专利名称：测定脂肪酶的改进方法
技术领域：
本发明是关于测定生物体液中脂肪酶的方法和试剂，以及一种低分子N-取代的羧酸酰胺衍生物在消除酶测定中的非特异性反应中的应用。特别是，现已证明，当N-(1，2-二羧基乙基)-N-烷基-磺基琥珀酰胺或N-(1，2-二羧基乙基)-N-烷芳基-磺基琥珀酰胺衍生物以大约0．001％-2．0％(w／v)的浓度存在时是有利的。
长期以来，测定脂肪酶，特别是人胰腺脂肪酶(E．C．3．1．1．3)，对胰腺疾病的诊断和病程检定具有无可置疑的重要性(W．Steinberg etal，Annals of Internal Medicine 102(1985)，576；M．Panteghini et al，Clin．Biochem．24(1991)，497，N．W．Tietz and D．F．Shuey，Clin．Chem．39／5(1993)，746)。例如，在急性胰腺炎时，血清中脂肪酶有时在几小时内发生非常巨大的增加。
在体内，脂肪酶的功能主要是优先断开三酸甘油酯的α酯键，此三酸甘油酯含有长链脂肪酸酯，被断开成为二酸甘油酯部分和游离脂肪酸。然后再转化成单酸甘油酯，但此过程相当缓慢。
通常，酶催化反应在水相中进行，但是，由于其生理学的重要性，脂肪酶仅在油／水界面发挥作用。在这方面，脂肪酶显著不同于酯酶。而且，脂肪酶只能附着在被未变性胆汁酸乳化的界面上，并在共脂肪酶的帮助下断开三酸甘油酯。由于这个原因，其反应动力学除了受化学参数影响外，还主要是受提供给酶的界面性质的影响。
目前，已知有多种方法可用于测定脂肪酶。这些方法主要是基于滴定分析，浊定分析和免疫学试验原理。在滴定法测定中，首先要加入过量的脂肪酶底物，例如橄榄油，然后通过用指示剂，以碱进行滴定，或者通过萃取相应的铜盐，检测由脂肪酶从它释放出的脂肪酸量。滴定法目前在常规临床化学实验室中仅偶尔采用，因为有时很难掌握，并且需要很长的反应时间和大量的样品(W．Junge in Methods ofEnzymatic Analysis，Weinheim VCH．U．Bergmeyer ed．vol．4(1984)，15)。
借助于光度计检测三酸甘油酯／水乳浊液浊度澄清的浊度法脂肪酶测定，是目前在常规临床化学实验室中普遍采用的方法(W．Rick andM．Hockeburn，J．Clin．Chem．Biochem．20(1982)，735；J．Ziegenhorn et al，“Medica Sonderheft”11(1980)。浊度测定法的问题是，个别血清样品并不显示光度计检测窗内检测信号线性地减弱，而是甚至显示出浊度增加。这种测定方法的另一个困难是，难以重复地产生总是可靠地具有相同大小微粒的乳浊液。
免疫学方法的一个具体的缺点是，在此方法中测定的是质量，而不是酶活性(W．UhL et al，Internat，J．Pancreatology 12／3(1992)，253，G．E．Hoffann et al，_rztl．Lab．30(1984)，193，H．Herden and K．Walter，Klin．Lab，38(1992)，89)。
从而发展了基于显色的测定法，是目前主要采用的方法。例如，用1，2-二酸甘油酯作底物，它被脂肪酶降解成2-单酸甘油酯，并随后被对试样加入的2-单酸甘油酯脂肪酶断开成甘油。按此方式形成的游离甘油，借助于磷酸甘油氧化酶，降解形成二羟基丙酮和过氧化氢(H2O2)。可借助适当的显色指示系统，测定所形成的H2O2(P．Fossatiet al．Clin．Chem．38／2(1992)，211)。
现在还可能直接转化生色底物用于脂肪酶测定(EP 0207252)。在此方法中，由于人胰脂肪酶的活性，从该底物直接释放出可光度测定的染料，从而避免了为产生染料的复杂酶级联过程。
