ml、0.25mg/ml、0.125mg/ml、0.0625mg/ml,以浙江海正药业股份有限公司生产的胰脂肪酶抑制剂药物奥利司他作为对照品，分别配置同等浓度溶液，动物来源的胰脂肪酶由sigma公司提供，进行体外酶活性抑制研究，实验步骤如下:
[0029]I)缓冲液的配制:精确称取7880mg的Tris-HCl置于烧杯中，加500ml超纯水，用2mol / L 的 NaOH 调 pH=8.2。
[0030]2)底物溶液的配制:8.4mg乙酸钠溶于20ml的l%Triton X-100,加入40mgpNP_Laurate,得 0.2%pNP-Laurate。
[0031]3)酶液的配制:100mg 的胰脂肪酶(CAS:9001-62_1，sigma_L3126)溶于 IOml 的缓冲液中，离心lOOOOg，5min,上清液即为酶液。
[0032]4.分3组分别加入如下体积的上述1，2，3步骤中配制的溶液
[0033]Blank组:100u I缓冲液，100 U I样品溶液(抑制剂)，100 U I底物；
[0034]Control 组:100u I 酶液，100 U I 缓冲液，100 U I 底物；
[0035]Sample组:100u I酶液，100 U I样品溶液(抑制剂)，100 U I底物。
[0036]5.各实验组均在37°C下孵育45min,离心lOOOOg, 5min,于405nm下用酶标仪测OD值。
[0037]6.抑制率及各成分IC5tl的计算:
[0038]抑制率=(ODcontrol— ODsafflple) / ODcontrol X 100% Cblanlt 组调零)
[0039]用excel软件计算各组分对胰脂肪酶的抑制率和IC5tl值，进行比较分析。其抑制活性结果如下:
[0040]1、实施例1 [0041]
【权利要求】
1.一种具有胰脂肪酶抑制作用的儿茶素氧化聚合物的制备工艺，其特征在于包括以下步骤: 1)儿茶素溶液的制备:在21~25°C下，将儿茶素含量为98%绿茶提取物与蒸馏水按lmg/0.2ml混合，搅拌至全部溶解，使其呈现透明澄清液体状态； 2)梨汁混悬液的制备:称取梨，梨与儿茶素含量为98%的绿茶提取物的质量比为50:1，使用粉碎机对梨进行充分粉碎，得到粉碎的梨汁，四层纱布滤去沉淀物，得到梨汁混悬液； 3)儿茶素氧化聚合物的制备:将步骤I)制得的儿茶素溶液与步骤2)制得的梨汁混悬液混合，通入空气或氧气，同时搅拌，使儿茶素溶液与梨汁混悬液混匀，在21~25°C下反应3~5个小时，通过薄层色谱法或高效液相色谱法确认儿茶素被充分氧化及儿茶素氧化聚合物产生； 4)儿茶素氧化聚合物的精制:将步骤3)所得的液体冷却并过滤、浓缩后，逐渐加入DlOl大孔吸附树脂层析柱中，用蒸馏水进行洗脱至无浑浊液体流出，再用95%乙醇进行洗脱至FeCl3显色剂在洗脱液TLC薄层层析板不显色，收集乙醇洗脱液进行减压浓缩蒸馏，冷冻干燥处理，即得红褐色儿茶素氧化聚合物干燥粉末。
2.根据权利要求1所述的一种具有胰脂肪酶抑制作用的儿茶素氧化聚合物的制备工艺，其特征在于:所述的梨为新鲜果实。
3.根据权利要求1所述的一种具有胰脂肪酶抑制作用的儿茶素氧化聚合物的制备工艺，其特征在于:D101大孔吸附树脂层析柱为医药级。
【文档编号】C12P17/16GK103642866SQ201310551801
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2013年11月8日 优先权日:2013年11月8日
【发明者】李岩, 段静雨, 么焕开, 崔文, 李勇, 艾凤伟 申请人:徐州医学院