专利名称：：一种饲用液体复合酶的制备方法
技术领域：
：本发明涉及一种饲用复合酶的制备方法，尤其提供了一种由固体发酵复合酶曲料制备饲料用液体复合酶的方法，属于生物
技术领域：
。
背景技术：
：家禽家畜等多是以粉料或颗粒的方式来喂养的。使用粉料时，酶可以加入预混料中，混合均匀，直接饲喂进去。若使用颗粒饲料喂养，颗粒词料在高温制粒时，会涉及到蛋白质的变性问题。酶是一种活性蛋白质，它与所有的蛋白质一样对环境很敏感，在高温时会变性失活。饲料在制粒后进入冷却系统前，饲料的温度较高，可达90'C，这样的高温会导致饲料自身的内源酶和外添加酶的活性受到不同程度的损失。加酶饲料制粒后酶活性的损失程度与不同酶的特性、酶制剂的剂型、制粒时的温度有关。由于酶在饲料制粒时，使用蒸汽调质，同时也承受压力，故用酶制剂做耐高温试验或用酶在高温溶液内做耐高温试验，虽然与制粒过程存在一定的相似和相关性但均不能说明制粒的结果。制粒酶活损失是一个颇有争议的问题，因为酶被高度稀释，到目前为止还没有能够精确测定加酶饲料中的酶活性的方法。Nunes(1993)报道，制粒温度高于60°C时显著降低戊聚糖酶(如木聚糖酶)的活性。Spring(1996)报道，真菌淀粉酶和戊聚糖酶在制粒温度达到80'C时无明显的活性损失。为了避免饲料制粒时酶活性的损失，可采用稳定化技术和制粒后喷涂酶技术。稳定化技术主要是采用物理包被、化学修饰的方式来提高酶的耐热性，这样可以在一定程度上有效减少制粒时酶活性的损失。采用这种技术会极大提高饲用酶的成本。制粒后喷涂液体酶，是在饲料制粒后再把酶制剂添加到其中的技术。其方法是使用液体酶通过喷雾系统，将酶均匀地涂布到尚保持余热的颗粒饲料表面，利用余热使水分蒸发。液体酶喷涂技术作为一项新型的词料加工后喷涂工艺，可以有效保护饲料中象酶这样的热敏性组分的有效性，达到加酶饲料的最佳效果，提高饲料品质。因此，液体酶喷涂技术具有很好的推广应用价值。目前国外许多大型饲料厂已广泛地采用这一工艺。液体酶喷涂技术作为饲料工业的一个新生事物，无疑给饲料工业开辟了一个新的广阔天地，必将在未来的饲料工业中发挥巨大作用。液体酶喷涂技术可使酶的作用充分表现出来，真正体现饲用酶的代粮节粮、提高词料利用率、降低料肉比、提高养殖品质、减少环境污染的应用效果，因此液体酶的上市必将推动我国饲料业上一个崭新台阶。由于液体酶能替代固体酶，预计随着这一行业的发展必将淘汰一大批技术力量低、规模小的固体饲料酶生产企业，国内饲用酶的整体水平也将逐步得以提高。目前饲用液体复合酶的制作大多都是通过液体发酵制得各种单一酶种的液体酶，然后再用各种单一的液体酶通过简单的物理混合复配而成，这种通过复配方式生产的液体酶，由于各种酶的生产工艺、条件、所用菌种等均有差异，复配后难免会因条件的不同而对其组分酶的活性产生影响。
发明内容本发明所要解决的技术问题是针对现有技术存在的不足，提供一种液体复合酶的制备方法，使复合酶中各组分酶之间相互补充、互为依存、无拮抗作用并且活性不受影响，同时降低液体复合酶的成本。本发明饲用液体复合酶的制备方法，其技术方案包括下列步骤A、将固体发酵曲料破碎，加入一定量的水进行拌和湿润；B、将湿润曲料进行压搾得到滤液和渣料，渣料干燥后即为固体饲料酶;C、加入助滤剂，将压搾滤液进行板框过滤；D、在所得滤清液中加入防腐剂、稳定剂，得到饲料用液体复合酶。上述饲用液体复合酶的制备方法，其步骤A所述曲料破碎是将曲料块破碎至5mm粒径以下；所述加入一定量的水是按照曲料水=1:1的重量比添加。上述词用液体复合酶的制备方法，其步骤c所述助滤剂选用硅藻土，所占重量比为5%。上述饲用液体复合酶的制备方法，其步骤D所述在滤清液中加入稳定剂、防腐剂按滤清液稳定剂防腐剂=80:19.9:0.1的重量比添加。上述饲用液体复合酶的制备方法，其步骤D所述防腐剂选用山梨酸钾；稳定剂选用甘油。