而且，长时间以来已知道，所用生色底物的酯键，由于非特异性水解可能产生过高的信号。例如，生色底物乙酸对一硝基苯酯被白蛋白和r-球蛋白水解就很成问题(W．Downey and P．Andrews，Biochem．J．96(1965)21)。这类反应会产生虚假的测定值，特别在用血清样品的情况下，可能导致临床误诊。
因此，本发明的目的是消除脂肪酶测定中的非特异性反应，从而提高分析结果的准确性。
通过加入脂肪酶生色底物和一种低分子N-取代羧酸酰胺衍生物，然后用光度法测定从底物释放的染料，借助于这种方法测定脂肪酶，从而达到了目的。已证明，具有通式(I)或(Ia)结构的化合物根据本发明特别适合于作为这种羧酸酰胺衍生物。
其中R1和R2互相独立地代表氢，或者一个饱和或不饱和的、被取代或未被取代的、被任意羧化的、具有2-24个碳原子的烃残基，Z代表一个饱和或不饱和的、被取代或未被取代的、环型或直链的、具有1-10个碳原子的烃残基，X代表一个带有正电荷的原子或原子团，n是1-3的数字。
根据本发明，通式(I)或(Ia)的羧酸酰胺化合物是优选的，其中Z是由1-10个C原子组成的亚甲基和／或1，2-亚乙基，其任选地被如下吸电子基团取代羧基、磺酰基、磷酸酯基、膦酸酯基、硝基、亚硝酸酯基或硝酸酯基，卤素或烷氧基，R1和R2相互独立地代表氢，被任意取代的直链或支链、饱和或不饱和的烷基、芳基、烷芳基或亚烷基，其由3-24个碳原子组成，其中由2-24个碳原子组成的羧烷基或二羧烷基残基是特别优选的。
已证明X代表一个带正电荷的原子或原子团，n代表数字1或2是适合的。
本发明特别考虑的那些化合物中，残基Z携有羧基和／或磺酰基，但是也包括其中R1或R2残基之一代表如下低级烷基的化合物甲基，乙基，丙基，丁基，戊基，乙烯基或丙烯基，或者C10-C18烷基。可按照已知的方法，任选地实现适当的烷基或亚烷基取代。而且已证明如下情况是有利的，例如如果R1代表一个基于丙二酸，戊二酸，己二酸，庚二酸，壬二酸和癸二酸，特别是基于琥珀酸的二羧酸残基。可用于本发明的化合物优选地具有大约200-1000道尔顿的分子量，但是，已证明，直至3000道尔顿的化合物也是适合的。已证明十分有利的是具有至少二个酸式基团的化合物或盐，例如基于带有低级烷基(1-6个C原子)和／或带有高级烷基(12-18个C原子)的N-(1，2-二羧基-乙基)-N-烷基-磺基琥珀酰胺的，或者基于N-(1，2-二羧基乙基)-N-烷芳基-磺基琥珀酰胺或由它得到的衍生物和相应混合物的四钠盐。
原则上，作为底物被脂肪酶识别和转化的所有化合物，都用于在本发明的化合物，如通式(I)或(Ia)的化合物存在下测定脂肪酶。已证明有一种测定脂肪酶的方法特别优越，其中是将EP 0207252的化合物用作脂肪酶底物，例如，1，2-O-辛基-外消旋-甘油基-3-壬二酸，1，2-O-二癸基-外消旋-甘油基-3-庚二酸或1，2-O-二月桂基-外消旋-甘油基-3-戊二酸试卤灵酯，或者1，2-O-二月桂基-外消旋-甘油基-3-戊二酸-(4′-或6′-甲基试卤灵)酯。在这方面已令人惊奇地发现，本发明的这些物质能够防止在含有相应生色底物的乳浊液中发生非特异性水解，而又不会抑制脂肪酸的活性。
将本发明通式(I)或(Ia)(其R1，R2，Z，X和n具有前述含义)的化合物，或者几种化合物的混合物，加到脂肪酶测定反应液中，其浓度(最后浓度)大约为0．001-2．0％(w／v)，优选地为大约0．01-1．0％(w／v)。
脂肪酶测定的更进一步的条件和添加剂是本领域的专业人员熟知的，例如去垢剂(如牛黄脱氧胆酸盐，脱氧胆酸钠，polydocanol)，具有杀菌或杀真菌作用的物质(叠氮钠，甲基-异-噻唑酮等)，稳定剂(如DMSO)，辅助因子，乳化剂(如丙醇)，激活剂，或者避免不需要的副反应的措施。特别是已证明，在DE 2904305或EP 0207252中所述的添加剂和技术条件，对此情况是适合的。脂肪酶可在来源于人和动物的(例如猪胰腺脂肪酶)样品中测定，例如在血液，血清或组织中。
