一种浓缩、稳定、分离液体酶的方法
【专利摘要】本发明提供了一种浓缩、分离、稳定液体酶的方法，组分按重量百分比计：大环分子合成受体1.0-20.0％，非离子型表面活性剂0.1％-50％，酶稳定剂0.25％-5％，生物酶0.01％-80％，极性溶剂余量；按上述组分配比混合，控制pH3-12，温度0-80℃，反应1-24h。溶液中形成了含生物酶的超分子微球，粒径大小在10nm-1000nm之间。本发明所选材料均为环保无害，易降解的材料。最重要的是这种方法没有损害酶的活性，且使酶的活性在相当长一段时间都有较高的活性，包裹于超分子微球中的酶活性较普通液体酶的活性提高20%，将其应用于纺织乳化剂或液体洗涤剂的配方中四周后生物酶的活性损失小于10%。
【专利说明】一种浓缩、稳定、分离液体酶的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及到液体酶制剂，具体属于浓缩、稳定、分离液体酶制剂的方法。
【背景技术】
[0002]液体酶制剂是一种使用方便，绿色环保，生物降解性良好的原料。专一的催化特性及温和的反应条件，在工业界得到越来越多的使用和重视。但是，液体酶制剂的浓缩，稳定及分离一直是一个困扰着人们的难题。
[0003]当然，有许多人在尝试寻找办法解决有关液体酶制剂浓缩，稳定及分离的问题。并且提出一些可行的技术，有添加酶稳定剂，膜分离技术，微波真空浓缩法，试剂浓缩，和温敏性水凝胶法等。
[0004]添加酶稳定剂方法是比较传统的稳定，浓缩酶制剂的方法。在US20070134375A1中，Andreas Habich等人在发明中涉及一种稳定的固态或者液态酶制剂,其包含至少一种酶和至少一种选自阿拉伯胶、至少一种植物蛋白及其混合物的稳定剂，提高了酶制剂的贮存和稳定性。
[0005]膜分离技术是20世纪60年代兴起的一项分离技术，它借助于外界能量或化学位差的推动，通过特定膜的渗透作用，实现对两组分或多组分混合的气体或液体进行分离、分级、提纯和富集的技术。常用的膜材料有醋酸纤维素(CA)、聚丙烯腈(PAN)、聚矾(PSF)、聚酰胺(PA)、聚偏氟乙烯(PVDF)等。常见的膜分离技术:(I)微滤(Micro filtration, MF)；
(2)超滤(Ultrafiltration, UF) ； (3)纳滤(Nanofiltration, NF) ； (4)反渗透(Reverseosmosis, R0)ο目前，在酶制剂工业中，应用较多的是微滤及超滤技术，尤其是超滤技术，而且近年来超滤技术与其他分离技术的联合使用已越来越广泛地被应用。
[0006]1965年Blatt等提出用膜分离技术进行微生物的浓缩，并进行试验。王平诸用外压管式膜由菠萝汁中浓缩提取菠萝蛋白酶，酶活可浓缩近4倍，浓缩液中酶截留率95%，回收率79.8%，酶粉得率比传统方法高出47%。在CN201110389274中，周兴等人用超滤和纳滤技术对腈水解酶粗酶进行了一系列处理，最后制备出浓度较高的腈水解酶产品。在专利CN103122343A中，魏兴业等人用管式或中空纤维式的超滤膜对破胶酶复合菌发酵液进行了浓缩，结果得到纯度较高的酶产物。
[0007]应用膜分离技术对酶进行浓缩和精制，操作过程简单，减少了杂菌污染与酶失活的机会，提高了酶的回收率并改善了产品的质量。
[0008]目前也有人尝试用微波真空浓缩法对酶制剂进行了浓缩，并取得了成功。在CN102899303A中，李冰等人公开了一种木瓜蛋白酶溶液的微波真空浓缩方法，他们用微波真空浓缩方法对瓜蛋白酶进行浓缩，得到了木瓜蛋白酶浓缩液。这种方法浓缩过程温度低，浓缩速度快，得到的木瓜蛋白酶浓缩液酶活回收率高。同时，设备不易结垢，能耗低。
[0009]试剂浓缩法用聚乙二醇(PEG)吸收酶液中的水分，该法简便、效率高，但试剂价格较贵，作为工业化生产因成本问题则不予考虑。
[0010]减压蒸发浓缩法采用减压装置使待浓缩酶液在一定的真空度和温度下进行，对酶液等热敏性物质，减压装置多采用离心薄膜蒸发器和刮板式蒸发器，但是该法能源消耗较大。