本发明通过曲料破碎、湿润、榨取、过滤、防腐稳定等步骤制备饲料用液体复合酶。本发明充分利用了固体发酵曲料酶谱全、酶活高以及天然形成的复合酶各酶种之间相互补充、互为依存、无拮抗作用的特点，使得应用本发明所述方法制得的液体复合酶不但具备了上述固体发酵曲料所具有的优点，而且成本降低，可以方便的应用液体酶喷涂技术处理饲料，有效保护饲料中热敏性酶组分的有效性，达到加酶饲料的最佳效果，提高饲料品质o本发明未涉及专用设备，使用的设备均为本行业常用设备，包括破碎机、拌和机、搾汁机、干燥机、混液罐、板框和配方罐。本发明所涉及的检测方法，除已详细介绍的外，均为本行业常用方法。本发明所用材料的来源固体发酵曲料为本行业常用的一般曲料，其成分含有木聚糖酶、果胶酶、甘露聚糖酶、e—葡聚糖酶、纤维素酶及蛋白酶等。本发明所涉及的其他原料均为本行业惯常使用的原料，均为市售工业纯商品。具体实施例方式下面对本发明进一步详细说明。实施例1首先把固体发酵曲料破碎，将曲料块用破碎机破碎至5mm粒径以下，按照曲料水=1:1的重量比在曲料中加入水，进行拌和湿润；然后将湿润曲料用压榨机进行压榨得到滤液和渣料，渣料干燥后可以作为固体饲料酶使用。在压榨滤液中加入其5%重量的硅藻土助滤剂，用板框过滤机过滤后得到滤清液；按滤清液稳定剂防腐剂=80:19.9:0.1的比例在滤清液中加入甘油稳定剂、山梨酸钾防腐剂，搅拌均匀即可得到饲用液休复合酶。其酶组分包含木聚糖酶、果胶酶、甘露聚糖酶、P—葡聚糖酶、纤维素酶、蛋白酶等成分。经测定，本实施例中几种酶组分的活性为木聚糖酶200000U/ml，果胶酶20000U/ml，甘露聚糖酶1000U/ml，P—葡聚糖酶150000U/ml，纤维素酶3000U/ml，蛋白酶1000U/ml。实施例2工艺方法同实施例l，将313kg固体发酵曲料破碎，加入313kg水拌和，压榨后得滤液315kg，渣料308kg;过滤得滤清液311kg，加入保护剂78kg得到饲用液体复合酶389kg成品。其中，木聚糖酶241167u/ml，果胶酶80645u/ml。实施例3工艺方法同实施例1，将625kg固体发酵曲料破碎，加入625kg水拌和，压榨后得滤液630kg，渣料617kg;过滤得滤清液626kg，加入保护剂157kg得到饲用液体复合酶783kg成品。其中，木聚糖酶255633u/ml果胶酶81632u/ml。上述的酶活性检测方法为-A木聚糖酶酶活力测定方法Al酶活力定义l.Oml液体酶于温度40°C、pH值5.00的条件下，每分钟水解木聚糖生成相当于liig木糖还原物质，即为l个酶活力单位，以u/ml表示。A2试剂和溶液本方法中所用试剂，在没有注明其他要求时，均指分析纯试剂和符合GB/T6682中规定的三级水。A2.1pH5.00磷酸氢二钠一柠檬酸缓冲液A液(O.05M拧檬酸溶液)称取10.505g柠檬酸("线，)于1000ml容量瓶中，用蒸馏水溶解定容至1000ml。B液(O.1M磷酸氢二钠溶液)称取35.81g磷酸氢二钠(Na2HP04*12H20)于1000ml容量瓶中，用蒸馏水溶解定容至lOOOml。将A、B两液混合，用精密pH计测定其pH值，必要时用3M盐酸溶液或3M氢氧化钠溶液调节pH值为5.00。A2.2DNS试剂称取酒石酸钾钠182.Og，溶于500ml蒸馏水中，加热(不得超过50。C)，依次加入3,5-二硝基水杨酸6.3g，氢氧化钠21.0g(21.0gNaoH/300ml蒸馏水)，苯酚5.0g，无水亚硫酸钠5.0g，搅拌至溶液清澈透明。冷却后用蒸馏水定容至1000ml,储存于棕色瓶中，室温保存710天后使用。A2.3木聚糖溶液(10.00mg/ml)准确称量l.OOOg木聚糖(SIGMAX4252，山毛榉)，先用80ml缓冲液(A2.1)溶解，搅拌并加热直至完全溶解呈透明，冷却后移入100ml容量瓶，加20ml缓冲液(A2.1)，用蒸馏水定容至100ml。