本发明通式(I)或(Ia)的N-取代羧酸酰胺化合物或其盐，可通过本领域专业人员熟知的方法来制备。此外，本发明的化合物，例如N-(1，2-二羧基乙基)-N-烷基磺基琥珀酰胺四钠(REWOPOLB 2003)可从已知的公司如Witco Surfactants GmbH Company，Steinau．购得。
本发明的另一个主题是测定脂肪酶的试剂或试剂盒，主要由如下几种成分组成(a)一种脂肪酶的生色底物，(b)一种适当的缓冲剂物质，以及(c)包含在任何所需试剂部分中的成分-一种低分子N-取代羧酸酰胺衍生物，即例如一种通式(I)或(Ia)的化合物。任何能够在本发明的试剂中将其pH值调节在6．0-10．5的已知缓冲剂，都适合作为此缓冲剂物质。优选的pH值范围是7．0-9．5。适当的缓冲剂实例有二乙醇胺缓冲剂，三乙醇胺缓冲剂，Tris或酒石酸盐缓冲剂，或者所谓的Good′s缓冲剂，如Hepes缓冲剂，N，N-二(羟乙基)甘氨酸缓冲剂，Taps缓冲剂和CHES缓冲剂(2-(环己氨基)-乙基磺酸缓冲剂)。特别优选的是N，N-二(羟乙基)甘氨酸缓冲剂。在此情况下，该缓冲剂的浓度通常在5-200mM，优选地在30-100mM，而特别优选的是大约50mM。
已证明，当这种试剂由二部分试剂成分组成时是有利的，其中除了本领域的技术人员熟知的其它添加剂之外，在第一部分中还存在本发明的羧酸酰胺衍生物，而脂肪酶生色底物包含在第二部分试剂中。在此情况下重要的是，在测定之前，本发明的羧酸酰胺化合物保存在弱碱缓冲的基质中，脂肪酶生色底物保存在酸性pH值下。在一个特别优选的实施方案中，本发明的试剂是由二部分试剂组成，其中第一部分具有弱碱缓冲的pH值(pH7．5-9．0，优选地约pH8．0)，并含有本发明通式(I)或(Ia)的一种或几种羧酸酰胺化合物，以及另一些盐，防腐剂和去垢剂。第二部分试剂含有一种基本上被缓冲在2．0-5．0pH值范围内的，优选地约pH4的物质，一种适当的脂肪酶底物，以及优选地含有另一些辅助剂物质。对于此第二部分试剂，已证明在借助了喷注技术的压力下加入乳化剂例如胆酸盐化合物和／或Thesits，是特别有利的。为此可将优选的油相，即含有全部成分的试剂R2，通过一根非常细的导管喷注进入被首先加入的水相中。结果，通过所述的方法，得到了一种具有改进稳定性的清亮，无混浊的乳液／悬液。并且，此试剂不会由于例如存在非特异性酶(非脂肪酶的酯酶)而发生不需要的副反应。这样一种以一致的微粒大小为特征的脂肪酶底物试剂，可在大约2-8℃贮存12-18个月而不变质。这样又确保使完整的试剂有适当的稳定性。微粒最大的尺寸分布范围优选的是大约100nm，相当于小于300NTU(比浊测定浊度单位)的浊度。
图1IgG递增浓度0-3g／dl，R1(试剂1)未加入本发明的化合物，样品5μl，-NaCl 空白，---IgG 0，……IgG 0．5g／dl，……IgG 1．0g／dl，……IgG 1．5g／dl，-IgG 2．0g／dl，---IgG 2．5g／dl，……IgG 3．0g／dl。图2IgG递增浓度0-3g／dl，R1含有0．27％(w／v)N-(1，2-二羧基乙基)-N-烷基-磺基琥珀酰胺四钠，样品10μl，其它细节同图1中的说明。图3脂肪酶，浊度的比色测定，R1／R2未加入本发明的化合物，校准器Cfas(=校准自动操作系统)。