[0011]温敏性水凝胶也可以对酶进行浓缩和分离，它根据被浓缩分离物质的尺寸和性质设计凝胶的交联密度或单体结构。但是凝胶对蛋白及酶的分离效率低温时(低于相转变温度)分离效率很高，高温时(高于相转变温度)分离效率降低，在相转变温度附近分离效率发生突跃。(王锦堂仲慧朱红军张维光，南京化工大学学报，1998，20，2)
[0012]目前，也有一些技术提到用超分子来封装液体酶制剂，但是因为生物酶三维结构的特点，在超分子技术中不同程度的都遇到了酶失活，以及封装生物酶含量过低的问题。
【发明内容】
:
[0013]本发明的目的在于针对酶制剂普遍存在的酶失活的问题，利用超分子纳米微球包裹生物酶的技术，提供一种浓缩、分离、稳定液体酶的方法。
[0014]本发明提供的一种浓缩、分离、稳定液体酶的方法，
[0015]组分按重量百分比计:大环分子合成受体1.0-20.0%，非离子型表面活性剂0.1% -50%,酶稳定剂0.25% -5%,生物酶0.01% -80%,极性溶剂余量；
[0016]按上述组分配比混合，控制pH3-12，温度0_80°C，反应l_24h。溶液中形成了含生物酶的超分子微球，粒径大小在IOnm-1OOOnm之间。
[0017]以上优选的组分配比为:大环分子合成受体2.0-18.0%，非离子型表面活性剂
0.5% -40%,酶稳定剂0.5% -4.5%，生物酶0.5% -70%，极性溶剂余量；
[0018]所述的反应温度优选5_70°C之间，更优选10_50°C之间。
[0019]所述的PH值优选5-11。
[0020]所述的大环分子合成受体为冠醚、环番、环糊精、葫芦脲、杯芳烃或柱芳烃等。
[0021]所述的冠酿为15_冠酿_5、15_冠酿-6、或18-冠酿-6等；
[0022]环番为大环番或小环番等；
[0023]环糊精为α -环糊精、β -环糊精、Y -环糊精等；
[0024]杯芳烃为杯[4]芳烃或杯[5]芳烃等；
[0025]柱芳烃为柱[5]芳烃或柱[6]芳烃等。
[0026]所述的极性溶剂是水或直链醇或酮。
[0027]所述酶稳定剂可以是二元醇或三元醇；二元醇可以是乙二醇、1，2_丙二醇、
1,3-丙二醇，I, 2- 丁二醇、1，3- 丁二醇、1，4- 丁二醇或1，5-戊二醇；三元醇可以是丙三醇、1,2,4- 丁三醇或1，2，5-戊三醇。
[0028]所述的非尚子型表面活性剂，其结构式可以是PEOx — PPOy 一 PE0x、R — C6H4 一 O —(CH2CH2O)n — H、R — CO — (OC2H4)n — OH、RO — (CH2CH2O)n — H 或 R-COO- (CH2CH2O)n-H ;且其分子量>10000，HLB值在5-60之间。
[0029] 所述的生物酶是蛋白酶、果胶酶、纤维素酶、脂肪酶、半纤维素酶、脂酶、诺维信酶和枯草杆菌酶中的任意一种或多种。
[0030]与现有技术分离，浓缩以及稳定液体酶制剂的方法相比，本发明提出用大环分子合成受体，酶稳定剂，非离子型表面活性剂以及生物酶来构建超分子微球达到分离，浓缩以及稳定液体酶制剂的目的，本发明所选材料均为环保，无危害，易降解的材料。最重要的是这种方法没有损害酶的活性，且使酶的活性在相当长一段时间都有较高的活性，包裹于超分子微球中的酶活性较普通液体酶的活性提高20%，将其应用于纺织乳化剂或液体洗涤剂的配方中四周后生物酶的活性损失小于10%。
【专利附图】
【附图说明】:
[0031]图1实施例1动态光散射(DLS)超分子微球颗粒粒径分布图
[0032]图2实施例2动态光散射(DLS)超分子微球颗粒粒径分布图
[0033]图3实施例3动态光散射(DLS)超分子微球颗粒粒径分布图
[0034]图4实施例4动态光散射(DLS)超分子微球颗粒粒径分布图
[0035]图5实施例5动态光散射(DLS)超分子微球颗粒粒径分布图
[0036]图6实施例6动态光散射(DLS)超分子微球颗粒粒径分布图
[0037]图7实施例7动态光散射(DLS)超分子微球颗粒粒径分布图
[0038]图8实施例8动态光散射(DLS)超分子微球颗粒粒径分布图