A2.4木糖标准液(lmg/ml)准确称量100mg木糖(含量9990(预先在105。C干燥至恒重)于100ml容量瓶中，用缓冲液(A2.1)溶解定容至100ml。A3仪器、设备分析天平、恒温水浴锅40士0.2-C、分光光度计、秒表。A4测定步骤A4.1木糖标准曲线的绘制分别精密量取lmg/ml木糖标准溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1,2ml依次加入七支25ml比色管中，以缓冲液(A2.1)补加到2.0ml，制备成浓度为01200ug/ml的标准液，再各加入DNS试剂1.5ml，在沸水中煮沸7min(样品放入重新沸腾时算起)，流水冷却。加蒸馏水21.5ml摇匀，于550rnn波长处进行比色测定。用试剂空白溶液为零点，测定吸光度值。以木糖浓度为横坐标，以吸光度值为纵坐标绘制标准曲线。每一次配置DNS试剂，都要重新绘制标准曲线。A4.2测定酶样品精密量取待测酶液l.Oml(用缓冲液A2.l稀释)于25ml比色管中(每个样品三个平行)，在40。C水浴中预热2min后加入1.0ml经预热的木聚糖溶液(A2.3)并混匀，4(TC水浴保温30min后立即加入1.5mlDNS试剂终止反应，迅速放置沸水浴中煮沸7min(样品放入重新沸腾时算起),流水冷却，加蒸馏水21.5ml，摇匀后于550nm波长处进行比色测定。酶空白于25ml比色管中加入l.Oml木聚糖溶液(A2.3)，40'C水浴保温30min后加入1.5mlDNS试剂和l.Oml酶液，摇匀，置沸水浴中煮沸7min(样品放入重新沸腾时算起)，流水冷却，加蒸馏水21.5ml，摇匀后于550nm波长处进行比色测定。A4.3计算酶活力X(u/ml)=^x^rZ—样品的酶活力，u/ml;F用回归方程计算出的木糖微克数；^一酶液的稀释倍数；7—反应时间30min。B果胶酶酶活力测定方法Bl定义1.0ml液体酶于温度4(TC、pH值5.00的条件下，lmin水解果胶生成相当于lug半乳糖醛酸还原物质，即为l个酶活力单位，以u/ml表示。B2试剂和溶液本方法中所用试剂，在没有注明其他要求时，均指分析纯试剂和符合GB/T6682中规定的三级水。B2.1pH5.00磷酸氢二钠一柠檬酸缓冲液A液(0.05M拧檬酸溶液)称取10.505g柠檬酸(CeH807，)于1000ml容量瓶中，用蒸馏水溶解定容至1000ml。B液(O.1M磷酸氢二钠溶液)称取35.81g磷酸氢二钠(Na2HP04*12H20)于1000ml容量瓶中，用蒸馏水溶解定容至1000ml。将A、B两液混合，用精密pH计测定其pH值，必要时用3M盐酸溶液或3M氢氧化钠溶液调节PH值为5.00。B2.2DNS试剂称取20.0g3，5-二硝基水杨酸溶解于约800ml蒸馏水中，不断搅拌下逐渐加入300ml氢氧化钠溶液(32.0gNaoH/300ml蒸馏水)，同时不断搅拌，水浴加热(溶液温度不要超过48'C)直到溶液清澈透明。在不断搅拌下逐渐加入600g酒石酸钾钠。如需要可加热(溶液温度不要超过48°C)直到溶液清澈透明。用蒸馏水定容至2000ml。置深色瓶中室温保存710天后使用，有效期为6个月。DNS试剂在使用前，每100mlDNS溶液中加入0.3ml葡萄糖溶液(l.5g无水葡萄糖用蒸馏水溶解、定容至100ml)。现用现配。B2.32%(w/v)果胶底物准确称2.OOOg果胶(SIGMAP9135Pectin,FromCitrusFruits)于100ml容量瓶中，用适量磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(B2.1)磁力搅拌直至完全溶解，用磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(B2.1)定容至100ml。