数值对数量25-BaPa y=57．8108+1．0315*x(r=0．9828)……y=x的等同直线，x 人血清图4脂肪酶浊度的比色测定，R1未加入，R2加入了如图2中的本发明化合物，其它细节同对图3的说明，数值对数量25-BaPa y=12．6916+1．3995*x(r=0．9944)……小时Hk y=9．4818=1．4178*x---y=x的等同直线，x 人血清将通过下面的实施例对本发明作进一步阐述实施例1以各种浓度的IgG作样品脂肪酶比色测定的试剂组成试剂1(R1)4．55mmol／l 牛磺脱氧胆酸盐1．77mmol／l 脱氧胆酸钠50．00mmol／l N，N-二(羟乙基)甘氨酸缓冲液0．98mg／l 共脂肪酶5．00mmol／l 氯化钙防腐剂试剂2(R2)8．1mmol／l 牛磺脱氧胆酸盐0．24mmol／l 生色底物(1，2-O-二月桂基-外消旋-甘油基-3-戊二酸-(6′-甲基试卤灵)酯)1．60mmol／l 酒石酸盐缓冲液0．10mmol／l 氯化钙防腐剂／表面活性剂样品含有不同浓度IgG(0-3g／l)的NaCl。在BM／Hitachi 717自动分析仪上按照如下操作程序进行比色测定
温度37℃
测算通过从校准曲线上读取数值进行测算，此曲线也是在上述仪器条件下，借助了来自Boehringer Mennheim Co．的O标准和脂肪酶标准系统(Cfas)测定的。
结果发现在乳剂中不含有本发明化合物的情况下，生色底物发生水解显然取决于加入的IgG浓度(参见图1)。实施例2本发明不同浓度的添加剂(干扰消除剂)
脂肪酶比色测定的试剂组成相当于实施例1中所述的试剂R1和R2，不同的是R1还含有0．27％具有C12-C18烷基的N-(1，2-二羧基乙基)-N-烷基-磺基琥珀酰胺四钠混合物。
样品含有不同浓度IgG(0-3g／l)的NaCl。
根据实施例1中所述的方法和详细说明，在BM／Hitachi 717自动分析仪上进行比色测定和测算。
结果在预定的浓度下，消除了非特异性的非酶水解作用(参见图2)。实施例3完整试剂的配制试剂1同实施例1中所述。
试剂2将0．6g脂肪酶生色底物(例如1，2-O-二月桂基-外消旋-甘油基-3-戊二酸-(6′-甲基试卤灵)酯)溶解于9ml适当的醇，如乙醇中。对此溶液加入1g乳化剂，如Brij 35或Triton X-114。将所形成的油相吸取进注射针管中，然后高压推挤，使之通过细导管(内径0．15-1．0mm)注入水溶液中，同时进行搅拌。此水溶液含有例如，0．15g酒石酸缓冲剂(pH5．0)，0．009g氯化钙，以及0．5g牛磺脱氧胆酸盐，溶解于100ml水中。此外，该水溶液还可能含有一个或几个防腐剂和另外任何辅助乳化剂成分。实施例4不加入本发明的物质时比浊测定法和比色测定法的比较脂肪酶比色测定的试剂组成相当于实施例1中所述的组分。
“脂肪酶比浊测定法”的试剂组成如下R119．0mmol／l 脱氧胆酸钠26．0mmol／l Tris缓冲液3．0mg／ml共脂肪酶0．1mmol／l 氯化钙0．30mmol／l 三油精防腐剂样品人血清按照如下程序，在BM／Hitachi 717自动分析仪上进行不同的脂肪酶测定
比色测定值温度37℃
比浊测定值温度37℃
以类似于实施例1的方法进行测算。
结果方法比较表明，比色测定显示出与坐标轴相交(axisintercept)，这是由于生色底物被血清成分非特异性水解所致(图3)实施例5加入本发明的物质时比浊测定法和比色测定法的比较试剂组成和测定方法如实施例4中所述。此外，试剂1(R1)中还加入了作为本发明物质的N-(1，2-二羧基乙基)-N-十八烷基-磺基琥珀酰胺四钠，或者是含有这种物质的适当混合物，浓度为0．27％(w／v)。
样品人血清按照实施例4中所述的方法，在BM／Hitachi 717自动分析仪上进行不同的脂肪酶测定。测算方法也类似于实施例4和1。
结果由于加入本发明的物质而清除了非特异性反应，并因此消除了类似于比浊测定法的与坐标轴相交(图4)。