[0039]图9实施例9动态光散射(DLS)超分子微球颗粒粒径分布图
[0040]图10实施例10动态光散射(DLS)超分子微球颗粒粒径分布图
[0041]图11实施例10超分子微球电镜照片
【具体实施方式】:
[0042]实施例1
[0043]将非离子型表面活性剂EO11PO69EO11 (HLB值6.0)0.9g溶解于50g水中，然后取液体蛋白酶制剂Ig与之混合，混合物滴加到0.8g α -环糊精中，再加入2.4gl, 2_丙二醇稳定剂混匀。
[0044]将上述混合均匀的液体，密封后在20°C下，搅拌反应20h，通过国标GB/T23527-2009确定液体蛋白酶制剂的酶活力见下表。
[0045]
【权利要求】
1.一种浓缩、分离、稳定液体酶的方法，其特征在于: 组分按重量百分比计:大环分子合成受体1.0-20.0%，非离子型表面活性剂0.1% -50%,酶稳定剂0.25% -5%,生物酶0.01% -80%,极性溶剂余量； 按上述组分配比混合，控制PH3-12，温度0-80°C，反应l_24h即可。
2.如权利要求1所述的一种浓缩、分离、稳定液体酶的方法，其特征在于:所述的组分按重量百分比计:大环分子合成受体2.0-18.0%，非离子型表面活性剂0.5% -40%，酶稳定剂0.5 % -4.5 %，生物酶0.5 % -70 %，极性溶剂余量。
3.如权利要求1所述的一种浓缩、分离、稳定液体酶的方法，其特征在于:所述的反应温度为5-70°C。
4.如权利要求1所述的一种浓缩、分离、稳定液体酶的方法，其特征在于:所述的PH值为 5-11。
5.如权利要求1所述的一种浓缩、分离、稳定液体酶的方法，其特征在于:所述的大环分子合成受体为冠醚、环番、环糊精、葫芦脲、杯芳烃或柱芳烃。
6.如权利要求5所述的一种浓缩、分离、稳定液体酶的方法，其特征在于:所述的冠醚为15-冠醚-5、15-冠醚-6、或18-冠醚-6。
7.如权利要求5所述的一 种浓缩、分离、稳定液体酶的方法，其特征在于:所述的环番为大环番或小环番。
8.如权利要求5所述的一种浓缩、分离、稳定液体酶的方法，其特征在于:所述的环糊精为α -环糊精、β -环糊精或Y -环糊精。
9.如权利要求5所述的一种浓缩、分离、稳定液体酶的方法，其特征在于:所述的杯芳烃为杯[4]芳烃或杯[5]芳烃。
10.如权利要求5所述的一种浓缩、分离、稳定液体酶的方法，其特征在于:所述的柱芳烃为柱[5]芳烃或柱[6]芳烃。
11.如权利要求1所述的一种浓缩、分离、稳定液体酶的方法，其特征在于:所述的极性溶剂是水或直链醇或酮。
12.如权利要求1所述的一种浓缩、分离、稳定液体酶的方法，其特征在于:所述的所述酶稳定剂是二元醇或三元醇。
13.如权利要求12所述的一种浓缩、分离、稳定液体酶的方法，其特征在于:所述的二元醇是乙二醇、1，2-丙二醇、1，3-丙二醇，1，2-丁二醇、1，3-丁二醇、1，4-丁二醇或1，5-戊二醇；所述的三元醇是丙三醇、1，2，4- 丁三醇或1，2，5-戊三醇。
14.如权利要求1所述的一种浓缩、分离、稳定液体酶的方法，其特征在于:所述的非离子型表面活性剂，是结构式为 PEOx — PPOy — PEOx, R — C6H4 — O — (CH2CH2O)n — H、R —CO — (OC2H4)n — OH、RO — (CH2CH2O)n — H 或 R-COO- (CH2CH2O)n-H,且其分子量 >10000，HLB值在5-60之间的非离子型表面活性剂。
15.如权利要求1所述的一种浓缩、分离、稳定液体酶的方法，其特征在于:所述的生物酶是蛋白酶、果胶酶、纤维素酶、脂肪酶、半纤维素酶、脂酶、诺维信酶和枯草杆菌酶中的任意一种或多种。
【文档编号】C12N9/96GK103740690SQ201410000994
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2014年1月2日 优先权日:2014年1月2日
【发明者】张剑, 王素文, 徐淑宜 申请人:山西大学, 山西勇宁记科技有限公司