B3仪器、设备分析天平、磁力搅拌器、恒温水浴锅40士0.2r、分光光度计、秒表。B4测定步骤B4.1标准曲线准确称取l.OOOOgD-半乳糖醛酸(C6H1007H20)于100ml容量瓶中，用蒸馏水溶解并定容至100ml，制备成浓度为10mg/ml标准贮备液。用蒸馏水稀释标准贮备液制备成浓度为08000ug/ml的标准液，按如下所示Ong/mlOml贮备液用蒸馏水定容至10ml;lOOOng/ml1ml贮备液用蒸馏水定容至10ml;3000ug/ml3ml贮备液用蒸馏水定容至10ml;5000ug/ml5ml贮备液用蒸馏水定容至10ml;8000Ug/ml8ml贮备液用蒸馏水定容至10ml;精密量取0.2ml标准液和2.0ml缓冲液于25ml比色管中，混匀。加3.0mlDNS试剂，混匀并放入强烈沸腾的水浴中煮沸整五分钟，迅速将比色管流水冷却终止显色反应，加10ml蒸馏水，混匀，用滤纸过滤，滤液供测定用。以试剂空白为对照于540mn测定其吸光度值。以半乳糖醛酸的浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。每次配制新的DNS试剂需做新的标准曲线。B4.2测定酶样品精密量取0.2ml酶液(用缓冲液B2.l稀释)于25ml比色管中。加入2.0ml经40。C水浴预热的果胶底物(B2.3)并混匀，40。C水浴保温30min。加入3.0mlDNS试剂，混匀并放入强烈沸腾的水浴中煮沸整5分钟。迅速将比色管流水冷却终止显色反应。加10ml蒸馏水，混匀，用滤纸过滤，滤液于540nm测定其吸光度值。酶空白2.0ml果胶底物40。C水浴保温30min后，加入3.0mlDNS试剂并混匀，再加入0.2ml酶液混匀并放入强烈沸腾的水浴中煮沸整五分钟。迅速将比色管流水冷却终止显色反应。加入10ml蒸馏水，混匀。用滤纸过滤，滤液于540nm测定其吸光度值。B5计算酶活力AXu/ml)r/一样品的酶活力，u/mlF用回归方程计算出的相当的半乳糖醛酸还原物的Pg数P酶液的稀释倍数T一反应时间30minC甘露聚糖酶酶活力测定方法Cl酶活力定义l.Oml液体酶于40°C，pH二5.0条件下，lmin水解角豆胶生成相当于lwg甘露糖还原物质，即为l个酶活力单位，以u/ml表示。C2试剂和溶液本方法中所用试剂，在没有注明其他要求时，均指分析纯试剂和符合GB/T6682中规定的三级水。C2.1pH5.00磷酸氢二钠一柠檬酸缓冲液A液(0.05M柠檬酸溶液)称取10.51g柠檬酸(C6H807'H20)于1000ml容量瓶中，用蒸馏水溶解定容至100—0ml。B液(O.1M磷酸氢二钠溶液)称取35.81g磷酸氢二钠(Na2HP0442H20)于1000ml容量瓶中，用蒸馏水溶解定容至lOOOml。将A、B两液混合，用精密pH计测定其pH值，必要时用3M盐酸溶液或3M氢氧化钠溶液调节pH值为5.00。C2.2底物0.59UW/V)角豆胶(SigmaG—0753)将l.Og角豆胶加入180mlpH5.0缓冲液，8(TC搅拌5分钟。用磁搅拌器加热至沸。在一冷室内用磁搅拌器冷却整夜。用缓冲液稀释至200ml。用离心法除去未溶解部分(9000rpm，15分钟)。将底物液分装并冰冻。冰冻的底物可用数月。使用前，熔化底物并在沸水浴中加热至8(TC，仔细搅拌。C2.3DNS试剂称取20.0g3，5-二硝基水杨酸悬浮于约800ml蒸馏水中，不断搅拌下逐渐加入300ml氢氧化钠溶液(32.OgNaoH/300ml蒸馏水)，同时不断搅拌，水浴加热(溶液温度不要超过48"C)直到溶液清澈透明。在不断搅拌下逐渐加入600g酒石酸钾钠。如需要可加热(溶液温度不要超过48°C)直到溶液清澈透明。