权利要求
1．通过加入脂肪酶生色底物，然后对从该底物释放的染料进行光度测定的生物样品中脂肪酶检测法，其中是在存在一种低分子N-取代羧酸酰胺衍生物的情况下进行该测定。
2．权利要求1的方法，其中是在存在如下通式(I)或(Ia)的化合物时进行测定
结构式中R1和R2互相独立地代表氢，或者一个饱和或不饱和的、被取代或未被取代的具有2-24个碳原子的烃残基，Z代表一个饱和或不饱和的、被取代或未被取代的、环型或直链的具有1-10个碳原子的烃残基，X代表一个带有正电荷的原子或原子团，n是1-3的数字。
3．权利要求2的方法，其中R1或R2代表一个被任意取代的烷基、芳基、烷芳基或亚烷基，其由3-24个碳原子组成，Z是具有至多10个C原子的亚甲基和／或1，2-亚乙基，其任选地被一个或几个如下基团取代羧基、磺酰基、磷酸酯基、膦酸酯基、硝基、亚硝酸酯基或硝酸酯基、卤素或烷氧基。
4．权利要求2或3之一的方法，其中加入通式(I)或(Ia)的化合物或其盐，其中Z携带有一个羧基或磺酰基。
5．权利要求2-4之一的方法，其中R1或R2残基之一代表甲基，乙基，丙基，丁基，戊基，乙烯基或丙烯基，或者C12-C18烷基。
6．权利要求2-5之一的方法，其中的盐是N-(1，2-二羧基乙基)-N-烷基-磺基琥珀酰胺四钠，N-(1，2-二羧基乙基)-N-烷芳基磺基琥珀酰胺四钠或由它们产生的衍生物，或者是含有这种化合物的相应混合物。
7．权利要求1-6之一的方法，其中的羧酸酰胺衍生物是以0．001-2．0％(w／v)的浓度存在于样品液中。
8．上述权利要求之一的方法，其中该化合物或相应的化合物是以0．01-1．0％(w／v)的最终浓度存在。
9．上述权利要求之一的方法，其中被测定的是人胰脂肪酶，或来自动物的胰脂肪酶。
10．用于测定脂肪酶的试剂，含有如下成分(a)一种脂肪酶底物，(b)一种缓冲剂物质，和(c)一种低分子N-取代羧酸酰胺衍生物。
11．权利要求10的试剂，含有如下成分(a)一种脂肪酶生色底物，(b)一种缓冲剂物质，(c)一种通式(I)或(Ia)的化合物，
其中R1和R2互相独立地代表氢，或者一个饱和或不饱和的、被取代或未被取代的具有2-24个碳原子的烃残基，Z代表一个饱和或不饱和的、被取代或未被取代的、环型或直链的具有1-10个碳原子的烃残基，X代表一个带有正电荷的原子或原子团，n是1-3的数字。
12．权利要求10或11的试剂，其中该试剂的第一部分试剂中含有pH值约7．5-9．0的缓冲剂物质(b)，成分(c)，去垢剂和／或防腐剂，而第二部分试剂含有pH值约2．0-5．0的缓冲剂物质(b)，成分(a)和乳化剂。
13．权利要求10、11或12之一的试剂，其中成分(c)是N-(1，2-二羧基乙基)-N-烷基磺基琥珀酰胺四钠，N-(1，2-二羧基乙基)-N-烷芳基磺基琥珀酰胺四钠或相应的衍生物，或者是含有这种化合物的适当的混合物。
14．一种N-取代羧酸酰胺衍生物或者如下通式(I)或(Ia)化合物在消除生物样品材料中的脂肪酶测定的非特异性反应中的应用，
其中R1和R2互相独立地代表氢，或者一个饱和或不饱和的、被取代或未被取代的具有2-24个碳原子的烃残基，Z代表一个饱和或不饱和的、被取代或未被取代的、环型或直链的具有1-10个碳原子的烃残基，X代表一个带有正电荷的原子或原子团，n是1-3的数字。
全文摘要
本发明是关于在生色底物和至少一种N－取代羧酸酰胺衍生物,或者一种如右通式(Ⅰ)或(Ⅰa)的化合物存在下,用于测定脂肪酶的方法和试剂,其中R
文档编号C12Q1/44GK1205034SQ97191263
公开日1999年1月13日 申请日期1997年9月16日 优先权日1997年9月16日
发明者L·谢龙, R·兹伦斯基, U·普林景 申请人:曼海姆泊灵格股份公司