用蒸馏水定容至2000ml。置深色瓶中室温存放710天后使用，如需要可用烧结玻璃过滤器过滤。有效期为6个月。DNS试剂在使用前，每100mlDNS溶液中加入0.3ml葡萄糖溶液(1.5g无水葡萄糖用蒸馏水溶解、定容至100ml)。现用现配。C3仪器、设备分析天平、变温电炉、恒温水浴锅、分光光度计、秒表。C4分析步骤C4.1甘露糖标准曲线的绘制5.OOg甘露糖(SigmaM2069)定容于100ml去离子水中制成储备液。从储备液制成5.0，4.0，2.0，1.0，0.5，0.25和Omg/ml稀释液。取0.2ml稀释液和2.0ml缓冲液加入比色管中，再各加入DNS试剂3ml，在沸水中煮沸5min，流水冷却，力口10ml蒸馏水，混匀。在540nm处进行比色测定，用空白管溶液调零点，记录吸光度值。以甘露糖浓度(^g/ml)为横坐标，以吸光度值为纵坐标绘制曲线。每一次配置DNS试剂，都要重新绘制标准曲线。C4.2待测酶液的制备精密量取待测酶液l.OOml入容量瓶中，用缓冲液定容至刻度，摇匀。根据酶活力再次用缓冲液稀释至适当浓度，供测试用。(稀释至被测试液吸光值在0.20.4范围内)。C4.3测定吸取0.2ml酶液于试管中，放入40'C恒温水浴锅内，加入2.0ml甘露聚糖底物(经40。C预热)，搅拌并保温30分钟。加入3mlDNS，搅拌。煮沸反应混合体5分钟。流水冷却，加10ml蒸馏水，混匀，测540nm吸光度。酶空白则为酶液加入DNS后，混匀，再加底物混匀，4(TC保温30分钟。C5计算X=(WXN)+(TXM)式中X—样品的酶活力(u/ml)W—用回归方程计算出相当的甘露糖还原物Pg数W=(A-b)+KN—酶液的稀释倍数T一反应时间30min,以lmin计M—样品量(ml)所得结果表示至整数。D纤维素酶酶活力测定方法Dl酶活力定义1.0ml液体酶于40°C，pH=4.8条件下，lmin水解CMC生成相当于1ug葡萄糖还原物质，即为l个酶活力单位，以u/ml表示。D2试剂和溶液本方法中所用试剂，在没有注明其他要求时，均指分析纯试剂和符合GB/T6682中规定的三级水。D2.1pH4.8磷酸氢二钠一柠檬酸缓冲液称取磷酸氢二钠(Na2HP042H20)17.56g,柠檬酸(C6H807H20)10.65g，分别用蒸馏水溶解后混合均匀定容至lOOOml。用精密pH计测定其pH值，必要时用3M盐酸溶液或3M氢氧化钠溶液调节pH值为4.8。D2.2DNS试剂称取酒石酸钾钠182.0g，溶于500ml蒸馏水中，加热(不得超过50°C)，依次加入3，5-二硝基水杨酸6.3g，氢氧化钠21.0g(21.0gNaoH/300ml蒸馏水)，苯酚5.0g，无水亚硫酸钠5.0g，搅拌至溶液清澈透明。冷却后用蒸馏水定容至lOOOml，储存于棕色瓶中，室温保存710天后使用。如需要可用烧结玻璃过滤器过滤。D2.310.OOmg/mlCMC溶液准确称量l.OOOg羟甲基纤维素钠(CMC—Na)(中国医药公司上海化学试剂公司出品，规格300800厘泊)用适量的缓冲液溶解，移入100ml容量瓶，用上述缓冲液定容至100ml。此溶液在冰箱内贮存，有效期为一周。D2.4lmg/ml葡萄糖标准液准确称量100mg葡萄糖(预先在105"C干燥至恒重)用少量蒸馏水溶解，定容至100ml。D3分析步骤D3.1葡萄糖标准曲线的绘制分别取lmg/ml葡萄糖标准溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2依次加入七支25ml比色管中，以蒸馏水补加到2.0ml，再各加入DNS试剂1.5ml，在沸水中煮沸7min，流水冷却。加蒸馏水21.5ml摇匀，在550nm处进行比色测定，用空白管溶液调零点，记录吸光度值。以葡萄糖浓度(W/ml)为横坐标，以吸光度值为纵坐标绘制曲线。每一次配置DNS试剂，都要重新绘制标准曲线。D3.2待测酶液的制备精密量取待测酶液1.00ml入容量瓶中，用缓冲液定容至刻度，摇匀。根据酶活力再次用缓冲液稀释至适当浓度，供测试用。(稀释至被测试液吸光值在0.240.28范围内)。D4测定于25ml比色管中加入lml适当稀释的酶液(每个样品三个平行)在4CTC水浴锅中预热2min后加入L00ml经预热的CMC溶液，计时，4(TC水浴保温30min后立即加入1.5mlDNS试剂终止反应，再置沸水中煮沸7min(样品放入重新沸腾时算起)，流水冷却，加蒸馏水21.5ml摇匀。同时进行空白对照测定，于25ml比色管中加入lml酶液，1.5mlDNS试剂，摇匀，在40'C水浴锅中预热2min后加入1.00ml经预热的CMC溶液，计时，40'C30min后立即置沸水中煮沸7min，流水冷却，加蒸馏水21.5ml摇匀。按照作标准曲线时同样的操作测定吸光度值，用回归方程计算出相应的葡萄糖D5计算X=(WXN)+(TXM)式中X—样品的酶活力(u/ml)W—用回归方程计算出相当的葡萄糖还原物Pg数W=(A-b)+KN—酶液的稀释倍数T一反应时间30min，以lmin计M—样品量(ml)所得结果表示至整数。—葡聚糖酶酶活力测定方法El酶活力定义1.0ml液体酶于40°C，pH二5.0条件下，lmin水解P—葡聚糖生成相当于lwg葡萄糖还原物质，即为l个酶活力单位，以u/ml表示。E2试剂和溶液本方法中所用试剂，在没有注明其他要求时，均指分析纯试剂和符合GB/T6682中规定的三级水。E2.1pH5.00磷酸氢二钠一柠檬酸缓冲液A液(0.05M柠檬酸溶液)称取10.51g柠檬酸(Ce线*H20)于1000ml容量瓶中，用蒸馏水溶解定容至lOOOml。B液(O.1M磷酸氢二钠溶液)称取35.81g磷酸氢二钠(Na2HP04'12H20)于1000ml容量瓶中，用蒸馏水溶解定容至lOOOml。将A、B两液混合，用精密pH计测定其pH值，必要时用3M盐酸溶液或3M氢氧化钠溶液调节pH值为5.00。E2.2DNS试剂称取酒石酸钾钠182.Og，溶于500ml蒸馏水中，加热(不得超过50°C)，依次加入3，5-二硝基水杨酸6.3g，氢氧化钠21.0g(21.0gNaoH/300ml蒸馏水)，苯酚5.0g，无水亚硫酸钠5.0g，搅拌至溶液清澈透明。冷却后用蒸馏水定容至1000ml，储存于棕色瓶中，室温保存710天后使用。如需要可用烧结玻璃过滤器过滤。E2.310.00mg/ml0—葡聚糖溶液准确称量l.OOOOgP—葡聚糖(SigraaG6513)，用适量的缓冲液溶解，移入100ml容量瓶，用上述缓冲液定容至100ml。此溶液在冰箱内贮存，有效期为一周。E2.4lmg/ml葡萄糖标准液准确称量100mg葡萄糖(预先在105'C干燥至恒重)用少量蒸馏水溶解，定容至100ml。E3仪器、设备分析天平、变温电炉、恒温水浴锅、分光光度计、秒表E4分析步骤E4.1葡萄糖标准曲线的绘制分别取lmg/ml葡萄糖标准溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2依次加入七支25ml比色管中，以蒸馏水补加到2.0ml，再各加入DNS试剂1.5ml，在沸水中煮沸7min,流水冷却。加蒸馏水21,5ml摇匀，在550nm处进行比色测定，用空白管溶液调零点，记录吸光度值。以葡萄糖浓度(^g/ml)为横坐标，以吸光度值为纵坐标绘制曲线。每一次配置DNS试剂，都要重新绘制标准曲线。E4.2待测酶液的制备精密量取待测酶液1.00ml入容量瓶中，用缓冲液定容至刻度，摇匀。根据酶活力再次用缓冲液稀释至适当浓度，供测试用。(稀释至被测试液吸光值在0.20.4范围内)。E4.3测定于25ml比色管中加入lml适当稀释的酶液(每个样品三个平行)在4(TC水浴锅中预热2min后加入1.OOml经预热的3—葡聚糖溶液，计时，4(TC水浴保温30inin后立即加入1.5mlDNS试剂终止反应，再置沸水中煮沸7min(样品放入重新沸腾时算起)，流水冷却，加蒸馏水21.5ml摇匀。同时进行空白对照测定，于25ml比色管中加入lml酶液，1.5mlDNS试剂，摇匀，在4(TC水浴锅中预热2min后加入1.OOml经预热的3—葡聚糖溶液，计时，4(TC30min后立即置沸水中煮沸7min，流水冷却，加蒸馏水21.5ml摇匀。按照作标准曲线时同样的操作测定吸光度值，用回归方程计算出相应的葡萄糖含量。E5计算X=(WXN)+(TXM)式中X—样品的酶活力(u/ml)W—用回归方程计算出相当的葡萄糖还原物^数W=(A-b)+KN—酶液的稀释倍数T—反应时间30min，以lmin计M—样品量(ml)所得结果表示至整数。F蛋白酶酶活力测定方法Fl定义lml液体酶在一定温度和pH值条件下，lmin水解酪素产生1yg酪氨酸为一个酶活力单位，以u/ml表示。F2福林法F2.1原理蛋白酶在一定温度与pH条件下，水解酪素底物，产生含有酚基的氨基酸(如酪氨酸、色氨酸等)，在碱性条件，将福林试剂(Folin)还原，生成钼蓝与钨蓝，用分光光度法测定，计算其酶活力。F2.2试剂和溶液F2.2.1福林试剂的制备于2000ml磨口回流装置中加入钨酸钠(Na2W042H20)100g、钼酸钠(Na2Mo042H20)25g、水700ml、85%磷酸50ml、浓盐酸100ml,小火沸腾回流10h，取下回流冷却器，在通风橱中加入硫酸锂(Li2S04)50g、水50ml和数滴浓溴水(99%)，再微沸15min，以除去多余的溴(冷后仍有绿色，需再加溴水，再煮沸除去过量的溴)，冷却，加水定容至lOOOml。混匀，过滤。制得的试剂应呈金黄色，贮存于棕色瓶内。使用溶液一份福林试剂与二份水混合，摇匀。F2.2.2碳酸钠溶液c(Na2C03)=0.4mol/L称取无水碳酸钠(Na2C03)42.4g，用水溶解并定容1000ml。F2.2.3三氯乙酸c(CC13C00H)=0.4mol/L称取三氯乙酸65.4g用水溶解并定容1000ml。F2.2.4氢氧化钠溶液c(Na0H)=0.5mol/L按GB601配制。F2.2.5盐酸溶液c(HC1)二lmol/L按GB601配制。F2.2.6乳酸缓冲液(pH=3.0)甲液称取乳酸(80%90%)10.6g，加水溶解并定容至1000ml。乙液称取乳酸钠(70%)16g，加水溶解并定容至1000ml。使用液取甲液8ml，加乙液lml，混匀，稀释一倍，即成0.05mol/L乳酸缓冲液。F2.2.710g/L酪素溶液称取酪素1.000g，精确至0.001g，用乳酸23滴湿润后，加入适量的pH缓冲液约80ml，在沸水浴中边加热边搅拌，直至完全溶解，冷却后，转入100ml容量瓶中，用pH缓冲液稀释至刻度。此溶液在冰箱内贮存，有效期为三天。注酪素采用上海化学试剂采购供应站经销的试剂。2.2.8100叫/mLL-酪氨酸标准溶液a.称取预先于105'C干燥至恒重的L-酪氨酸0.1000g，精确至0.0002g,用lmol/L盐酸60ml溶解后定容至100ml，即为lmg/ml酪氨酸标准溶液。注L-酪氨酸采用上海长江生化制药厂产品。b.吸取lmg/ml酪氨酸标准溶液10.00ml,用0.lmol/L盐酸定容至100ml,即得到100pg/mLL-酪氨酸标准溶液。2.3仪器和设备2.3.1恒温水浴40±0.2°C。2.3.2分光光度计应符合GB9721的规定。2.4分析步骤2.4.1标准曲线的绘制a.L-酪氨酸标准溶液按表1配制表1<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>b.分别取上述溶液各l.OOml(须做平行试验)，各加0.4mol/L碳酸钠溶液5.00ml、福林试剂使用液l.OOml,置于40±0.2。C水浴中显色20min，取出，用分光光度计于波长680nm，10mm比色皿，以不含酪氨酸的O管为空白，分别测定其吸光度。以吸光度^为纵坐标，酪氨酸的浓度f为横坐标，绘制标准曲线(此线应通过零点)。根据作图或用回归方程，计算出当吸光度为1时的酪氨酸的量()ng)，即为吸光常数K值。其K值应在95100范围内。2.4.2测定(1)待测酶液的制备a.吸取液体酶l.OOml入容量瓶中，用缓冲液定容至刻度，摇匀。根据酶活力再次用缓冲液稀释至适当浓度，供测试用(稀释至被测试液吸光值在0.250.40范围内)。b.酶测定时，稀释倍数参考表2(液体酶也可参照表2稀释)。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>8、10万100002g—500ml(250倍)5ml—200ml(40倍)(2)测定a.先将酪素溶液放入40士0.2。C恒温水浴中，预热5min;b.按下列程序操作试管A(空白)试管B(酶试样，需作三个平行试样)加酶液l.OOmlI40±0.2。C，2min加三氯乙酸2.00ml(摇匀)I40±0.2°C，10min加酪素l.OOml(摇匀)取出静止10min，过滤取l.OOml滤液加碳酸钠溶液5.0ml加福林试剂使用液l.OOmlI40±0.2°C显色20min20min于680nm波长，用10mm比色皿测其吸光度加酶液l.OOml440±0.2°C，2min加酪素l.OOml(摇匀)440±0.2°C，lOmin加三氯乙酸2.00ml(摇匀)取出静止10min，过滤取l.OOml滤液加碳酸钠溶液5.0ml加福林试剂使用液l.OOml440±0.2°C显色于680nm波长，用lOrnrn比色皿测其吸光度2.5计算X=AXKX4/10Xn=2/5XAXKXn式中X——样品的酶活力(u/ml)A—一样品平行试验的平均吸光度K一一吸光常数4——反应试剂的总体积(ml)10--反应时间10min，以lmin计n—一稀释倍数。所得结果表示至整数。2.6结果的允许误差平行试验相对误差不得超过3%。权利要求1、一种饲用液体复合酶的制备方法，其包括下列步骤A、将固体发酵曲料破碎，加入一定量的水进行拌和湿润；B、将湿润曲料进行压榨得到滤液和渣料，渣料干燥后即为固体饲料酶；C、加入助滤剂，将压榨滤液进行板框过滤；D、在所得滤清液中加入防腐剂、稳定剂，得到饲料用液体复合酶。2、根据权利要求1所述液体复合酶的制备方法，其步骤A所述曲料破碎足将曲料块破碎至5mm粒径以下；所述加入一定量的水是按照曲料水=1:1的重量比添加。3、根据权利要求2所述液体复合酶的制备方法，其步骤C所述助滤剂选用硅藻土，所占重量比为5%。4、根据权利要求3所述液体复合酶的制备方法，其步骤D所述在滤清液中加入稳定剂、防腐剂，按滤清液稳定剂防腐剂=80:19.9:0.1的重量比添加。5、根据权利要求4所述液体复合酶的制备方法，其特征在于防腐剂选用山梨酸钾；稳定剂选用甘油。全文摘要本发明公开了一种液体复合酶的制备方法，其包括选取菌种，对物料进行固体发酵；将固体发酵曲料破碎，加入一定量的水进行拌和湿润；然后进行压榨得到滤液和渣料，渣料干燥后得到固体饲料酶；将压榨滤液进行过滤，在滤清液中加入防腐稳定剂，得到饲料用液体复合酶。应用本发明的液体复合酶的制备方法，使制得的液体复合酶中各组分酶之间相互补充、互为依存、无拮抗作用并且活性不受影响，而且可以降低液体复合酶的成本。文档编号A23K1/165GK101352203SQ200810138338公开日2009年1月28日申请日期2008年7月11日优先权日2008年7月11日发明者范志恒,刚陈,黄炳亮申请人:青岛康地恩生物科技有限公司